Sewaktu Tahu

Setidaknya kita akan tahu itu

Metode-metode Bioteknologi Modern

Selain mendasarkan pada mikrobiologi dan biokimia, bioteknologi modern mendasarkan pula pada
manipulasi atau rekayasa genetika (DNA). Ciri atau sifat bioteknologi modern, antara lain: steril,
produksi dalam jumlah lebih banyak, kualitasnya standar, dan terjamin. Berbeda dengan bioteknologi
konvensional, bioteknologi modern sudah memanfaatkan metode-metode mutakhir bioteknologi
(currents methods of biotechnology), antara lain:

1. Kultur Jaringan

Kultur jaringan merupakan suatu teknik atau metode untuk mengisolasi bagian-bagian tanaman (sel,
jaringan, atau organ seperti akar, batang, daun, dan pucuk) kemudian menumbuhkan bagian tersebut
secara aseptis (teknik untuk mendapatkan kondisi suci hama) di dalam atau di atas medium budidaya
(in vitro). Dengan demikian, bagian-bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri dan
dapat menjadi tanaman lengkap kembali.

Isolasi atau pemisahan bagian tanaman dapat dilakukan secara mekanis maupun kimiawi (enzimatis).
Kultur jaringan pada tanaman dapat dilakukan karena setiap tanaman mempunyai sifat
totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan sel tanaman untuk menjadi tanaman baru yang lengkap,
jika ditumbuhkan dalam medium atau lingkungan yang sesuai.

Teknik kultur jaringan memerlukan syarat mutlak, yaitu keadaan steril pada alat, bahan, lingkungan
(ruang kerja), maupun seluruh rangkaian kerjanya. Secara umum, rangkaian kerja teknik kultur ja
ringan meliputi:

a. Persiapan

Tahap awal dalam kultur jaringan adalah menyiapkan eksplan, yaitu bagian dari tanaman (sel,
jaringan, atau organ) yang digunakan sebagai bahan untuk memulai suatu kultur. Proses yang
diperlukan untuk menghasilkan keadaan steril (bebas hama) atau terhindar dari mikroorganisme yang
tidak diinginkan disebut sterilisasi. Sterilisasi alat dan bahan dapat dilakukan dengan
menggunakan alat yang disebut autoklaf. Alat-alat dan bahan yang diperlukan dalam kultur jaringan
tumbuhan antara lain: botol kultur, pinset, scalpel (pisau kultur), cawan petri, erlenmeyer, pipet,
akuades, dan medium kultur buatan. Seluruh alat dan bahan tersebut harus dalam keadaan steril
sebelum dipakai.

Tabel 7.1. Beberapa Medium yang Sering Digunakan dalam Kultur Jaringan

No. Nama Medium dan Penemunya Keterangan

1. MS (Murashige dan Skoog) atau LS Untuk kultur kalus pada berbagai tanaman, banyak
(Linsmaier dan Skoog) mengandung garam-garam mineral dan senyawa
nitrogen (amonium dan nitrat).

2. BS (Gamborg) Untuk kultur suspensi sel tanaman Leguminosae

(terung-terungan).

3. Nitsch dan Nitsch Untuk kultur mikrospora dan kultur sel pada tembakau.

4. WPM (Lloyd dan Mc Cown) Untuk kultur jaringan tanaman berkayu.

5. VW (Vancin dan Went) dan Knudson C. Untuk tanaman anggrek.

6. Kao dan Michayluk Untuk kultur protoplas pada Cruciferae, Gramineae,

dan Leguminosae.

7. N6 (Chu) Untuk serealia (padi)

8. White (W63) Untuk kultur akar yang mengandung garam-garam

mineral dalam konsentrasi yang rendah.

Sumber: Indrianto, Teknik Kultur Jaringan, hlm. 33

Secara umum, medium yang digunakan dalam kultur jaringan harus mengandung garam-garam
anorganik (unsur makro dan mikro), zat-zat organik (zat pengatur tumbuh), substansi organik yang
kompleks (air kelapa dan ekstrak buah-buahan), bahan pemadat medium (agar-agar), pH tertentu,
dan bahan tambahan (arang aktif ). Beberapa kelompok zat pengatur tumbuh yang digunakan
dalam kultur jaringan antara lain: auksin (IAA, 2,4 D, dan NAA), sitokinin (adenin, kinetin, zeatin, dan
BAP), giberelin, asam absisat, dan etilen.

Zat pengatur tumbuh (ZPT) merupakan faktor yang mendukung proses pertumbuhan pada kultur
jaringan tumbuhan. Hormon auksin memacu pembelahan sel, sehingga membentuk gumpalan atau
massa sel yang belum terdiferensiasi, disebut kalus. Sel-sel kalus ini dapat berkembang menjadi
tanaman baru.
b) Inokulasi

Inokulasi merupakan tahapan penanaman eksplan yang sudah steril ke dalam atau di atas medium
buatan pada botol kultur. Teknik yang dilakukan untuk mendapatkan eksplan yang steril disebut
teknik aseptis, dengan mengambil atau mengiris bagian tanaman. Entkas dan LAF (Laminar Air Flow)
merupakan peralatan utama untuk melakukan kerja secara aseptis.

c) Pemeliharaan

Tahapan setelah inokulasi adalah meletakkan atau menyimpan botol-botol kultur secara rapi dan
teratur pada ruang pemeliharaan (ruang inkubator), yaitu di rak-rak pemeliharaan. Selama
pemeliharaan, kultur diamati secara rutin untuk mengetahui pertumbuhan dan
perkembangan eksplan. Ruang inkubator harus dalam keadaan bersih dan dilengkapi dengan
pengatur suhu ruangan serta sumber cahaya (lampu), sehingga mendukung pertumbuhan dan
perkembanagan eksplan.

d) Aklimatisasi

Tahapan setelah memelihara kultur yaitu menyesuaikan tanaman agar mampu beradaptasi dengan
lingkungan yang baru. Proses ini disebut aklimatisasi. Perlakuan sebelum memindahkan atau
menumbuhkan tanaman hasil kultur jaringan pada lingkungan luar (lapangan), yaitu menumbuhkan
kultur dalam suatu ruangan khusus (green hause), dengan mengatur faktor kelembaban, cahaya, dan
suhu.

Gambar 1. Tahapan pembentukan tanaman baru (pada wortel)

Keterangan:

(a) wortel
(b) potongan wortel bentuk bulat (+ 1 cm)

(c) dibuang bagian tepi sehingga berbentuk kubus

(d) dimasukkan ke dalam medium (mengandung zat pengatur tumbuh)

(e) tumbuh kalus

(f - i) tahapan perkembangan sampai terbentuk tanaman kecil

(j) tanaman wortel dewasa

Ada beberapa manfaat dan keuntungan kultur jaringan tanaman, antara lain: menghasilkan tanaman
atau individu baru dalam jumlah besar dan cepat (waktu relatif singkat); menghasilkan tanaman bebas
virus, menghasilkan tanaman yang persis dengan induknya, sehingga dapat melestarikan sifat
tanaman induk; menghasilkan hibrid baru melalui persilangan somatis (melalui fusi atau
penggabungan protoplas); menghasilkan tanaman haploid (melalui kultur mikrospora), sehingga
untuk pemuliaan tanaman; untuk menyimpan plasma nutfah; untuk menyelamatkan embrio; hanya
memerlukan tempat yang relatif sempit; serta semua bagian tanaman dapat digunakan.

2. Rekayasa Genetika

Tahun 1973 merupakan sejarah yang mengawali penelitian sebelum berkembangnya rekayasa
genetika, yaitu pencangkokan gen mamalia ke dalam sel bakteri, sehingga menimbulkan fenotip
maupun genotip yang baru. Teknik rekayasa genetika dapat dilakukan melalui:

a) Teknologi DNA Rekombinan (Recombinant DNA Technology)

Teknologi DNA rekombinan atau disebut juga Rekayasa Genetika adalah suatu metode biokimiawi
atau manipulasi gen, dengan cara menyisipkan (insert) atau menggabungkan gen yang dikehendaki ke
dalam suatu organisme. Hasil penggabungan DNA dari individu yang tidak sama ini disebut DNA
rekombinan. Sementara itu, gen dari satu individu yang disisipkan atau digabungkan pada gen
individu yang lain disebut transgen, individunya disebut transgenik (misalnya: tanaman transgenik).

Teknologi DNA rekombinan memerlukan suatu perantara atau vektor berupa plasmid bakteri (DNA
berbentuk lingkaran yang terdapat di luar kromosom), sehingga merupakan bentuk teknologi
plasmid. Adapun syarat-syarat vektor yang baik antara lain: mempunyai kemampuan untuk
bereplikasi sendiri dan melakukan transkripsi; mampu memasuki sel; mampu menjadi bagian genom
sel; serta mempunyai ciri khusus, sehingga sel yang ditransformasi dapat dikenali oleh sel yang tidak
ditransformasi. Segmen DNA atau gen yang disisipkan akan berkembang di dalam sel individu
penerima (inang atau host) dan tidak akan mengalami perubahan fungsi atau tetap
berfungsi, sebagaimana pada sel yang diambil gennya.

Salah satu contoh rekayasa genetika yang sudah berhasil adalah penyisipan atau pemindahan gen
manusia sebagai penghasil insulin, ke dalam plasmid bakteri Escherichia coli.

Gambar 2. Rekayasa genetika untuk menghasilkan insulin.

b) Transplantasi Nukleus

Dua ahli mikrobiologi (Robert Briggs dan Thomas King) adalah orang yang pertama kali melakukan
percobaan transplantasi nukleus pada tahun 1950-an. Kemudian, John Gurdon melanjutkan
penelitian tersebut. Mereka menghancurkan nukleus dari sel telur katak menggunakan radiasi sinar
ultra violet dan menggantinya dengan nukleus dari sel usus embrio katak (berudu) yang sedang
berkembang. Nukleus dari sel usus tersebut diambil dengan mikropipet. Bila nukleus berasal dari sel
usus embrio muda yang belum terdiferensiasi, maka sel telur penerima (resipien) dapat berkembang
menjadi berudu. Perkembangan ini tidak terjadi, jika nukleus diambil dari sel usus berudu yang
telah terdiferensiasi. Transplantasi atau pemindahan nukleus dari satu sel ke sel yang lain dapat
menghasilkan individu yang baru.

Gambar 3. Transplantasi nukleus pada katak

c) Kloning
Selain transplantasi gen, pembentukan individu baru dapat dilakukan dengan teknik yang disebut
kloning. Kloning adalah suatu metode untuk menghasilkan keturunan atau individu yang identik
secara genetik dengan induknya. Pada tahun 1997, para peneliti dari Scotlandia (Ian Wilmut
dan rekan-rekannya) berhasil menghasilkan seekor domba yang kemudian diberi nama Dolly. Pada
penelitiannya, mereka mengambil sel telur dari satu domba dan menghilangkan nukleusnya.
Selanjutnya, sel telur tanpa nukleus tersebut digabungkan dengan sel kelenjar susu (am bing) dari
domba lainnya menggunakan aliran arus listrik. Setelah 6 hari ditumbuhkan dalam kultur, terbentuk
embrio dan ditanam di dalam uterus domba lainnya (domba ke-3 yang mirip dengan pendonor
sel telur). Akhirnya, domba tersebut melahirkan anak yang identik dengan domba pendonor sel
ambing. Para ahli dapat saja menerapkan kloning pada manusia, sehingga dihasilkan klon dari manusia
itu sendiri (pria maupun wanita) yang mempunyai sifat identik.

Gambar 4. Kloning menghasilkan domba Dolly

d) Teknologi Hibridoma

Teknologi hibridoma adalah suatu metode penggabungan (fusi) dua macam sel dari organisme yang
sama atau berbeda untuk mendapatkan sel hibrid (hibridoma) yang mempunyai kombinasi kedua sifat
tersebut. Proses penggabungan sel menggunakan tenaga listrik, sehingga prosesnya disebut
elektrofusi. Teknologi hibridoma menghasilkan antibodi minoklonal, yaitu antibodi murni yang tidak
tercemar oleh kuman atau protein lain. Teknik ini dikembangkan oleh Kohler dan Mistein, dengan
menyuntikkan antigen ke dalam tubuh tikus atau kelinci. Selanjutnya, tikus atau kelinci tersebut
membentuk antibodi. Sel pembentuk antibodi

dari limpa tikus atau kelinci dipisahkan dan diambil, kemudian meleburkan atau menggabungkan sel
tersebut dengan sel kanker. Penggabungan kedua sel tersebut membentuk sel hibridoma. Sel
penghasil antibodi hasil kultur sel hibridoma dipisahkan kemudian dikultur. Dengan demikian
dihasilkan beberapa antibodi monoklonal dari beberapa kultur sel.
Pada Bidang Pengobatan dan Kesehatan
Penelitian dalam bioteknologi terus dilanjutkan untuk mencari cara pencegahan, diagnosa dan
pengobatan pada berbagai kelainan dan penyakit. Terdapat beberapa hasil bioteknologi modern
pada bidang pengobatan dan kesehatan, di antaranya hormon dan antibodi monoklonal.

1.) Hormon

Pada 1949, penderita arthritis dapat sembuh setelah diobati dengan hormon steroid kortison. Sejak
saat itu, jenis steroid ini digunakan untuk mengobati penyakit arthritis, rheumatik, leukemia, anemia
hemafotik dan beberapa penyakit lain.

Steroid merupakan senyawa kimia yang sangat kompleks. Pembuatannya secara sintetis
memerlukan proses dan biaya yang cukup tinggi. Pada 1952, ditemukan sejenis kapang, yaitu hi opus
arrhi us yang dapat mengubah steroid yang berasal dari hewan atau tumbuhan menjadi kortison.
Jenis-jenis dari Aspergillus, ternyata dapat mengubah progesteron (steroid yang berasal dari hewan
dan manusia) menjadi senyawa kortison. Penyakit kencing manis (diabetes mellitus) dapat diobati
dengan hormon insulin. Insulin hasil bioteknologi saat ini sudah dapat diproduksi. Gen manusia yang
mengendalikan pembentukan hormon insulin, disisipkan ke dalam bakteri E-coli.

2.) Antibodi Monoklonal

Setiap saat tubuh kita dapat terkena serangan virus, bakteri, jamur, dan zat-zat lain dari lingkungan
sekitarnya. Zat-zat tersebut dapat membahayakan tubuh. Secara alami, manusia dapat menghasilkan
antibodi bagi kuman atau antigen tersebut. Namun, agar sistem kekebalan tubuh aktif, tubuh harus
pernah diserang kuman tersebut. Terkadang jika tubuh tidak mampu bertahan, akibatnya akan fatal.

Untuk memicu kekebalan tubuh, dapat dilakukan dengan menyuntikkan vaksin yang mengandung
antigen penyakit tersebut. Dengan demikian, dapat terbentuk antibodi pada tubuh yang dapat
melawan patogen. Oleh karena kemampuan melawan patogen ini, antibodi monoklonal
dikembangkan untuk mengatasi penyakit spesifik.

Cara yang umum digunakan untuk menghasilkan antibodi adalah dengan menyuntikkan sedikit
antigen pada tikus atau kelinci. Tubuh kelinci atau tikus akan merespon antigen dengan
menghasilkan antibodi yang secara langsung dapat diambil dari darahnya. Akan tetapi, biasanya
antigen direspon oleh beberapa macam sel. Antibodi yang dihasilkan adalah antibodi poliklonal,
yaitu campuran berbagai antibodi yang dihasilkan oleh berbagai sel.
Sekitar 1970, sebuah teknik dikembangkan untuk menghasilkan antibodi monoklonal. Antibodi yang
dihasilkan dari satu sel yang sama dan spesifik terhadap satu antigen. Antibodi monoklonal ini
didapat dari kultur sel. Pembuatan antibodi monoklonal adalah melalui fusi sel antara sel B dari hati
dan sel penghasil tumor. Sel B hati digunakan karena sel inilah yang menghasilkan antibodi. Adapun
sel tumor digunakan karena dapat membelah diri terus-menerus. Perhatikan Gambar berikut.

Pembuatan antibodi monoklonal

Langkah pertama untuk membuat antibodi monoklonal adalah hewan disuntikkan antigen sel B
tersebut. Kemudian, sel B hewan diisolasi dan difusikan dengan sel tumor. Hasilnya adalah sel hibrid
yang menghasilkan satu antibodi tertentu dan terus membelah. Antibodi monoklonal juga dapat
digunakan untuk keperluan diagnosa dan diharapkan dapat menyembuhkan kanker.

Pada Bidang Makanan

Penerapan bioteknologi pada makanan secara modern, diawali pada 1992. Saat itu sebuah
perusahaan Amerika, Calgene, mendapatkan izin untuk memasarkan OHMG yang disebut Flavrsavr.
OHMG ini adalah tomat yang dibuat lebih tahan hama dan tidak dapat membusuk.

Secara umum, penerapan bioteknologi modern pada makanan tidak dapat dipisahkan dengan
bioteknologi modern pada bidang pertanian. Produkproduk makanan yang dihasilkan dari OHMG,
seperti tanaman pertanian, hewan, atau mikroorganisme, disebut makanan hasil modifikasi genetik.
OHMG lebih banyak dilakukan pada tanaman pertanian. Contohnya, jagung tahan lama, kedelai
tahan herbisida, kentang tahan virus, padi dengan zat dan vitamin yang ditingkatkan (golden rice),
gandum dengan protein yang tinggi bagi ternak, dan banyak hasil pertanian lainnya. Perkembangan
selanjutnya dari penerapan bioteknologi modern semakin beraneka ragam. Sekarang, para ilmuwan
dapat membuat makanan yang mengandung obat, pisang yang menghasilkan vaksin hepatitis B, ikan
yang lebih cepat dewasa, dan tanaman buah yang berbuah lebih cepat.

Pada Bidang Pertanian

Pada bidang pertanian, telah banyak dilakukan penerapan bioteknologi modern. Para ilmuwan telah
berhasil membuat prosedur penyisipan gen pada berbagai tanaman. Prosedur tersebut melibatkan
teknik kultur jaringan dan teknik genetika pada bakteri yang telah Anda pelajari.

Penyisipan gen ke dalam tumbuhan dapat dilakukan melaui beberapa cara. Salah satunya, sumber
DNA gen asing terlebih dahulu dimasukkan ke dalam plasmid bakteri Agrobacterium tumefaciens.
Bakteri Agrobacterium rekombinasi tersebut diinfeksikan pada jaringan tumbuhan. Bakteri yang
digunakan Agrobacterium tumefaciens sebab di alam bakteri ini menginfeksi tanaman dan
menyebabkan penyakit cro n gall (sejenis tumor).

Dengan dimasukkannya gen asing ke dalam plasmid bakteri, gen asing akan memasuki DNA
tumbuhan. Dengan demikian, tumbuhan akan memiliki sifat yang sesuai dengan gen asing tersebut.
Tumbuhan hasil penyisipan gen disebut juga tanaman transgenik.

Berbagi macam gen telah berhasil disisipkan ke dalam DNA tanaman pertanian. Beberapa di
antaranya adalah gen bagi penghasil vitamin, gen untuk penghasil racun bagi serangga, gen bagi
pengikatan nitrogen bebas, dan gen untuk bahan herbisida. Gen-gen tersebut dapat menyebabkan
tanaman transgenik memiliki sifat gen yang dimasukkan tersebut. Perhatikan Gambar berikut.
 Langkah-langkah penyisipan gen pada tumbuhan.

Unknown
Berbagi

Tidak ada komentar:

Posting Komentar

‹
›
Beranda

Lihat versi web

Diberdayakan oleh Blogger.
#.Bioteknologi
modern iri 'i
ri bioteknologi
modern steril
, produksi dala
m jumlah banya
k (massal), kual
itasstandar dan
terjamin. Selai
n itu, bioteknol
ogi modern tida
k terlepas deng
an aplikasimeto
de metode mu
takhir bioteknol
ogi (
current methods
of biotecnology
) seperti9*) 0ult
ur jaringan mer
upakan suatu m
etode untuk me
mperbanyak jar
ingan<sel yang
berasal atau yan
g didapat dari ja
ringan original t
umbuhan atau h
ewan setelah ter
lebihdahulu me
ngalami pemisa
han (disagregas
i) se'ara mekani
s, atau kimiawi
(en>imatis)se'ar
a in itro (dala
m tabung ka'a).
#) &eknologi !"
A rekombinan (
recombinant DN
A technology
) adalah suatu
metodeuntuk m
erekayasa genet
ik dengan 'ara
menyisipkan (in
sert) gena yang
dikehendaki ke
dalam suatu or
ganisme. &rans
genik adalah su
atu metode unt
uk. ekayasa p
rotein(
 protein engineeri
ng
).=) 8ibridoma
adalah suatu m
etode untuk me
nggabungkan d
ua ma'am sel e
ukariotdengan t
ujuan mendapat
kan sel hibrid ya
ng memiliki ke
mampuan kedu
a sel induknya.4
) 0loning adalah
suatu metode u
ntuk menghasilk
an keturunan ya
ng dikehendaki
sama persis den
gan induknya.5)
olymerase !hain
s "eaction
(P ) merup
akan metode ya
ng sangat sensit
if untuk mendet
eksi dan menga
nalisis sekuen a
sam nukleat.
& P untu
k memperbany
ak (amplifikasi)
rantai "A me
njadi !"A tiss
ue<'ells EeFtra'
ted E "A<m
"A Er& P
E'opy !"A ('!"A).
6) 8ibridisasi !"
A adalah metod
e untuk menyele
ksi sekuen !"A d
engan menggun
akan probes !"A
untuk hibridisas
i (pen'angkokan
) rantai !"A. Pita
ganda2) (
double stranded
, ds) !"A se'ara a
rtifisial dapat di
pisahkan denga
n pemanasan at
auagen kimia u
ntuk mendapat
kan pita tungg
al (
single stranded
, ss), disebut pr
osesdenaturasi.
!engan pending
inan dan terkon
trol, pita yang t
erpisah dapat di
satukan lagi(
reanneal
) tetapi hanya da
lam sekuen kom
plementer.%)
Northern blot an
alysis
adalah metode
untuk analisis
Ini adalah cache Google' untuk http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teaching-
responsibility/general/bbbb/. Gambar ini adalah jepretan halaman seperti yang ditampilkan pada
tanggal 5 Okt 2019 13:16:20 GMT. Sementara itu, halaman tersebut mungkin telah berubah. Pelajari
Selengkapnya.

Versi lengkapVersi hanya teksLihat sumber

Kiat: Untuk mencari istilah penelusuran Anda di halaman ini dengan cepat, tekan Ctrl+F atau ⌘-F (Mac)
dan gunakan bilah cari.

 Profile Information
o Additional Education Background
o Awardness
o Profesional Responsibility
o Student Mentoring and coaching
 Publication
o Abstract of publication
o Conference/Seminar/Etc.
 Research Group: SMONAGENES UB
 Teaching responsibility
o Lecture : Bioethics research
o Lecture : DNA Barcoding and Forensic
o Lecture : Immunology
 Tugas mahasiswa
 What is Immunology?
 Basic Lecture of Immunology
 Immunotherapy
o Lecture : Molecular Biology
 Molecular Biology material lecture
o MK Rekayasa Protein (Protein Engineering)
 protein analysis and identification
 Biotechnology and medicine: ethical concerns
 Jadual kuliah Rekayasa protein (S2 biologi)
 Protein expression system
  protein modification: PCR-based site mutation
o Lecture : Technique Analysis of Molecular Biology
 Basic Analysis of Molecular Biology
 DNA amplification (PCR)
 DNA Isolation
 DNA qualitative & quantitative analysis
 Molecular Probe and Hybridization
 RPKPS MK TABM 2013 Jur Biologi MIPA UB
o Lecture : Genetics
 Introduction of genetics
 Material genetics
 Maternal Inheritance
 Evolution
 Molecular Evolution
 Molecular taxonomy
o Lecture: Bioinformatics (Biomedical Information)
 lecture 4: dbSNP variation
 Molecular modeling for beginner
 RPKPS MK Bioinformatika Biologi MIPA UB 2013
 What is Bioinformatics in Evolution
 What’s bioinformatics?


Fatchiyah – Molecular Genetics

Brawijaya University

DNA amplification (PCR)

Polymerase Chain Reaction:

Dasar Teknik Amplifikasi DNA

Oleh: Fatchiyah

Universitas Brawijaya

Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain

Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi
nukleotida secara in vitro. Metoda PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA
ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan
basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n
siklus PCR akan diperoleh 2nkali banyaknya DNA target. Kunci utama
pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.

Penggunaan PCR telah berkembang secara cepat seirama dengan perkembangan

biologi molekuler. PCR digunakan untuk identifikasi penyakit genetik, infeksi oleh
virus, diagnosis dini penyakit seperti AIDS, Genetic profiling in forensic, legal and
bio-diversity applications, biologi evolusi, Site-directed mutagenesis of
genes dan mRNA Quantitation di sel ataupun jaringan.

1.1 Teknik Dasar Amplifikasi PCR

Penemuan awal dari teknik PCR didasarkan pada tiga waterbaths yang mempunyai
temperatur yang berbeda. Thermal-cycler pertama kali dipublikasikan pada tahun
1986, akan tetapi DNA polymerase awal yang digunakan masih
belum thermostable, dan harus ditambahkan disetiap siklusnya. Kelemahan lain
temperature 37°C yang digunakan bias dan menyebabkan non-specific priming,
sehingga menghasilkan produk yang tidak dikehendaki. Taq DNA polymerase yang
diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun
1988. Ensim ini tahan sampai temperature mendidih 100°C, dan aktifitas
maksimal pada temperatur 92-95°C.

Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing
dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase. Sepasang primer oligonukleotida yang
spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’ menuju ujung-3’ untai
DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang diinginkan. Dasar siklus
PCR ada 30-35 siklus meliputi:

– denaturation (95°C), 30 detik

– annealing (55–60°C), 30 detik

– extension (72°C), waktu tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang

diinginkan sebagai produk amplifikasi.

Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan efek yang
positif.

1.1.1 Denaturasi untai ganda DNA

Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses PCR.
Temperatur yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda
DNA. Temperatur pada tahap denaturasi pada kisaran 92-95ºC, suhu 94ºC
merupakan pilihan standar.

Temperatur denaturasi yang tinggi membutuhkan kandungan GC yang tinggi

dari DNA template, tetapi half-life dari Taq DNA Polymerase menekan secara
tajam pada temperatur sekitar 95ºC.

1.1.2 Primer Annealing

Primer Annealing, pengenalan (annealing) suatu primer terhadap DNA target

tergantung pada panjang untai, banyaknya kandungan GC, dan konsentrasi primer
itu sendiri. Optimalisasi temperatur annealing dimulai dengan menghitung Melting
Temperature (Tm) dari ikatan primer dan DNA template. Cara termudah
menghitung untuk mendapatkan melting-temperatur yang tepatmenggunakan
rumus Tm = {(G+C)x4} +{ (A+T)x2}. Rumus standar dapat dilihat di subbab
primer pada komponen PCR. Sedang temperatur annealing biasanya 5ºC ddibawah
Tm primer yang sebenarnya. Secara praktis, Tm ini dipengaruhi oleh komponen
buffer, konsentrasi primer dan DNA template.

1.1.3 DNA Polymerase extension

Pada tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari
posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target akan
bergerak dari ujung 5’ menuju ujung 3’ dari untai tunggal DNA. Proses
pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan
panjang urutan basa nukleotida yang ditargetkan. Pada setiap satu kilobase
(1000bp) yang akan diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Sedang bila kurand
dari 500bp hanya 30 detik dan pada kisaran 500 tapi kurang dari 1kb perlu waktu
45 detik, namun apabila lebih dari 1kb akan memerlukan waktu 2 menit di setiap
siklusnya (lihat contoh pada tabel 2). Adapun temperatur ekstensi berkisar antara
70-72°C.

Tabel 1 Amplifikasi Geometrik (X=2 n)

Siklus PCR Jumlah Relatif Molekul

1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
10 1.024
20 1. 048.576
30 1.073.741.824
II. Komponen PCR

Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA
polimerase yang thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.

2.1 Template DNA

Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB,
Hasil amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil
amplifikasi lebih dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang
panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA
polymerase dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat menyebabkan
hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.

2.2 Primers

Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini
harus mampu mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi
sepasang primer akan mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa
panjangnya pada tiap primernya. Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing
temperatur antara primer yang digunakan harus berkisar antara 1°C. Ujung 3’ dari
setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari susunan nukleotida G/C berturut-
turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG, CCC, GCC. Pada
penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan primer
tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu
sama lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada
daerah DNA repetitif.

2.3 Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas
polimerisasi DNAnya dari ujung-5’ ke ujung-3’ dan aktivitas enzimatik ini
mempunyai waktu paruh sekitar 40 menit pada 95ºC. Biasanya untuk setiap 100μl
volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5 unit.

2.4 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan
1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template
dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan
kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa
atau dengan MgCl2.

Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat
kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer,
temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan
konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi
DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi,
seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+ yang bebas bila terlalu rendah atau tidak
ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu
banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak
diinginkan.

2.5 Nucleotides (dNTPs)

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 μM. Pada
konsentrasi ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik
estimasi Km untuk setiap dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi
yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polymerase.
Sedang pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifitas yang
tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait
dan tidak akan merubah secara bebas.

2.6 PCR Thermal Cycler

PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh

perusahaan PerkinElmer sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah
diproduksi berbagai macam tipe alat PCR thermal cycler ini dari berbagai
perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun nama masing-masing

alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.

Sumber: Fatchiyah, 2005, PCR: Dasar teknik Amplifikasi DNA dan Applikasinya
Comment Feed
No Responses (yet)

Leave a Reply

Some HTML is OK

Name (required)

Email (required, but never shared)

Web

or, reply to this post via trackback.

CAPTCHA Code*
Pages

 Profile Information
o Additional Education Background
o Awardness
o Profesional Responsibility
o Student Mentoring and coaching
 Publication
o Abstract of publication
o Conference/Seminar/Etc.
 Research Group: SMONAGENES UB
 Teaching responsibility
o Lecture : Bioethics research
o Lecture : DNA Barcoding and Forensic
o Lecture : Immunology
 Tugas mahasiswa
 What is Immunology?
 Basic Lecture of Immunology
 Immunotherapy

o Lecture : Molecular Biology
 Molecular Biology material lecture
o MK Rekayasa Protein (Protein Engineering)
 protein analysis and identification
 Biotechnology and medicine: ethical concerns
 Jadual kuliah Rekayasa protein (S2 biologi)
 Protein expression system
 protein modification: PCR-based site mutation
o Lecture : Technique Analysis of Molecular Biology
 Basic Analysis of Molecular Biology
 DNA amplification (PCR)
 DNA Isolation
 DNA qualitative & quantitative analysis
 Molecular Probe and Hybridization
 RPKPS MK TABM 2013 Jur Biologi MIPA UB
o Lecture : Genetics
 Introduction of genetics
 Material genetics
 Maternal Inheritance
 Evolution
 Molecular Evolution
 Molecular taxonomy
o Lecture: Bioinformatics (Biomedical Information)
 lecture 4: dbSNP variation
 Molecular modeling for beginner
 RPKPS MK Bioinformatika Biologi MIPA UB 2013
 What is Bioinformatics in Evolution
 What’s bioinformatics?

Categories

 Activity
 lecture
 News
 Publication
 research
 Uncategorized

Tags
bioinformatics Biologi Biologi Molekuler Biology biomolblack-tea Brawijaya University Diabetes DNADNA
Barcoding DNA forensik DNA Rekombinan ELSIethics evolution Fatchiyah FMIPA UB GAD65 geneticshuman genome
project Igf-1 IGN-TTRC IGNTTRC UB Council 2012 in silico ISO 17025 KAN kuliah TABM LSIH UB manajemen

laboratorium microbiology molecularMolecular Biology npc paper publication Penelitian PLPPranata Laboratorium
Pendidikan Protein publicationpublikasi ilmiah RNA scientific writing SNP tabm UB

Archives

 April 2019
 October 2018
 September 2016
 July 2016
 February 2016
 September 2015
 July 2015
 April 2015
 October 2014
 August 2014
 April 2014
 March 2014
 February 2014
 December 2013
 November 2013
 October 2013
 September 2013
 August 2013
 May 2013
 April 2013
 March 2013
 February 2013
 September 2012
 August 2012
 July 2012
 May 2012
 April 2012
 March 2012
 February 2012
 January 2012
 December 2011
 June 2011
 April 2011
 June 2010
 May 2010
 April 2010
  March 2010
 February 2009

Register

Log in

Designed by Brambling Design | © Copyright 2019 Fatchiyah – Molecular

Genetics

 Search
 Pages
o Profile Information
 Additional Education Background
 Awardness
 Profesional Responsibility
 Student Mentoring and coaching
o Publication
 Abstract of publication
 Conference/Seminar/Etc.
o Research Group: SMONAGENES UB
o Teaching responsibility
 Lecture : Bioethics research
 Lecture : DNA Barcoding and Forensic
 Lecture : Immunology
 Tugas mahasiswa
 What is Immunology?
 Basic Lecture of Immunology
 Immunotherapy
 Lecture : Molecular Biology
 Molecular Biology material lecture
 MK Rekayasa Protein (Protein Engineering)
 protein analysis and identification
 Biotechnology and medicine: ethical concerns
 Jadual kuliah Rekayasa protein (S2 biologi)
 Protein expression system
 protein modification: PCR-based site mutation
 Lecture : Technique Analysis of Molecular Biology
 Basic Analysis of Molecular Biology
 DNA amplification (PCR)
 DNA Isolation
 DNA qualitative & quantitative analysis
 Molecular Probe and Hybridization
  RPKPS MK TABM 2013 Jur Biologi MIPA UB
 Lecture : Genetics
 Introduction of genetics
 Material genetics
 Maternal Inheritance
 Evolution
 Molecular Evolution
 Molecular taxonomy
 Lecture: Bioinformatics (Biomedical Information)
 lecture 4: dbSNP variation
 Molecular modeling for beginner
 RPKPS MK Bioinformatika Biologi MIPA UB 2013
 What is Bioinformatics in Evolution
 What’s bioinformatics?
 Categories
o Activity
o lecture
o News
o Publication
o research
o Uncategorized
 Archives
o April 2019
o October 2018
o September 2016
o July 2016
o February 2016
o September 2015
o July 2015
o April 2015
o October 2014
o August 2014
o April 2014
o March 2014
o February 2014
o December 2013
o November 2013
o October 2013
o September 2013
o August 2013
o May 2013
o April 2013
 o March 2013
o February 2013
o September 2012
o August 2012
o July 2012
o May 2012
o April 2012
o March 2012
o February 2012
o January 2012
o December 2011
o June 2011
o April 2011
o June 2010
o May 2010
o April 2010
o March 2010
o February 2009

 Beranda
 Sembarang
 Sekitaran
 Masuk log
 Pengaturan
 Tentang Wikipedia

 Penyangkalan
Buka menu utama

Cari

Reaksi berantai polimerase

 Baca dalam bahasa lain
 Unduh
 Pantau
 Sunting
Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik reaksi berantai polimerase

Reaksi berantai polimerboonvase atau lebih umum dikenal

sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)
merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik
ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat
sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini
dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada
tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di
bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya
memerlukan jumlah sampel yang kecil.
 Prinsip kerjaSunting

Prinsip kerja reaksi berantai polimerase

Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali siklus
yang tergantung oleh kebutuhan. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut
adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus:

1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu
tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas
tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit)
untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak
stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang
komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60 °C. Penempelan ini
bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau
primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA
polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taq-polimerase,
proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
 Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi dan
renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer
lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang
dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi
secara eksponensial.
Lihat pula
Pranala luar

Terakhir disunting 10 bulan yang lalu oleh AABot

HALAMAN TERKAIT
 Biologi molekular
 Amplifikasi Acak Polimorfisme DNA
 Pfu DNA polimerase

Konten tersedia di bawah CC BY-SA 3.0 kecuali dinyatakan lain.

 Privasi
 Tampilan PC