Respon Sel Epitel terhadap Kesehatan dan Penyakit Terkait Model Biofilm Oral

Latar Belakang dan Tujuan: Bakteri yang berbeda secara signifikan merangsang sel epitel. Komposisi
dan viabilitas biofilm cenderung mempengaruhi respons epitel. Sistem model in vitro biasanya
digunakan untuk menyelidiki bakteri periodontitis dan interaksi mereka dengan inang; Oleh karena
itu, memahami faktor-faktor yang mempengaruhi interaksi sel biofilm sangat penting. Penelitian ini
bertujuan untuk mengembangkan monospesies in vitro dan multispesies biofilm dan menyelidiki
respon epitel terhadap biofilm ini.

Bahan dan Metode: Bakteri biofilm dikultur secara in vitro dan kemudian biofilm bioaktif yang hidup
atau yang mengandung metanol dikultivasi dengan sel epitel. Perubahan viabilitas sel epitel, ekspresi
gen dan kandungan sitokin supernatan kultur dievaluasi.

Hasil: viabilitas bakteri lebih baik diawetkan dalam kultur biofilm spesies campuran daripada dalam
kultur biofilm spesies tunggal. Kedua biofilm campuran dan spesies tunggal merangsang peningkatan
ekspresi mRNA untuk interleukin 8 (IL8), CXC motif chemokine ligand 3 (CXCL3), CXC motif chemokine
ligand 1 (CXCL1), interleukin 1 (IL1), interleukin 6 (IL6) faktor stimulasi koloni 2 (CSF2) dan faktor
nekrosis tumor (TNF), dan responnya paling besar dalam menanggapi spesies biofilm campuran.
Setelah co-culture, sitokin yang terdeteksi pada supernatan termasuk IL-8, IL-6, faktor stimulasi koloni
granulosit dan faktor stimulasi koloni granulosit-makrofag, dengan pelepasan sitokin terbesar yang
ditemukan pada ko-kultur dengan metanol, spesies biofilm campuran.

Kesimpulan: Data ini menunjukkan bahwa sel epitel menghasilkan tanda gen dan ekspresi ekspresi
sitokin yang berbeda sebagai respons hidup atau mati, bertekstur tunggal atau multispesies biofilm.

Sulkus gingiva dilapisi oleh jaringan yang tidak berkeratin, epitel skuamous berlapis yang
berkontak secara konstan dengan bakteri dan produknya. Dengan demikian, epitel barrier ini menjaga
pemeliharaan kesehatan mulut dan homeostasis imun secara integrasi. Epitel menyediakan barrier
fisik yang berperan aktif dalam menginisiaasi pertahanan host dengan melepaskan mediator yang
larut seperti sitokin. Kemajuan dalam pemahaman kami mengenai mikrobiologi penyakit periodontal
telah mengungkapkan kompleksitasnya biofilm. Spesies kunci, seperti Porphryomonas gingivalis,
sangat berperan dalam disfoliasi biofilm namun bergantung pada komensal dengan kemampuan
sebagai pathogen aksesori, seperti Streptococci spp. Secara in vivo, bakteri mulut, seperti P. gingivalis,
hanya ditemukan di multispesies biofilm dalam rongga mulut. Banyak bakteri dalam biofilm oral
memiliki interaksi sinergis atau antagonis yang bisa membentuk biofilm, dan interaksi bakteri ini
cenderung berdampak pada interaksi bakteri host. Respon imun host terhadap biofilm berperan
dalam penyakit periodontal pathogen. Karena itu, mengamati interaksi antara bakteri oral dan system
imun dari host penting untuk memahami etiologi penyakit periodontal. Secara historis, banyak studi
in vitro dari hubungan host pathogen di rongga mulut diselidiki bekteri yang diturunkan larut atau
molekul yang disekresikan, seperti lipopolisakarida atau protease, atau digunakan satu spesies
planktonic tunggal (bisa jadi hidup, tetap atau menonaktifkan panas), berkoordinasi dengan sel utama
manusia atau garis sel. Studi ini mengidentifikasi peran spesifik dari molekul, reseptor dan ligan, dan
juga pola respon terhadap bakteri tertentu. Berdasarkan beberapa temuan, studi ini mengungkapkan
bahwa sel epitel gingiva manusia hidup atau panas bakteri awal kolonisasi, seperti Streptococcus
gordonii, dalam planktonic formulir, menghasilkan pelepasan jumlah minimal sitokin seperti itu
sebagai interleukin (IL)-6, IL-8 dan IL-1β. Sebaliknya, pelepasan sitokin secara signifikan meningkat
sebagai respon terhadap penyakit spesies seperti Fusobacterium nucleatum. Studi budidaya tentang
P.gingivalis dan sel epitel menunjukkan bahwa P.gingivalis mendegradasi sitokin dan menyerang sel
inang. In vivo, dalam mulut, bakteri ada sebagai multispesies biofilm yang kompleks, dan karena itu
secara studi in vitro semakin banyak menghasilkan kompleksitas interaksi host-biofilm. Studi yang
berbeda telah menyelidiki efek pada sel mamalia bakteri hidup dan mati, bakteri dalam bentuk
planktonik dan biofilm, satu spesies bakteri dan beberapa spesies bakteri dalam berbagai kombinasi.
Dalam penelitian ini, kami berusaha membandingkan tanggapan sel epitel terhadap bakteri yang
berbeda, sebagai biofilm tunggal dan multispesies, untuk membangun gambaran menyeluruh tentang
respons seluler.

Bahan dan Metode

Bakteri dan biofilm

Bakteri dan biofilm disiapkan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, P.
gingivalis ATCC 33277 dan F. nucleatum ATCC 10596 ditanam pada suhu 37 ° C di Schaedler Anaerobe
Broth (Oxoid, Cambridge, Inggris) untuk 2 d di ruang anaerobik (85% N2, 10% CO2 dan 5% H2; Don
Whitley Scientific Limited, Shipley, Inggris). Aggregatibacter actinomycetemcomitans ATCC 43718 dan
Streptococcus mitis ATCC 12261 ditanam pada suhu 37 ° C pada kaldu kedelai tryptic (Sigma, Poole,
Inggris), ditambah dengan 0,8% berat berdasarkan volume (w / v) glukosa (BDH, Poole, Inggris) dan
0,6% (w / v) ekstrak ragi (Oxoid, Cambridge, Inggris), selama 24 jam dalam 5% CO2. Bakteri dicuci
dengan garam penyangga fosfat kemudian distandarisasi menjadi sekitar 1x107 unit pembentuk koloni
/ mL dalam air liur buatan (AS) yang mengandung lambung perut babi (0,25%, b / v) (Sigma-Aldrich,
Inggris), natrium klorida (0,3%, w / v) (VWR, Leuven, Belgia), kalium klorida (0,02%, b / v) (VWR),
kalsium klorida dihidrat (0,02%, b / v) (VWR), ekstrak ragi (0,2% , w / v) (Formedium, Hunstanton,
Inggris), Lab-Lemco powder (0,1%, w / v) (Oxoid, Hampshire, Inggris) dan Proteose-Peptone (0,5%, w
/ v) (SigmaAldrich) dalam ddH2O Thermo Ilmiah). Urea (Sigma-Aldrich) itu diencerkan dalam ddH2O
[untuk memberi larutan stok 40% (w / v) urea] dan ditambahkan ke konsentrasi akhir 0,05% (v / v) di
AS.

Biofilm disiapkan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, untuk
monospesies S. mitis biofilm, 500 µL S. mitis standar di AS dipindahkan ke 24 cawan petri (Corning),
mengandung penutup tipis ThermanoxTM (diameter 13 mm, Fisher Scientific, Loughborough, Inggris),
kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C dalam 5% CO2 selama 48 jam. Porphyromonas gingivalis
disiapkan sama namun diinkubasi pada suhu 37 ° C di lingkungan anaerob selama 96 jam. Untuk
multispesies biofilm, S. mitis di AS ditambahkan untuk 24 jam pertama, pada suhu 37 ° C, 5% CO2;
supernatan kemudian dikeluarkan dan F. nukleatum di AS ditambahkan dan biofilm diinkubasi secara
anaerob untuk 24 jam. Supernatan telah dilepas dan akhirnya P. gingivalis standar dan A.
actinomycetemcomitans di AS ditambahkan ke biofilm dan diinkubasi pada suhu 37 ° C di ruang
anaerob untuk 4 hari selanjutnya. Dalam semua kasus AS diganti setiap hari. Biofilm divisualisasikan
dengan pemindaian mikroskop elektron, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya. Secara singkat,
biofilm dicuci tiga kali dalam larutan buffer buffer steril steril, kemudian diperbaiki dan dilihat
menggunakan JEOL JSM-6400 scanning electron microscope (Herts, UK). Biofilm atau bakteri yang
digambarkan sebagai 'mati' atau 'tetap' diperbaiki dengan metanol 100%.

Co-culture sel epitel

Sel-sel OKF6 / TERT2 (yang diberikan oleh Laboratorium Rheinwald; Rumah Sakit Brigham
dan Wanita, Boston, MA, AS), sel kulit keratinosit manusia yang diabadikan, dikultur dengan biofilm
atau bakteri planktonik seperti yang telah dijelaskan sebelumnya dan seperti yang ditunjukkan pada
gambar legenda Setiap percobaan dilakukan dengan menggunakan 'batch' bio-film yang
dikembangkan secara mandiri, dikultur dalam rangkap tiga di sumur dengan sel epitel, dan semua
percobaan diulang setidaknya dua kali.

Ekspresi gen sel epitel

Analisis ekstraksi RNA dilakukan dengan menggunakan Kit Mini RNeasy (Qiagen, Hilden,
Jerman), sesuai petunjuk pabriknya. Sebuah spektrofotometer NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)
digunakan untuk menilai konsentrasi dan kualitas RNA. Lima ratus nanogram RNA ditranskripsi terbalik,
menggunakan 'kit RNA-tocDNA berkapasitas tinggi' (Applied Biosystems, oster City, CA, USA), menurut
instruksi pabrikan. Analisis geneexpression dilakukan dengan menggunakan ABI yang dirancang
khusus Taqman beriringan mikrofluida Rendah
Array (aplikasi biosistem), yang kumpulan primer / probe yang tergabung untuk
mengevaluasi ekspresi gen yang terkait dengan gingivitis (12): faktor penstimulasi koloni 3 (CSF3),
interleukin 8 (IL8), interleukin-1alpha (IL1a), CC motif chemokine ligand 5 (CCL5),
interleukin-1beta (IL1b), motif C-X-C ligan kemokin 3 (CXCL3), C-C motif chemokine ligand 3 (CCL3),
CX3-C motif kemokin reseptor 3 (CX3CR1), motif kemokin C-C ligan 4 (CCL4), C-X-C motif kemokin ligan
10 (CXCL10), C-X-C motif chemokine ligand 11 (CXCL11), Faktor nekrosis tumor, alfa (TNFa), faktor
penstimulasi koloni 2 (CSF2), C-X-C motif kemokin ligan 1 (CXCL1), interleukin 6 (IL6) dan CX-C motif
chemokine ligand 5 (CXCL5). Dua rumah tangga, gen kontrol - protein pengikat TATAA-kotak dan
gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) - digunakan untuk rentang rentang kelimpahan /
siklus ambang (Ct) relatif gen pada kartu. Untuk analisis ekspresi gen, mean geometrik nilai gen C
rumah tangga dikurangi dari nilai gen target dan nilai DDCt untuk setiap mRNA target diperoleh dan
digunakan dalam analisis statistik berikutnya.

Gambar 1. Memindai mikrograf elektron dan jumlah sel yang layak dari monospesies segar dan biofilm
multispesies. (A) Memindai gambar mikroskop elektron dari Porphryomonas gingivalis (Pg),
Fusobacterium nucleatum (Fn), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) dan biofilm
Streptococcus mitis (Sm) monospecies, dan kelangsungan hidup mereka selama 24 jam dalam media
kultur sel. Bagan batang menunjukkan jumlah rata-rata [diberikan dalam unit pembentuk koloni (CFU)
/ mL] dari bakteri yang hidup yang dipulihkan dari kesalahan standar biofilm dari rata-rata. (B)
Memindai gambar mikroskop elektron dari biofilm multispesies, panah di SEM menunjukkan contoh
masing-masing dari 4 bakteri yang berbeda. Data yang ditampilkan mewakili kelangsungan hidup lebih
dari 24 jam dalam medium kultur sel. Hasilnya diberikan dalam CFU / ml (bagan batang berkelompok)
dan sebagai perubahan proporsional dalam komposisi biofilm ditampilkan sebagai persentase total
(%) dari jumlah total bakteri biofilm spesies campuran (bagan batang bertumpuk). Analisis statistik
dilakukan pada transformasi akar kuadrat dari nilai CFU / mL menggunakan uji-dua-sampel
independen-tailed (* p <0,01, ** p <0,001, *** p <0,0001).

Pelepasan protein dari sel epitel

Supernatan dipanen dari OKF6 sel epitel, 4 dan 24 jam setelah tantangan biofilm bakteri,
dievaluasi untuk faktor stimulasi koloni granulosit-makrofag IL-1a, IL-6, IL-8, granulocyte-macrophage
and stimulan granulosit dengan manik multipleks Luminex (ThermoFisher) sesuai dengan instruksi
pabrikan; dan untuk protein ala yang diatur pertumbuhannya (Gro-a, dikodekan oleh CXCL1), CXC
motif chemokine 10 [CXCL10, juga dikenal sebagai protein interferon gamma-inducible (IP-10)] dan
motif kemokin CC 5 (CCL5; juga dikenal sebagai RANTES) menggunakan ELISA (Peprotech, London,
Inggris) sesuai petunjuk pabriknya.

Viabilitas sel epitel

Viabilitas sel epitel dianalisis dengan pewarna alamiarBlue (ThermoFisher), sesuai petunjuk
pabriknya. Media kultur sel dipindahkan dari epitel monolayer dan sel epitel dicuci dan kemudian
diinkubasi dengan 10% alamarBlue. Viabilitas sel dinilai menggunakan alamarBlue dan data
dinyatakan sebagai persentase perbedaan antara reduksi intensitas alamarBlue pada sel yang dirawat
tanpa kontrol yang tidak diobati. Pelepasan DNA dan histone juga dievaluasi untuk menilai kematian
sel, dengan menggunakan Deteksi Kematian Sel ELISAPLUS (Roche Applied Science, Mannheim,
Jerman) sesuai petunjuk pabrik pembuatnya. Pengayaan spesifik mono dan oligonukleosom yang
dilepaskan ke sitoplasma dinilai dan rasio antara nilai absorbansi yang diperoleh pada kontrol media
dan sel epitel yang diobati dengan biofilm dihitung. Sel epitel yang diobati dengan 4 lg / mL
camptothecin berfungsi sebagai kontrol positif.

Gambar 2. Ekspresi gen berubah dalam sel epitel setelah stimulasi dengan biofilm yang berbeda. Sel-
sel epitel OKF6-TERT2 ditantang dengan biofilm Streptococcus mitis (A, B dan D) hidup (A, C dan E)
atau tetap (A dan B), Porphryomonas gingivalis (C dan D) dan biofilm spesies campuran (E dan F)
selama 4 jam (batangan putih) dan 24 jam (batangan hitam). Ekspresi mRNA untuk gen terkait
gingivitis dinilai menggunakan TaqMan Low Density Array. Ekspresi gen dinormalisasi dengan kontrol
endogen gliseraldehida-3-fosfat (GAPDH). Balok di setiap bagan mewakili perubahan lipatan dalam
ekspresi gen relatif terhadap kontrol yang hanya menggunakan medium. Analisis statistik dilakukan
pada nilai-nilai DDCt. * Secara signifikan berbeda dari kontrol medium saja, p <0,05; ** secara
signifikan berbeda dari kontrol menengah saja setelah koreksi Bonferroni dari nilai p. Simbol dan
definisi gen: ligan chemokine motif CCL5, C-C; CSF2, faktor penstimulasi koloni 2; CSF3, faktor
penstimulasi koloni 3; CXCL1, ligan chemokine motif C-X-C 1; CXCL3, ligan chemokine motif C-XC 3;
CXCL5, ligan chemokine motif C-X-C 5; CXCL10, ligan chemokine motif C-X-C 10; IL1a, interleukin-
1alpha; IL1b, interleukin-1beta; IL8, interleukin 8; TNFa, faktor nekrosis tumor, alfa

Analisis statistik
Produksi grafik, distribusi data dan analisis statistik dilakukan dengan menggunakan
perangkat lunak GRAPHPAD PRISM (versi 6; Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, AS), perangkat lunak
MICROSOFT EXCEL dan PALEONTOLOGICAL STATISTIK (PAST; v3.02) (14). Setelah menilai apakah data
sesuai dengan distribusi normal sebelum dan sesudah transformasi data, ANOVA dan uji-t digunakan
untuk menyelidiki perbedaan signifikan antara kelompok data independen yang mendekati distribusi
Gaussian. Uji t Welch digunakan bila ada perbedaan signifikan dalam varian data antara kelompok.
Meskipun analisis ini terutama bersifat eksploratif, koreksi Bonferroni diterapkan untuk
memperhitungkan beberapa perbandingan data. Data transformasi log digunakan untuk melakukan
analisis komponen utama menggunakan PAST.

Hasil

Biofilm tumbuh in vitro

Porphryomonas gingivalis, S. mitis, F. nucleatum dan A. actinomycetemcomitans masing-masing
komunitas bakteri yang dipetakan secara individu yang menempel/adesi pada cakram hidroksiapatit
(Gambar 1A). Ini adalah arsitektur variable: F. nucleatum membentuk jaringan bakteri yang berlapis-
lapis dan relatif padat; P. gingivalis membentuk kelompok bakteri yang relatif jarang; dan biofilm
mixedspesies membentuk struktur berlapis padat yang kompleks, yang lebih penting daripada biofilm
singlespecies (Gambar 1B). Biofilm S. mitis yang mapan terus tumbuh dalam kondisi kultur sel selama
24 jam. Lebih dari 24 jam, A. actinomycetemcomitans mempertahankan kelangsungan hidup konstan;
viabilitas F.nucleatum dan P. gingivalis secara signifikan menurun (Gambar 1A). Proporsi bakteri dalam
spesies campuran biofilm berubah mengikuti kultur dalam kondisi kultur sel, dengan pengurangan
proporsi F. nucleatum dan A. actinomycetemcomitans, dan peningkatan proporsi P. gingivalis dan S.
mitis (Gambar 1B).

Table 1. perbandingan ekspresi gen (level mRNA), pada poin waktu kultur 4 jam

Nilai yang dihitung menggunakan uji-t Welch ditunjukkan dalam huruf miring. Bold menunjukkan
perbedaan yang signifikan secara statistik dalam perbandingan yang tercantum di atas. bf, biofilm;
mati, diperbaiki; campuran, spesies campuran; pg, Porphyromonas gingivalis; sm, Streptococcus mitis.
Simbol dan definisi gen: ligan chemokine motif CCL5, C-C; CSF2, faktor penstimulasi koloni 2; CSF3,
faktor penstimulasi koloni 3; CXCL1, C-X-C motif chemokine ligan 1; CXCL3, ligan chemokine motif C-
X-C 3; CXCL5, ligan chemokine motif C-X-C 5; CXCL10, ligan chemokine motif C-X-C 10; IL1a, interleukin-
1alpha; IL1b, interleukin-1beta; IL8, interleukin 8; TNF, faktor nekrosis tumor. * Signifikan setelah
koreksi Bonferroni. Jika perbandingan tidak menunjukkan perbedaan ini dihilangkan dari tabel.

Ekspresi gen oleh sel epitel mengikuti co-culture dengan biofilm bakteri yang berbeda
Sel epitel dikultur sendiri (media control) atau dengan biofilm bakteri satu spesies atau
multispesies yang tergantung pada disk yang ditempatkan 0,5 mm di atas sel epitel. Sistem ini
memungkinkan kultur biofilm bakteri hidup dengan cairan berdekatan dan mengingatkan pada aliran
cairan krustik gingiva di saku periodontal. Dengan demikian, sel epitel menghadapi sejumlah kecil
bakteri yang ditumpahkan dari biofilm dan juga terkena produk bakteri hidup di biofilm. Bakteri di
kantong periodontal, khususnya P. gingivalis, diketahui menghasilkan produk yang bersifat sitotoksik
dan dapat menurunkan sitokin. Oleh karena itu, untuk menentukan sejauh mana bakteri hidup dan
produknya berkontribusi pada respons inang, sel-sel dirangsang dengan bio-film tetap dan hidup.
Biofilm S. mitis dan P. gingivalis biofilm dipilih sebagai contoh biofilm monevecies, masing-masing
bakteri terkait komersil dan penyakit, dan biofilm empat spesies campuran digunakan sebagai contoh
komunitas multispecies yang lebih kompleks.
Respon sel epitel diselidiki setelah 4 atau 24 jam kultur dengan bakteri, dan semua
percobaan diulangi setidaknya dua kali. Perbandingan perubahan lipatan ekspresi gen dibandingkan
dengan kontrol media menunjukkan bahwa biofilm bakteri hidup (P. gingivalis, S. mitis atau spesies
campuran) merangsang perubahan ekspresi gen yang lebih besar daripada biofilm bakteri metanol-
tetap. Ada peningkatan progresif baik dalam jumlah gen yang diatur dan besarnya peningkatan dari
sel epitel yang dirangsang oleh S. mitis, ke sel stimulasi P. gingivalis, dengan biofilm campuran
menghasilkan peningkatan kualitatif dan kuantitatif dalam ekspresi gen. (Gambar 2). Sebagai
tanggapan terhadap stimulasi dengan biofilm campuran spesies ada peningkatan yang menonjol
dalam ekspresi mRNA untuk IL8, CXCL3, CXCL1, IL1, IL6, CSF2 dan TNFa. Secara umum, biofilm hidup
merangsang perubahan yang lebih besar pada ekspresi gen daripada biofilm tetap (Gambar 2 dan
Tabel 1). Analisis komponen utama dari data ekspresi gen untuk semua gen dan semua kondisi
dilakukan (Gambar 3). Setiap titik mewakili vektor yang diturunkan untuk setiap kondisi percobaan
dari dua komponen utama yang masing-masing, masing-masing mencakup 74,5% dan 10,6% varians.
Representasi visual dari data ini menunjukkan pengelompokan respons sel epitel terhadap biofilm
hidup dibandingkan dengan biofilm tetap (Gambar 3A), dan respon sel epitel terhadap biofilm spesies
campuran dibandingkan dengan biofilm monospesies (Gambar 3B).

Gambar 3. Analisis komponen utama dari perubahan ekspresi gen sel epitel setelah paparan biofilm
yang berbeda. Data yang digambarkan pada Gambar. 2 menjadi sasaran analisis komponen utama.
Setiap titik mewakili semua percobaan di mana sel dirangsang oleh paparan kondisi tertentu dan
merupakan vektor yang diposisikan pada setiap sumbu sesuai dengan persentase persentase dari asal,
pada dua sumbu komponen utama (PC1 dan PC2). (A) Data yang dianotasi untuk membandingkan
respons terhadap biofilm hidup (kotak padat) dengan respons terhadap biofilm tetap (kotak terbuka).
(B) Data yang dianotasi untuk membandingkan respons terhadap biofilm spesies campuran (berlian
padat) dengan respons terhadap biofilm spesies tunggal (berlian terbuka).

Gambar 4. Pelepasan sitokin sel epitel setelah stimulasi dengan biofilm yang berbeda. Sel epitel OKF6-
TERT2 dikultur dengan medium saja (m) atau ditantang dengan biofilm hidup atau tetap dari
Streptococcus mitis (Sm), Porphryomonas gingivalis (Pg) dan biofilm spesies campuran (Campuran)
selama 4 jam (batang putih) dan 24 jam (bilah hitam). Konsentrasi protein dalam supernatan kultur
sel diukur menggunakan Luminex multiplex beads. (A) IL-8, (B) IL-6, (C) IL-1b, (D) GCSF. Setiap batang
mewakili kesalahan standar rata-rata dari pengukuran duplikat dari dua percobaan independen. *
Sangat berbeda dari kontrol menengah saja; p <0,05. ** Secara signifikan berbeda dari kontrol hanya-
menengah setelah koreksi Bonferroni dari nilai p. G-CSF, faktor penstimulasi koloni granulosit; IL-1b,
interleukin-1b; IL-6, interleukin-6; IL-8, interleukin-8.

Produksi sitokin dari sel epitel dikultivasi dengan bakteri

Setelah penyelidikan perubahan ekspresi gen, kami berusaha untuk menentukan

perubahan pelepasan sitokin ke supernatan kultur sel. Spesies hidup tunggal dan campuran biofilm
mendorong pelepasan IL-8, IL-6 dan granulocyte-stimulating factor yang sederhana. Dibandingkan
dengan kontrol medium-only, biofilm campuran hidup merangsang pelepasan sitokin yang signifikan
pada kedua 4 dan 24 jam (Gambar 4, dan ringkasan analisis statistik pada Tabel 2).

Viabilitas sel epitel berikut kokultur dengan biofilm

Untuk menyelidiki perubahan viabilitas sel, sel epitel OKF6-TERT2 ditantang dengan film
biofuel biofuel hidup atau metanol-fixed, mixed atau single-species, selama 4 dan 24 jam.
Dibandingkan dengan kelangsungan hidup sel yang dibiakkan dengan medium saja, sebagian besar
biofuel menyebabkan penurunan viabilitas sel secara signifikan secara statistik, yang diukur dengan
kedua metode (Tabel 3). Besarnya perubahan viabilitas, yang dinilai oleh alamarBlue, bervariasi,
dengan sel epitel yang ditantang dengan biofilm hidup yang muncul untuk menjaga kelangsungan
hidup yang dekat dengan kontrol medium selama 4 jam, dan viabilitas menurun pada 24 jam (Gambar
5A). Semua biofilm menyebabkan pelepasan histone secara statistik meningkat secara signifikan
dibandingkan dengan kontrol medium (Gambar 5B).

Diskusi
Data yang diperoleh dalam penelitian ini menunjukkan bahwa garis sel epitel menghasilkan
gen sitokin yang berbeda - dan tanda ekspresi protein sebagai respons terhadap biofilm hidup atau
mati, tunggal atau multispesies. Data tersebut menyiratkan konsekuensi fungsional imun, untuk host
dan bakteri, komposisi biofilm yang berbeda. Respon kekebalan sel epitel tampaknya bergantung pada
jenis tantangan bakteri. Hasil PCA menunjukkan bahwa biofilm campuran menimbulkan respons yang
berbeda dibandingkan dengan biofilm satu spesies, dan dampak viabilitas biofilm terhadap respons
tersebut. Studi sebelumnya menggunakan bakteri dalam budaya planktonik atau biofilm singlespecies
dari Streptococcus oralis, F. nucleatum atau A. actinomycetemcomitans menunjukkan tanggapan
spesifik spesies pada sel epitel oral. Umumnya, bakteri planktonik dengan patogenisitas yang lebih
besar merangsang peningkatan kadar sitokin pro-inflamasi, seperti IL-6, IL-8 dan IL-1b. Sel-sel tersebut
menghasilkan berbagai sitokin dan kemokin, dengan fungsi termasuk kemoattraction, promosi
kelangsungan hidup sel, aktivasi sel endotel dan peningkatan ekspresi molekul adhesi dan stimulasi
produksi sitokin oleh jenis sel lainnya. Dengan demikian, biofilm, khususnya biofilm spesies campuran,
merangsang semua ciri sitokin radang gingiva dan dapat mengaktifkan sel epitel untuk
mengkoordinasikan banyak fitur peradangan gingiva. Keadaan pematangan biofilm telah terbukti
menghasilkan ekspresi diferensial IL-8 oleh sel epitel, dengan biofilm dewasa lebih proinflamasi
daripada biofilm yang kurang kompleks. Respons yang relatif sederhana terhadap biofilm S. mitis, yang
diamati dalam penelitian ini, konsisten dengan pengamatan sebelumnya yang menunjukkan respons
sel epitel serupa terhadap monospesies. Streptococcus biofilm atau multispesies biofilm yang
mengandung bakteri yang digolongkan sebagai 'penjajah awal'. Data kami menunjukkan perbedaan
yang jelas antara tingkat ekspresi gen dan kadar protein yang dilepaskan, terutama untuk menanggapi
biofilm spesies campuran hidup, yang secara statistik secara signifikan menunjukkan regulasi mRNA
untuk IL-6, IL-8, IL-1 dan CXCL5 daripada biofilm tetap, namun hanya peningkatan konsentrasi sitokin
dalam supernatan yang relatif kecil. Kami menduga bahwa respons yang disempurnakan terhadap sel
hidup ini mencerminkan stimulasi produk larut yang dilepaskan dari biofilm yang layak, namun tidak
tetap. Selain itu, proses fiksasi biofilm mungkin telah mengubah antigen bakteri sehingga kurang
stimulasi terhadap sel epitel.
Konsentrasi sitokin yang lebih tinggi terdeteksi pada supernatan setelah kultur dengan
biofilm mati dibandingkan dengan kultur dengan biofilm hidup. Sel-sel epitel dengan jelas menanggapi
biofilm ini tetapi ada juga kemungkinan modifikasi sitokin pasca translasi dimana ada biofilm hidup
yang ada. Studi menggunakan multispecies model biofilm oral telah melaporkan temuan serupa saat
menyelidiki ekspresi protein dan menyebabkan degradasi sitokin ini oleh P. gingivalis, dengan
pengurangan IL-8 dalam ko-kultur supernatan setelah kultur P.gingivalis dan gingipainnya ada di
biofilm. . Selain dampak produk gen tertentu, ada kemungkinan efek yang dihasilkan dari variasi strain
pada spesies individu di dalam biofilm. Spesies dipilih dalam studi ini mencerminkan yang digunakan
dalam penelitian sebelumnya. Porphyromonas gingivalis ATCC33277 memiliki tipe I FimA,
mengungkapkan gingipains dan tidak memiliki kapsul. Strain ini mampu dalam pembentukan biofilm
in vitro dan akan menginduksi hilangnya tulang alveolar pada hewan model (20). Aggregatibacter
actinomycetemcomitans 43718 adalah serotipe b, yang memproduksi vesikel membran sitotoksik dan
secara klinis terkait dengan periodontitis agresif (21). Meskipun koeksistensi mikrobiota periodontal
dalam kelompok sudah mapan, ada sedikit pemahaman tentang bagaimana strain yang berbeda saling
berdampingan. Akan menarik untuk menentukan bagaimana varians strain mendikte karakteristik
biofilm secara in vivo dan bagaimana dampaknya pada respons inang.
Biofilm campuran spesies memiliki dampak yang nyata terhadap aktivitas metabolik sel dan
kematian sel oleh apoptosis. Pola serupa kematian sel diamati dengan menggunakan setiap metode,
menunjukkan bahwa kematian sel epitel setelah terpapar multispesies biofilm adalah hasil kombinasi
apoptosis dan nekrosis. Guggenheim dkk. (19) mengamati bahwa sel epitel gingiva manusia
dikelompokkan dengan model biofilm sembilan spesies 'subgingival' mereka mengalami apoptosis
dalam waktu yang bergantung pada waktu pada jam 4 dan 24 jam. Studi yang menggunakan biopsi
jaringan gingival telah menunjukkan peningkatan tingkat apoptosis pada sampel periodontitis
dibandingkan dengan kontrol yang sehat, menunjukkan bahwa kerusakan jaringan oleh apoptosis
berperan dalam patogenesis periodontitis (22). Meskipun demikian, meski ada kematian sel, sel-sel
sehat yang tersisa dengan jelas merespons biofilm. Tidak jelas apakah ada perbedaan biologis apriori
antara sel yang menjaga viabilitas dan yang mati. Kematian sel yang meningkat dari waktu ke waktu
mengisyaratkan bahwa ini mungkin hanyalah gambaran dari kinetika paparan sel terhadap
penghinaan tersebut.
Simpulannya, data kami menunjukkan bahwa biofilm secara berbeda memodulasi respon
imun sel epitel berdasarkan komposisi biofilm. Karakterisasi rinci dari kebanyakan model sistem in
vitro yang menyelidiki interaksi inang patogen harus menghasilkan gambaran tentang peringatan dan
manfaat dari berbagai platform untuk aplikasi yang berbeda. Dengan menggunakan data ini, platform
dapat dipilih secara tepat untuk berbagai jaringan inang dalam ko-kultur dengan biofilm dan bantuan
dalam penelitian in vitro yang dilakukan untuk memahami patogenesis penyakit dan untuk
mengidentifikasi target terapeutik baru yang potensial untuk penyakit periodontal.

Kepentingan bersaing
EM, JM, DFL, SC dan GR tidak memiliki kepentingan bersaing. AJ, DB dan JP adalah semua karyawan
GlaxoSmithKline, sponsor penelitian ini

Kontribusi penulis
EM, JM dan AJ berpartisipasi dalam desain penelitian, melakukan penelitian eksperimental mengenai
biofilm, melakukan analisis statistik dan bertanggung jawab atas manuskrip tersebut. DFL
berpartisipasi dalam studi desain, analisis statistik dan membantu draft manuskrip tersebut. JY, DB
dan JP berkontribusi pada desain penelitian dan penulisan manuskrip supervized. GR dan SC
menyusun penelitian ini, berpartisipasi dalam desain penelitian dan analisis data dan bertanggung
jawab untuk menulis dan menyerahkan manuskrip terakhir. Semua penulis

Ucapan Terima Kasih

EM didanai melalui beasiswa BBSRC CASE (BB / J500318 / 1). Kami berterima kasih kepada
GlaxoSmithKline atas dukungan tambahan dari beasiswa EM dan AJ. SC didukung oleh Scottish Clinical
Research Fellowship. Margaret Mullin (Universitas Glasgow) atas bantuannya dalam memindai teknik
mikroskop elektron.