Ketika satu lingkaran pengenceran dikultur di atas piring, sebuah koloni tunggal terbentuk di

bawah kondisi ini ditentukan dalam tes pendahuluan. Maksimal enam strain diuji pada satu piring.
Setelah inkubasi, strain yang menunjukkan zona hijau di sekitar koloni tersebut dinilai memiliki
aktivitas seperti alfa-hemolitik (a-HLA) dan yang menunjukkan zona transparan dianggap memiliki
aktivitas seperti beta-hemolitik (b-HLA). Untuk menentukan kondisi optimal untuk C. jejuni untuk
mendeteksi bahwa hemolisis seperti alpha dideteksi ketika organisme dikultur secara mikroa dengan
konsentrasi CO2 yang tinggi dalam campuran gas dan hemolisis seperti beta diamati setelah
inkubasi yang berkepanjangan (dari pengamatan yang tidak dipublikasikan). Dalam penelitian ini,
kami menyelidiki kondisi kultur yang tepat untuk mendeteksi aktivitas hemolitik dari C. jejuni.
Streptococcus pyogenes (JCM5674) dan Streptococcus pneumoniae (L) masing-masing digunakan
sebagai beta-hemolysin dan produsen alpha-hemolysin.

Semua strain awalnya dikultur pada basis agar darah no. 2 (BAB) (Oxoid) piring yang
mengandung 5% darah kuda pada 378C selama 48 jam di bawah campuran gas 10% CO2, 5% H2,
5% O2, dan 80% N2. Setumpuk bakteri dari masing-masing strain diinokulasi ke dalam brucella
broth (BBL) dan diinkubasi pada suhu 378C selama 48 jam dalam kondisi mikroaerob seperti
dijelaskan di atas. Kultur kaldu kemudian diencerkan dengan 1 mM saline fosfat-buffer (pH 7,2)
menjadi 1024. Ketika satu lingkaran pengenceran dikultur di atas piring, sebuah koloni tunggal
terbentuk di bawah kondisi ini ditentukan dalam tes pendahuluan. Maksimal enam strain diuji pada
satu piring. Setelah inkubasi, strain yang menunjukkan zona hijau di sekitar koloni tersebut dinilai
memiliki aktivitas seperti alfa-hemolitik (a-HLA) dan yang menunjukkan zona transparan dianggap
memiliki aktivitas seperti beta-hemolitik (b-HLA). Untuk menentukan kondisi optimal C. jejuni untuk
mendeteksi LHA, kondisi kultur berikut diubah dan aktivitas hemolitik dibandingkan: suhu kultur (37
dan 428C), periode inkubasi (dari 1 hingga 7 hari), pH sedang (5,0 hingga 8,5) , Konsentrasi CO2
dalam campuran gas (dari 6,6 hingga 72,4%), medium basal (BAB, brucella agar [BRA] [BBL], agar
infus jantung [HIA] [Difco], agar infus jantung otak [BHIA] [Difco], Agar Mueller-Hinton [MHA] [Difco],
trypticase soy agar [BBL], atau kaldu nutrisi nomor 2 [Oksida] ditambah dengan agar 1,5% no. 1
[NA] [Oksida]) dan ditambah darah (kelinci, manusia, sapi, domba, kambing, kuda, atau darah
ayam). Sepuluh hingga 12 strain C. jejuni, termasuk beberapa dari sumber manusia atau hewan,
digunakan dalam penelitian ini. Komposisi masing-masing gas dihitung dengan pengukur tekanan
dengan volume atmosfer pada suhu dan tekanan standar, dan atmosfer yang mengandung 20%
​oksigen. Hidrogen tidak digunakan dalam percobaan ini. PH media diukur dengan pH meter CARDY
C-1 (Advantec Toyo Ltd., Tokyo), yang mampu mengukur pH dalam blok agar.
Semua strain disaring untuk aktivitas hemolitik dalam kondisi optimal yang ditentukan oleh tes
pendahuluan seperti dijelaskan di atas. Pelat agar darah dibuat dari BAB (pH 6,5) dengan darah
kelinci 5%, dan pelat yang diinokulasi diinkubasi pada suhu 378C selama 7 hari dalam kondisi
mikroaerob (62,8% N2, 4,2% O2, 33% CO2). Aktivitas hemolitik diamati melalui dinding kaca tanpa
membuka tabung dengan interval 24 jam selama 7 hari. S. pneumoniae L dan S. pyogenes
JCM5674 diinkubasi dalam kondisi yang sama, kecuali bahwa pelat yang diinokulasi hanya
diinkubasi pada suhu 378C, dan tidak ada atmosfer khusus yang disediakan.

a-HLA terlihat jelas ketika pH medium berkisar antara 6,0 hingga 6,5. Ketika pH medium
lebih rendah dari 5,7 atau lebih tinggi dari 7,2, a-HLA tidak terdeteksi meskipun bakteri dapat
tumbuh di piring agar darah. Pengurangan pH dengan penambahan CO2 ke medium lebih efektif
daripada penambahan HCl dalam menginduksi penampilan a-HLA (Tabel 1). Sebaliknya, b-HLA
tidak dapat dideteksi setelah 48 jam inkubasi, terlepas dari pH awal medium atau konsentrasi CO2
dari campuran gas. Dalam studi kursus waktu selama 7 hari, a-HLA muncul setelah 48 jam inkubasi
pada 378C atau setelah 24 jam inkubasi pada 428C (Tabel 2; Gambar 1A). Inkubasi lebih lanjut
pada kedua suhu menghasilkan hilangnya a-HLA (Gbr. 1B). Setelah inkubasi selama 3 hari pada
428C atau 6 hari pada 378C, a-HLA digantikan oleh zona transparan hanya segera di bawah
pertumbuhan bakteri tetapi tidak di sekitarnya (Gbr. 1C). Disimpulkan bahwa penampilan dan
hilangnya a-HLA ini berkorelasi dengan pH medium pembilasan yang terkait dengan pertumbuhan
bakteri (Tabel 2). Namun, penampilan b-HLA tidak berkorelasi dengan pH medium. b-HLA diamati
hanya setelah inkubasi jangka panjang, tidak pernah dalam fase awal pertumbuhan. S. pneumoniae
dan S. pyogenes yang digunakan untuk kontrol positif menunjukkan zona hijau atau zona
transparan, masing-masing, di sekitar koloni selama periode inkubasi (Gambar 1). Baik a- dan
b-HLA diamati dengan semua darah hewan yang digunakan dalam penelitian ini. BAB dan NA yang
dilengkapi dengan darah manusia atau kelinci sangat cocok untuk mendeteksi a-HLA. BAB, NA,
BHIA, dan BRA sangat baik untuk mendeteksi a-HLA, tetapi hanya aktivitas hemolitik yang lemah,
jika ada, yang diamati dalam media HIA atau MHA (Tabel 3). Namun, tidak ada perbedaan dalam
penampilan b-HLA antara media. Semua strain C. jejuni yang digunakan dalam penelitian ini
menunjukkan a- dan b-HLA dalam kondisi kultur optimal.

PH medium sekitar 7,0 dan konsentrasi 10% CO2 telah diadopsi oleh banyak laboratorium
untuk penanaman strain Campylobacter. Namun, a-HLA tidak dapat dideteksi dalam kondisi kultur
ini. Kami menemukan bahwa penampilan a-HLA tergantung pada pH sedang dan menurunkan pH
dengan penambahan konsentrasi tinggi CO2 ke fase gas menghasilkan deteksi. Tidak jelas apakah
zat seperti hemolysin tidak diproduksi pada pH tinggi atau apakah Campylobacter a-HLA tidak
muncul dalam kondisi ini bahkan jika mereka diproduksi. Selain itu, kami belum menyimpulkan
apakah zona hijau atau transparan adalah hemolisis sejati atau apakah b-HLA yang terdeteksi
dalam penelitian ini identik dengan yang dilaporkan oleh peneliti lain (2, 6-8). Jelas bahwa sekresi C.
jejuni bereaksi dengan eritrosit dan menghasilkan zona hijau di sekitar koloni. Reaksi dengan
eritrosit mungkin reversibel atau hanya terjadi pada kondisi khusus. Pemurnian dan karakterisasi
produk dari aktivitas hemolitik ini diperlukan untuk mengklarifikasi kontroversi ini tentang aktivitas
hemolitik strain Campylobacter.