LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM

PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

Validasi Metode Spektrofotometri UV-Vis dengan Standar Asam Galat

Raisya Safitri Rismawanti

260110170155

LABORATORIUM PENGEMBANGAN METODE ANALISIS

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2020
 VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETER UV-VIS
DENGAN STANDAR ASAM GALAT
Raisya Safitri Rismawanti260110170155

Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang

Abstrak

Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi metode analisis penetapan kandungan total fenolik
dalam obat herbal menggunakan spektrofotometer UV-Vis dengan asam galat sebagai standar.
Validasi metode dilakukan untuk membuktikan bahwa metode yang akan digunakan memberikan
hasil yang sesuai dengan peruntukannya. Parameter yang diuji dalam validasi metode ini
diantaranya adalah linearitas, LOD, LOQ, akurasi, repeatability, dan presisi inter-day. Dari
parameter-parameter validasi metode menunjukan hasil linearitas sebesar 0,9994; nilai akurasi
yang dinyatakan dalam %recovery sebesar 94,85%; nilai LOD dan LOQ sebesar 0,55 dan 1,74;
nilai repeatability yang dinyatakan dalam RSD 1,12; dan nilai presisi inter-day pada hari pertama
<2, sedangkan nilai presisi inter-day pada hari kedua dan ketiga >2.

Kata kunci: asam galat, parameter uji, spektrofotometer UV-Vis, validasi metode

Abstract

This study aims to validate the analytical method of determining the total phenolic content in
herbal medicine using UV-Vis spectrophotometer with gallic acid as the standard. Method
validation is carried out to prove that the method to be used gives results that are in accordance
with its purpose. The parameters tested in the validation of this method include linearity, LOD,
LOQ, accuracy, repeatability, and inter-day precision. From the parameters of the method
validation, the linearity results are 0.9994; the accuracy value stated in %recovery is 94.85%;
LOD and LOQ values of 0.55 and 1.74; the repeatability value stated in RSD 1.12; and the inter-
day precision value on the first day <2, while the inter-day precision value on the second and
third day >2.

Key word: gallic acid, parameters test, UV-Vis spectrophotometer, validation method
PENDAHULUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah
untuk melakukan validasi metode. Untuk alat
dan bahan yang digunakanan, diantaranya
timbangan analitik, labu ukur, kertas
Whatman no 41, pipet, spektrofotometri UV-
Vis, asam galat, serta pelarut. Prinsip dari
praktikum ini adalah hukum Lambert-Beer
yaitu, semakin besar absorbansi, maka akan
semakin besar juga kadar zat uji dalam
sampel. Hal ini disebabkan karena
absorbansi berbanding lurus dengan
konsentrasi pada sampel (Adeeniyo, 2013).
Validasi metode merupakan proses
yang menetapkan bahwa karakteristik
prosedur kerja memenuhi persyaratan untuk
tujuan penggunaan. Validasi metode analisis
ini biasa diperuntukan untuk metode Analisa
yang baru dibuat serta dikembangkan. Akan
tetapi, untuk metode yang sudah ada atau
tersedia serta baku (seperti AOAC, ASTM),
namun jika metode tersebut pertama kali
digunakan disebuah laboratorium, biasanya
tidak perlu dilakukan validasi metode, hanya
dilakukan verifikasi metode saja (Rohman,
2014). Pada validasi metode praktikum ini,
parameter uji yang dilihat diantaranya adalah
linearitas, LOD, LOQ, akurasi, dan presisi.
Lalu, asam galat digunakan sebagai standar
dalam melakukan metode validasi (Mashuni
et al, 2017).
Linearitas merupakan kemampuan
metode analisis memberikan respon yang
proporsional terhadap konsentrasi analit
dalam sampel. Untuk menentukan linearitas,
perlu menentukan titik konsentrasi terlebih
dahulu. Biasanya dalam praktek, cara untuk
menentukan titiknya dengan menggunakan
satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya
antara 50% -150% (Rohman, 2014).
Dalam validasi metode, studi akurasi
dan presisi merupakan dua elemen pengujian
yang sangat penting. Akurasi merupakan uji
yang dilakukan untuk mengukur kedekatan
nilai eksperimen dengan jumlah sebenarnya
dari substansi dalam matriks. Sedangkan
presisi adalah uji yang dilakukan untuk
mengukur seberapa dekat nilai yang
diperoleh dari masing-masing pengukuran
(Betz et al, 2011). Presisi dapat dinyatakan
dengan repeatability dan reproducibility.
Repeatability merupakan keseksamaan
metode jika dilakukan berulang kali oleh
analisis serta kondisi yang sama dalam
interval waktu yang singkat. Sedangkan
reproducibility adalah keseksamaan metode
Ketika dikerjakan pada kondisi yang
berbeda. Untuk reproducibility ini biasanya
dikerjakan dalam laboratorium yang
berbeda, selai itu dikerjakan juga dengan
peralatan , pereaksi, pelarut, serta analisis
yang berbeda juga (Rohman, 2014).
Kemudian LOD atau batas deteksi,
merupakan jumlah atau konsentrasi terkecil
analit yang dapat terdeteksi dalam sampel
atau media tertentu oleh instrument. Menurut
Farmakope Amerika, mendefinisikan LOD
sebagai 3 kali baseline noise. Hal ini berasal
dari asumsi bahwa 3 kali baseline akan
berisikan sekitar100% data dari distribusi
normal (USP, 2009). Batasan lain yang perlu
dipertimbangkan adalah batas kuantifikasi
atau LOQ. LOQ merupakan jumlah terkecil
dari suatu analit yang masih dapat dilakukan Akurasi
kuantifikasi (Sugihartini et al, 2014).
Dilakukan penimbangan sampel obat herbal
Linearitas ditentukan dari hasil sebanyak 100 mg kemudian masukkan
regresi yang diploting pada absorbansi kedalam labu ukur 100 mL. Lalu, dilakukan
larutan standar. Kemudian untuk LOD dan penimbangan standar asam galat 13,5 mg
LOQ dapat ditentukan dari hubungan antara untuk konsentrasi 80%, 15 mg untuk
standar deviasi dari linearitas dan konsentrasi 100% dan 16,5 mg untuk standar
kemiringan, menggunakan pengali yang 120% dan tambahkan kedalam labu ukur
sesuai. Untuk akurasi, dievaluasi tadi. Kemudian larutkan dengan pelarut
berdasarkan recovery (Bueno et al, 2011). hingga tanda batas. Setelah itu, saring larutan
Selanjutnya untuk presisi dapat dilihat dari dengan kertas saring Whatman No. 41, lalu
nilai %RSD yang dapat diterima jika <2% pipet 1 mL dan dimasukkan kedalam labu
(Wrasse-Sangoi et al, 2010). ukur 10 mL.

METODE Repeatability

Linearitas, LOD, & LOQ Dilakukan penimbangan standar asam galat

10 mg lalu ditambahkan kedalam labu ukur
Pertama-tama dilakukan penimbangan
100 ml. Kemudian larutkan dengan pelarut
standar kadar asam galat sebanyak 100 mg
hingga tanda batas. Setelah itu, saring larutan
kemudian larutkan dalam 100 ml. (larutan
dengan kertas saring Whatman No. 41, lalu
standar 1). Lalu, pipet larutan standar
pipet 1 mL dan masukkan kedalam labu ukur
sebanyak 1 mL masukkan kedalam labu ukur
10 mL. Blanko pelarut (A=0,0001).
10 mL, encerkan hingga 10 mL dengan
pelarut (larutan standar 2). Setelah itu, buat Interday Presisi
kurva dengan memipet larutan standar 2
Dilakukan penimbangan sampel obat herbal
sesuai dengan tabel dibawah dan kemudian
sebanyak 100 mg kemudian masukkan
encerkan hingga 10 mL dengan pelarut.
kedalam labu ukur 100 mL. Kemudian,
Kemudian dilakukan pengukuran pada
timbang standar asam galat 7,5 mg, 10 mg
Panjang gelombang 256 nm.
dan 15 mg tambahkan kedalam labu ukur
Volume standar 2 tadi. Lalu, larutkan dengan pelarut hingga
Kurva Kalibrasi
(mL )
tanda batas. Setelah itu, saring larutan
Standar I 0,25
Standar II 0,5 dengan kertas saring Whatman No. 41, lalu
Standar III 0,75 pipet 1 mL dan masukkan kedalam labu ukur
Standar IV 1
Standar V 1,5 10 mL. Prosedur kalibrasi dilakukan sama
Standar VI 2 dengan day 1. Hasil massa timbang asam
galatnya sama.
HASIL

Linearitas, LOD dan LOQ

Didapatkan kurva baku asam galat sebagai berikut:

Kurva Baku Asam Galat

1
0,9 y = 0,0418x + 0,0242
R² = 0,9994
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25

• Diketahui persamaan dari kurva baku asam galat sebagai berikut:

y = 0,0418x + 0,0242
• Diketahui rumus untuk menentukan LOD sebagai berikut:
LOD = 3,3 x SD/Slope
• Diketahui rumus untuk menentukan LOQ sebagai berikut:
LOQ = 10 x SD/Slope
• Didapatkan hasil linearitas, LOD, dan LOQ:

Linearitas LOD LOQ

0,994 0,575 1,742

Akurasi

Diketahui rumus untuk menentukan %recovery sebagai berikut:

[𝐶]𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙+𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒−[𝐶]𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
%Recovery =
[𝐶] 𝑆𝑝𝑖𝑘𝑒

Didapatkan hasil %recovery:

Asam galat yang Rata-rata C

Konsentrasi Rata-rata
ditambahkan sampel + SD %RSD %Recovery
(%) absorbansi
(mg) spike
13,5 0,6536667
80% 13,51 0,6473333 15,00053163 0,081454 0,543009 88,393532
13,47 0,6526667
 14,99 0,748
100% 14,95 0,7433333 17,28123339 0,066878 0,386998 95,3031623
15,01 0,7483333
16,5 0,848
120% 16,5 0,8433333 19,67357788 0,066878 0,339938 100,854681
16,45 0,8483333

Repeatability dan Presisi Interday

Diketahui rumus untuk menentukan %RSD sebagai berikut:

𝑆𝐷
%RSD = x 100%
𝑋 𝑏𝑎𝑟

Didapatkan hasil %RSD untuk repeatability:

(+) Asam galat Absorbansi C C rata-rata SD %RSD

0,113 2,124402
0,112 2,100478
0,11 2,052632
10 mg 2,096491228 0,023521 1,121938
0,112 2,100478
0,112 2,100478
0,112 2,100478

Didapatkan kurva baku interday 1, 2, dan 3 sebagai berikut:

Kurva Baku Day 1

1
0,9 y = 0,0418x + 0,0242
0,8 R² = 0,9994
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25
 Kurva Baku Day 2
1
0,9 y = 0,0419x + 0,0215
0,8 R² = 0,9989

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25

Kurva Baku Day 3

1
0,9 y = 0,0419x + 0,0215
0,8 R² = 0,9989

0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25

Didapatkan hasil %RSD dari presisi interday 1, 2, dan 3:

Interday 1 Interday 2 Interday 3

%RSD
0,819323939 11,67682802 14,84549411
1,149336966 6,721284564 4,266924586
0 3,192720383 3,516854432
PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan
pengujian validasi metode spektrofotometri
UV-Vis dengan menggunakan asam galat
sebagai standar. Digunakannya asam galat
sebagai standar karena asam galat memiliki
kemurnian yang tinggi. Berikut merupakan
struktur kimia dari asam galat:
Spektrofotometri UV-Vis ini dapat
mendeteksi senyawa yang memiliki Panjang
gelombang disekitar rentang 200 – 800 nm.
Prinsip kerja dari spektrofotometri UV-Vis
adalah semakin besar absorbansi maka akan
semakin besar juga konsentrasi analit dari
suatu sampel. Sedangkan untuk mekanisme
kerja dari spektrofotometri UV-Vis sendiri
adalah pertama pada alat tersedia sumber
cahaya yang kemudian diteruskan ke
collimator (lensa), setelah itu diteruskan
Kembali ke monokromator kemudian
menuju larutan uji. Intensitas cahaya yang
melewati larutan uji dibandingkan dengan
intensitas cahaya awal, dan intensitas cahaya
yang diserap oleh larutan sebanding dengan
sinyal elektrik yang dibaca oleh detector.
Metode standarisasi yang digunakan
pada praktikum ini adalah standar adisi.
Standar adisi ini menggunakan matriks
standar serta sampel yang sama. Standar dan
sampel dibuat dalam larutan yang sama.
Konsentrasi standar yang telah ditambahkan
sampel harus masuk ke dalam regresi linear
kurva kalibrasi yang digunakan. Syarat dari
standar yang dimasukan ke dalam sampel
adalah harus mempunyai kemurnian yang
tinggi.
Pada praktikum ini pertama-tama
dilakukan uji linearitas. Dinyatakan linear
Ketika berbanding lurus hubungan antara
respon metode dan konsentrasi analit dalam
matriks. Untuk mengetahui linearitas,
terlebih dahulu dilakukan pembuatan kurva
baku. Dari kurva baku didapatkan persamaan
y = 0,0418x + 0,0242. Data linearitas
diperoleh dari persamaan regresi yang
diplotkan pada absorbansi larutan standar
asam galat. Pada praktikum ini didapatkan
hasil linearitas sebesar 0,9994. Berdasarkan
literatur, linearitas yang didapatkan pada
praktikum ini memenuhi persyaratan, karena
nilainya lebih besar dari 0,995. Hasil
linearitas menunjukan angka yang (+), hal ini
menunjukan bahwa terjadi korelasi positif
yang ditandai dengan arah garis yang miring
kea rah kanan.
Setelah dilakukan uji linearitas,
selanjutnya dilakukan penentuan LOD dan
LOQ. LOD adalah konsentrasi terkecil analit
yang dapat terdeteksi. Sedangkan LOQ
adalah konsentrasi terkecil analit yang dapat
dikuantifikasi atau dihitung. LOD dapat
merupakan parameter yang dapat
dipengaruhi oleh perubahan kecil dalam
system analysis, seperti suhu, kemurnian
reagen, efek matriks, dll. Nilai LOD yang
didapat dari praktikum ini sebesar 0.575, bahwa nilai RSD yang didapat memenuhi
sedangkan untuk nilai LOQ sebesar 1,742. persyaratan, karena nilai RSDnya <2.

Selanjutnya, setelah dilakukan Kemudian, dilakukan penentuan

penentuan nilai LOQ dan LOD, dilakukan presisi interday. Presisi interday ini
penentuan akurasi. Akurasi sendiri dilakukan pada tempat dan waktu yang
ditentukan dari %recovery dari sampel yang berbeda. Uji presisi ini dapat menentukan
dispike atau biasa disebut dengan standar atau mencerminkan kesalahan acak yang
adisi. Akurasi ini dapat menggambarkan terjadi dalam sebuah metode. Presisi interday
kesalahan atau error yang terjadi saat ini dilakukan dalam 3 hari. Dalam penentuan
melakukan kesalahan analisis. Secara presisi, pertama-tama dilakukan pembuatan
keseluruhan, nilai akurasi yang diperoleh kurva baku setiap hari pengujiannya. Dalam
dari praktikum ini memenuhi persyaratan, kurva baku hari pertama, didapatkan
yaitu berada dalam rentang 85%-115%. persamaan y = 0,0418x + 0,0242. Kemudian
untuk persamaan hari kedua didapatkan
Pada penentuan akurasi suatu
persamaan y = 0,0419x + 0,0215.
metode, biasanya terjadi kesalahan-
Selanjutnya yang terakhir, persamaan hari
kesalahan yang menyebabkan nilai akurasi
ketiga adalah y = 0,0419x + 0,0215. Setelah
tidak mencapai 100%. Kesalahan-kesalahan
dilakukan pembuatan kurva baku, ditentukan
tersebut biasanya didapatkan dari kesalahan
nilai RSDnya. Untuk nilai RSD hari pertama
personal, seperti salah melakukan pemipetan,
yaitu 0,82; 1,15; dan 0. Untuk itu dapat
kesalahan dalam penimbangan atau
disimpulkan bahwa nilai RSD dihari pertama
kesalahan sistematis, seperti kesalahan dari
memenuhi persyaratan, karena nilainya <2.
peralatan gelas atau instrument. Kesalahan
Kemudian untuk nilai RSD hari kedua yaitu
yang tidak bisa dihindarkan adalah kesalahan
11,68; 6,72; 3,19. Dari hasil tersebut dapat
dari peralatan, karena setiap alat gelas pasti
disimpulkan bahwa presisi interday hari
menyumbang kesalahan. Untuk itu, agar
kedua tidak memenuhi syarat, dikarenakan
meminimalisirnya Ketika melakukan
nilainya >2. Selanjutnya yang terakhir, untuk
pengujian harus menggunakan alat gelas
presisi interday hari ketiga didapatkan nilai
dengan merk yang sama.
RSD 14,84; 4,3; 3,5. Seperti presisi interday
Setelah itu dilakukan penentuan 2, presisi interday 3 juga tidak memenuhi
repeatability. Repeatability ini dikerjakan persyaratan karena nilai RSD nya >2. Ketika
pada hari yang sama dengan peralatan, uji presisi hasilnya tidak memenuhi
tempat, dan bahan yang sama juga. persyaratan, maka harus dilakukan perunutan
Repeatability ini ditentukan dengan nilai Kembali pengujian, karena seperti yang
RSD atau biasa disebut dengan koefisien sudah dijelaskan bahwa presisi inidapat
variasi. Pada praktikum ini untuk mencerminkan kesalahan acak yang terjadi
repeatability didapatkan hasil RSD sebesar dalam sebuah metode.
1,12%. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan
SIMPULAN Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
Pharmacianna. Vol 4(2): 111 115.
Metode penentuan kandungan senyawa
dalam obat herbal dengan spektrofotometer USP. 2009. USP 32 NF 27: United State
UV-Vis sudah berhasil divalidasi. Metode ini Pharmacopeia and National
dapat digunakan secara akurat, karena Formulary Supplement 2. Rocville:
memiliki nilai rata-rata %recovery 94,85%. USP.
Akan tetapi belum memiliki nilai presisi
Wrasse-Sangoi., Leonardo T.S., Isabel F.D.,
yang baik, karena nilai RSD yang didapat
Clarice M.B.R., Maximiliano, d.S.S.
dari pengujian presisi interday kedua dan
2010. Development and Validation of
ketiga >2.
an UV Spectrophotometric Method
DAFTAR PUSTAKA for The Determination of aliskiren in
tablets. Quimic Nova. Vol. 33 No. 6.
Adeeniyo, C. E. 2013. Basic Calibration of
UV/Vis Spectrophotometer.
International Journal of Science
and Technology. 2(3) : 247-251.

Betz, J., Paula, N., dan Mark, C. 2011.

Accuracy, Precision, and Reliability
of Chemical Measurements in
Natural Products Research.
Fitoterapia. Vol 82: 44-52.

Mashuni, Yanti, N.A., Jahiding, M., dan

Edihar, M. 2017. Validation of UV-
Vis Spectrophotometric Method of
Bio oil Total Phenolic Content from
Pyrolisis of Cashew Nut Shell.
Research Journal of Pharmaceutical,
Biological and Chemical Science.
Vol. 8 (3) : 1745 - 1752.

Rohman, A. 2014. Validasi dan Penjaminan

Mutu Metode Analisis Kimia.
Yogyakarta: UGM Press.

Sugihartini, N., Achmad, F., Suwidjiyo, P.,

dan Sismindari. 2014. Validasi
Metode Analisa Penetapan Kadar
Epigalokatekin Galat dengan