MANAJEMEN LABORATORIUM

KULTUR SEL

PELATIHAN
TEKNIK DASAR KULTUR SEL MAMALIA DAN
APLIKASI DALAM BIDANG FARMASI

Oleh: Dr. Tjandrawati Mozef

Cibinong, 15-17 Mei 2013

KULTUR SEL, APLIKASI:

Studi struktur dan fungsi sel

Studi toksikologi

Pengembangan obat

Produksi protein/protein rekombinan

Diagnosis

Pengobatan
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium
PRINSIP UTAMA

Aseptis/sterilitas

Bebas debu
DESAIN LABORATORIUM

6 area utama:

Area steril/aseptis

Area inkubasi

Area preparation

Area cuci

Area sterilisasi

Area penyimpanan

Bila hanya tersedia 1 ruangan, susun area berdasarkan
gradien sterilitas: area steril berada disisi terjauh dari
pintu, lalu area inkubasi, preparasi dan penyimpanan. Area
terdekat dengan pintu adalah area pencucian dan
sterilisasi

Area Steril:

Tempat melakukan pekerjaan kultur sel, tidak bercampur dengan pekerjaan menyangkut
bahan kimia atau mikroorganisma (bakteri, yeast)

Biosafety cabinet/laminar flow, meja untuk menyimpan peralatan steril, mikroskop inverted

Terletak di bagian paling sepi dari lalu lintas manusia dan barang (sisi paling jauh dari pintu)
untuk menghindari adanya debu dan kontaminasi

Batasi jumlah orang yang bekerja

Area inkubasi:

CO2 incubator atau “hot room 37oC”

Udara bersih, minimum lalu lintas manusia dan barang

Area preparasi:

Water bath, centrifuge, timbangan analitik, pHmeter, osmometer

Preparasi media, buffer

Area cuci

Bak cuci untuk membersihkan peralatan gelas dan plastik, peniris, oven

Area sterilisasi

Autoclave, oven,

Area penyimpanan

Penyimpanan peralatan steril:

Lemari: larutan steril (larutan garam, air) disimpan pada suhu ruang. Peralatan gelas dan plastik,
sarung tangan, filter, syringue

Lemari es: media kultur (4oC), serum, trypsin, glutamin (-20oC)

Tangki nitrogen cair

Akses mudah untuk mengambil dan menyimpan
 Contoh Layout Laboratorium
• Satu ruangan • Dua ruangan
YANG PERLU DIPERHATIKAN

Ruangan disuplai oleh udara steril/filter

Didesain untuk mudah dibersihkan

Lantai, meja kerja dan dinding harus rata/tidak bergelombang,
tahan air, dilapisi oleh vinyl, resistan terhadap bahan kimia
(alkali, solven, desinfektan) dan keretakan (terutama di tempat
penyimpanan tangki nitrogen cair)

Ventilasi:

Tekanan dalam ruangan:

Tekanan positif terhadap ruangan sekitar, untuk menghindari influx udara
terkontaminasi dari luar

Bila menggunakan material yang bersumber dari manusia, gunakan area
terpisah dengan tekanan negatif (Category I)

Bila ada 2 ruangan dengan tekanan berbeda (positif dan negatif), perlu
dibuat zona buffer/zona transisi. ex. Ruang preparasi, ruang mikroskop,
koridor

Jendela harus tertutup/tidak bercelah

Akses ruangan: Pintu cukup lebar dan tinggi

Bahan yang akan digunakan untuk kultur sel harus
dipastikan bebas dari kontaminan (bakteri, fungi,
mikoplasma)

Karantina (pada ruangan terpisah): diperlukan bila
pertama kali diterima cell line/sel hasil biopsi dari manusia
maupun hewan yang mungkin mengandung kontaminan

Meja kerja dibersihkan dengan cermat dengan desinfektan
sebelum dan sesudah bekerja

Biasakan memulai pekerjaan dari yang kurang beresiko
kontaminasi dan diakhiri dengan yang paling beresiko

Gunakan jas lab khusus, sarung tangan, sepatu tertutup
saat bekerja di lab kultur
Pemeliharaan Lab kultur

Rutin dibersihkan:

Lantai, meja kerja

Biosafety cabinet

Inkubator CO2: resiko terhadap kontaminasi jaur dan bakteri
tinggi

Rutin dicek:

Biosafety cabinet: airflow, filter HEPA

Inkubator CO2: temperatur, level CO2
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator
CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium
Peralatan di Lab Kultur Sel

1. Biosafety Cabinet

Menjamin lingkungan steril
sehinggamencegah terjadinya
kontaminasi

Udara luar yang masuk
difilter dan dibersihkan dari
partikel sebelum
dihembuskan ke dalam ruang
kabinet

Dilengkapi dengan lampu UV
untuk mensterilisasi ruang
kabinet saat tidak digunakan

Mode laminar (bukan turbulen):

Kecepatan antara 0,2 – 0,8 m/s

Aliran/flux sejajar

Aliran pada bidang tegak lurus dari flux, kecepatan tidak
melebihi 20% dari kecepatan flux

Perlu diperhatikan:

Hindari pergerakan cepat

Hindari penempatan obyek yang menghalangi aliran flux

Bersihkan laminar dengan alkohol 70%

Klasifikasi:

Berdasarkan derajat proteksi terhadap manipulator

Kelas I, II, III atau 100, 10.000, 100.000

Aliran flux horizontal atau vertikal

BSC – Kelas I:

Proteksi terhadap
manipulator dan lingkungan

Tidak melindungi kultur sel
dari kontaminasi

Material dengan resiko
moderat

BSC-Kelas II:

Proteksi terhadap manipulator,
kultur sel dan lingkungan

Sub-klasifikasi berdasarkan
metoda sirkulasi udara yang
digunakan

3 karakteristik:

Aliran udara dari depan dibatasi

Aliran udara vertikal difilter oleh
HEPA-filtered Tipe A1 Tipe A2

Udara yang dikeluarkan difilter
dengan HEPA

Tipe A:Udara dialirkan keluar
melewati filter HEPA dan
penutup/canopy

Tipe B: Tidak ada resirkulasi
udara pada area kerja. Banyak
digunakan di lab toksikologi
Tipe B1 Tipe B2

BSC-Kelas III

Isolasi total material yang
digunakan

Digunakan untuk manipulasi
dengan material biologis
dengan resiko tinggi

Perlindungan total terhadap
manipulator, material biologis
dan lingkungan
2. Inverted microscopes

Digunakan untuk mengamati sel
terutama yang melekat di
bawah “plate” kultur

Lensa obyektif di bawah “stage”
dan lensa okuler di atas “stage”

Lensa obyektif dengan
perbesaran 4X, 10X, 20X dan
kadang-kadang 40X

“Phase rings” atau fasa kontras
digunakan untuk melihat
struktur sel lebih transparan
dan lebih jelas.
3. Clinical Centrifuge

Digunakan untuk
mengendapkan atau
memekatkan sel.

Gunakan kecepatan
rendah untuk menghindari
kerusakan sel. Umumnya
untuk rutin 1000 - 1500
rpm selama 5 menit.
4. Incubator CO2

Memberikan lingkungan yang ideal
untuk pertumbuhan sel

Inkubator harus dapat diatur suhu
sesuai pertumbuhan sel (umumnya
37oC untuk sel mamalia) dan harus
konstan

Inkubator harus dapat diatur
kelembabannya. Biasanya digunakan
wadah berisi aquadest steril untuk
memberikan kelembaban tertentu.
Wadah air harus secara rutin
dibersihkan/diganti karena sumber
kontaminasi mikroorganisme.

Gas CO2 diperlukan untuk menjaga
keseimbangan pH media kultur.
Umumnya digunakan 5% CO2 dimana
reaksi dengan buffer bicarbonate
dalam media kultur akan menstabilkan
pH sekitar 7,4.
5. Water bath (37oC)

Media dan larutan yang
digunakan untuk kultur sel
biasanya disimpan di 4oC.
Sebelum digunakan, panaskan
terlebih dahulu dalam water bath
(37oC) untuk menghindari
kematian sel karena perbedaan
ekstrim suhu.

Water bath harus rutin
dibersihkan dan diganti dengan
aquadest karena sumber
kontaminasi mikroorganisma

Botol/wadah setelah dipanaskan
harus disemprot dengan alkohol
sebelum dimasukkan kedalam
BSC.
6. Refrigerator, freezers

Media, reagen dan larutan
yang digunakan untuk kultur
sel umumnya disimpan di
refrigerator 4oC.

Beberapa reagen harus
disimpan di freezer -20oC

Diperlukan juga deep freezer
untuk menyimpan reagen
tertentu atau stok sel yang
disimpan untuk jangka
pendek

Untuk penyimpanan stok sel
jangka panjang, digunakan
kontainer nitrogen cair (-196
oC).
7. Container untuk limbah berbahaya
(Biohazard waste)

Limbah dikumpulkan
dalam wadah yang sesuai
untuk diproses lebih lanjut
(destruksi/insinerasi) Benda tajam Organ/ jaringan
Darah, cairan tubuh hewan

Limbah padat Limbah cair

8. Cell culture
vessels

Umumnya sel membutuhkan
sesuatu untuk melekat agar
dapat membelah dan
tumbuh.

“Vessel” untuk kultur sel
biasanya dari bahan plastik
polistiren dan dilapisi poly-L-
lysine atau laminin atau
gelatin atau fibronektin
sehingga sel dapat
menempel.
9. Pipettes dan Mikropipet

Pipet digunakan untuk
mentransfer cairan dengan
volume relatif besar.Yang
sering digunakan dalam
kultur sel adalah volume 1 –
25 ml. Digunakan dengan
bantuan pompa elektrik
atau manual.

Mikropipet digunakan untuk
mentransfer cairan dengan
volume kecil, umumnya
antara 1 – 1000 ul
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator
CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium

Penanganan limbah menyangkut keamanan

Kultur sel beresiko terhadap kontaminasi material
berbahaya

Diperlukan personalia dengan latar belakang pendidikan
memadai dan terlatih

Material berbahaya:

Bahan kimia: telah diketahui derajat bahayanya

Material biologis: biasanya kurang diketahui efek bahayanya,
terutama hasil manipulasi genetika

Organisme termodifikasi secara genetika

Harus secara ketat dikontrol dan diatur penggunaannya

Mengacu pada regulasi/guideline: GMSC (Genetic Modification Safety
Committee), www.europe.osha.eu.int

Desinfektasi/Dekontaminasi:

Terutama terhadap limbah kultur, permukaan meja kerja, peralatan

Gunakan personal protective equipment (sarung tangan, jas lab)

Kategori desinfektan:

Hipoklorit (sodium hipoklorit, NaClO):

Desinfektan umum

Efektif untuk virus

Korosif terhadap metal (tidak digunakan untuk sentrifuge)

Dibuat fresh

Penggunaan umum untuk permukaan meja kerja(1000ppm), pipet/tip (2500ppm), limbah kultur
sel (10000ppm)

Fenolik: tidak digunakan untuk kultur sel

Alkohol:

Konsentrasi efektif 70% (atau 60-70% untuk isopropanol)

Efektif untuk bakteri, virus (tidak efektif untuk non-enveloped viruses)

Isopropanol tidak efektif untuk virus

Aldehida (formaldehida):

Iritan

Digunakan di area dengan ventilasi baik

Untuk fumigasi ruang lab

Pembuangan limbah kultur sel:

Limbah dibuang secara teratur, tidak ditumpuk (little and often)

Limbah kultur sel (media kultur):

Inaktivasi dalam larutan hipoklorit (10.000ppm) selama 2 jam

Pipet terkontaminasi:

Inaktivasi dalam larutan hipoklorit (2500ppm) selama semalam

Destruksi/insinerasi

Limbah solid (flask, tabung sentrifuge, sarung tangan, tissue dll)

Tempatkan dalam wadah plastik tebal

Destruksi/insinerasi

Bila memungkinkan lakukan insinerasi daripada destruksi
dengan autoclave
ASPEK UMUM KEAMANAN

Bahan gelas dan tajam:

Bahan gelas yang pecah (pipet, jarum suntik) sering
menyebabkan luka

Tempat pembuangan khusus bahan gelas dan tajam: container
plastik tebal/metal

Bahan kimia:

Gunakan sarung tangan: nitrile gloves

Hindari penggunaan bahan bubuk/aerosol di dalam laminar

Bahan radioaktif
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator
CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium
PREPARASI REAGEN DAN MATERIAL

Bahan gelas atau larutan stok hanya digunakan untuk
keperluan kultur sel

Penggunaan disposable material untuk membatasi
pencucian

Penggunaan deterjen yang mampu mengangkat residu
secara total (ex. 7X, MP Biomedicals)
STERILISASI

Semua bahan/alat yang akan kontak dengan kultur sel harus
disterilisasi

Material yang tahan suhu tinggi (metal, gelas, plastik
termostabil) dapat disterilisasi dengan dry heat (suhu minimum
160oC, selama 1 jam)

Material yang tetap stabil terhadap panas (air, larutan garam)
dapat disterilisasi dengan autoclave (1 bar, 121oC selama 15-20
menit)

Material yang labil terhadap panas (plastik) disterilisasi dengan
γ-irradiation (60Co, 135Cs, 25 kGy)

Larutan yang labil terhadap panas (medium, larutan buffer,
protein, antibiotik) disterilisasi dengan filtrasi (filter 0,22 µm)

Alat-alat gelas:

Gunakan deterjen netral/bukan alkalin bila alat gelas digunakan
untuk kultur sel

Alat gelas yang kotor, jangan dibiarkan, setidaknya diberi
desinfektan (sodium hipoklorit)

Cuci dengan banyak air untuk menghilangkan deterjen lalu bilas
dengan aquadest

Keringkan dalam posisi terbalik

Sterilisasi dry heat atau autoclave
Metode Sterilisasi
Reagen dan Media

Sterilisasi dengan membran filtrasi

Air pro injection bebas pirogen
Sterilisasi alat-alat gelas
Sterilisasi pipet gelas
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator
CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium
 PENYIMPANAN SEL ATAU
CRYOPRESERVATION

Cell line tidak disarankan untuk dikultur secara terus

menerus tetapi secara berkala disimpan dengan metoda
cryopreservation:

Resiko kontaminasi mikroba

Hilang karakteristik sel tertentu (antigen, ekspresi antibodi
monoklonal) hingga sel itu sendiri karena melebihi waktu hidup
(human diploid cells/MRC-5)

Genetic drift pada sel dengan kariotipe tidak stabil (CHO,
BHK21)

Resiko kontaminasi silang dengan cell line lain

Prinsip dasar untuk cryopreservation: proses pembekuan
(freezing) yang lambat dan proses pencairan (thawing) yang cepat

Proses pembekuan dengan penurunan suhu -1oC sampai -3oC per
menit

Proses pencairan dengan inkubasi dalam water bath (37oC)
selama 3-5 menit

Sel dalam kultur harus sehat dengan viabilitas > 90% serta tidak
tampak kontaminasi mikroba

Sel dalam fase eksponensial, sub-konfluen, penggantian fresh media
kurang dari 24 jam

Menggunakan konsentrasi tinggi serum (> 20%)

Menggunakan cryoprotectant, DMSO (dimetil sulfoksida) atau
gliserol. Konsentrasi final DMSO: 10%

Penyimpanan dalam nitrogen cair
KONTROL INVENTARISASI

Penyimpanan dalam nitrogen cair menggunakan rak untuk
memudahkan penyimpanan dan pengambilan sel

Pencatatan:

Setiap vial diberi label (identitas sel, tanggal)

Lokasi penyimpanan setiap vial dicatat di buku “storage plan”

Setiap vial yang ditaruh/diambil harus dicatat dan buku “storage
plan” harus diperbaharui
GOOD CELL BANKING PRACTICES

Master Cell Banking system

Saat penerimaan sel: harus dipastikan bahwa tidak ada
kontaminasi mikroba

Perbanyakan pertama, 3-5 vial harus dibekukan sebagai Token
Stock sebelum Master Cell Bank

1 vial dari Token Stock diperbanyak untuk Master Cell Bank
(10-20 vial)

2-3 vial dari Master Cell Bank digunakan untuk monitoring
kontrol kualitas: jumlah sel, viabilitas, bebas kontaminasi bakteri,
fungi, mycoplasma, test tambahan (infeksi viral dan test
autentisitas)

Bila memenuhi syarat, 1 vial dikultur sebagai Working Cell Bank
dan kontrol kualitas kembali dimonitor

Bila memenuhi syarat, kultur digunakan untuk eksperimen rutin
atau untuk produksi
 New Cell Line
(Quarantine)
SKEMA CELL
BANKING Token freeze of 3-5 Fail
ampoules and initial
SYSTEM QUARANTINE
FACILITY
mycoplasma test
Pass

MAIN CELL CULTURE Resuscitate 1 ampoule Abandon banking procedure

FACILITY and expand in culture

Cryopreservation of Master
Bank (10-100 ampoules)

Quality Control Test

Cell count & viability Fail
Microbial QC incl.mycoplasma
Authentication test
Pass

Resuscitate 1 ampoule Repeat Banking

and expand in culture

Cryopreservation of Working Bank

(20-200 ampoules)

Quality Control Test

Cell count & viability Fail
Microbial QC incl. mycoplasma
Authentication test

Pass
Release for use Repeat Banking
KEGUNAAN IMPLEMENTASI SISTEM
BANKING

Untuk menjamin kualitas kultur sel yang konsisten

Eksperimen dilakukan terhadap kultur sel dengan passage
yang sama

Sel hanya dikultur bila diperlukan

Karakteristik awal dari cell line terjaga
AGENDA

Desain laboratorium

Pengetahuan tentang biosafety cabinet dan inkubator
CO2

Penanganan limbah

Sterilisasi

Inventarisasi dan pemeliharaan stok kultur sel

Keamanan bekerja di laboratorium
ASPEK KEAMANAN DALAM LAB
KULTUR SEL

Kajian resiko (Risk assessment):

Tujuan: mencegah terjadinya luka, menghindari bahaya terhadap
manipulator dan lingkungan

Terdiri dari 2 unsur:

Identifikasi dan evaluasi resiko

Cara untuk menghindari dan mengurangi resiko

Derajat resiko tergantung jenis sel yang digunakan

Klasifikasi:

Resiko rendah: non human/non primate continuous cell lines,
beberapa human continuous cell lines

Resiko menengah: mammalian cell lines belum/kurang terkarakterisasi

Resiko tinggi:

Primary cell dari jaringan manusia/primate atau dari darah

Cell line dengan patogen endogenus

Cell line yang diinfeksikan secara eksperimental

Tindakan mengurangi resiko:

Containment

Hindari penanganan material berbahaya di luar ruangan kultur

Good laboratory practice, good bench techniques: kerapian, reagen diberi
label dan disimpan di tempat sesuai, hindari tindakan tergesa-gesa
(memipet, menuang)

Manipulator yang bekerja dengan sel atau material yang berasal dari
manusia hendaknya divaksinasi Hepatitis B

Staf telah mendapat pengetahuan tentang teknik dan keamanan bekerja
kultur sel

Biohazard:

Virus patogen

Medium kultur sel

Kontaminasi mikoplasma

Produk dari sel

Sel termodifikasi: hibrid, transforman, sel yang mengandung DNA
rekombinan

Kultur sel sendiri: dapat terjadi transformasi/modifikasi genetika yang
menyebabkan penyakit malignan atau ekspresi tidak biasa/normal
protein aktif.
RISK ASSESSMENT

Jenis dan jumlah material berbahaya yang digunakan

Penggunaan/penanganan material tersebut

Seberapa sering menggunakan

Tindakan protektif yang dilakukan

Peningkatan resiko bahaya, misalnya karena material
terpapar panas/dingin, aliran listrik
Unsur-unsur Risk Assessment

Operator:

Pengalaman: keahlian, latar belakang

Training:

Pakaian/jas lab: sesuai, dipakai dengan benar, bersih, tidak rusak

Peralatan:

Usia alat

Kesesuaian penggunaan: kapasitas sampel

Stabilitas mekanik: penempatan alat

Listrik: koneksi, kontak dengan air, stabilitas

Jenis sampel: aerosol, uap toksik

Panas: ventilasi yang baik

Maintenance

Kesiapan alat: dekontaminasi, akses

Resiko fisik:

Dingin ekstrim: rasa menyengat, baal

Shock listrik: tidak sadar, gangguan jantung

Api: listrik, bahan kimia

Resiko bahan kimia (termasuk gas dan cairan volatil):

Jumlah yang digunakan

Derajat toksisitas: poisonous, carcinogenic, teratogenic, mutagenic,
corrosive, irritant, allergenic

Reaksi dengan air, pelarut: panas, efervesent

Zat volatil: inhalasi, asphyxia

Transportasi: pecah, tumpah

Penyimpanan: akses, aman

Biohazard:

Patogenisitas

Jumlah: sel, DNA

Manipulasi genetika: host, vektor

Containment: ruangan, kabinet, prosedur

Radioisotop:

Emisi: tipe, energi, penetrasi, interaksi, waktu paruh

Volatilitas: inhalasi, penyebaran

Jenis: [3H] thymidine (prekursor DNA)

Legalitas

Kondisi khusus:

Kehamilan: resiko terhadap fetus, teratogenisitas

Sakit: daya tahan menurun

Obat imunosupresan: immunodeficiency

Luka: meningkatkan resiko absorpsi

Alergi: powder (deterjen), aerosol, kontak (sarung tangan karet)

Prosedur:

Jumlah: bahan, alat, manipulator

Kompleksitas: tahapan, opsi

Durasi: waktu proses, inkubasi, penyimpanan

Akses
REGULASI TERKAIT KEAMANAN

Harus ada di setiap lab

Benchmarking:

Occupational Safety and Health Administration (OSHA):
www.osha-occupational-health-and-safety.com

Management of health and safety at work regulations:
www.hmso.gov.uk/si/si1999/19993242.htm

Biosafety in microbiological and biomedical laboratories:
www.orcbs.msu.edu/biological/BMBL/BMBL-1.htm
PUSTAKA

Freshney R.I. Culture of Animal Cells, a Manual of Basic
Technique, 1994

Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, U.S.
Department of Health and Human Services, Centers for
Disease Control and Prevention, National Institutes of Health,
2009

The Approved List of biological agents, Advisory Committee
on Dangerous Pathogens, 2004

Selecting, Evaluating and Using Sharps Disposal Containers, U.S.
Department of Health and Human Services, Centers for
Disease Control and Prevention, National Institute for
occupational safety and health, 1998

Guidelines for Chemical Waste Management in Laboratories,
Environmental Health and Safety Office
TERIMA KASIH