ELISA Handbook - En.id

Buku Pegangan ELISA
Prinsip, Pemecahan Masalah, Persiapan Sampel

dan Protokol Pengujian ……
https://www.bosterbio.com/ebooks
Daftar Isi Halaman
1. Perkenalan ………………………………………………………………………... 2
2. Prosedur Umum ELISA ………………………………………………………… ... 2
3. Jenis ELISA ………………………………………………………………………… 3
• ELISA Langsung ………………………………………………………………….… 4

• ELISA Tidak Langsung …………………………………………………………………… 4
• Sandwich ELISA ………………………………………………………………… 5
• ELISA Kompetitif ……………………………………………………………… 5
4. Interpretasi Data ELISA ……………………………………………………………. 6
5. Persiapan Sampel ……………………………………………………………………. 7
• Supernatan Kultur Sel …………………………………………………………. 7

• Ekstrak Sel ……………………………………………………………………… 7
• Media Berkondisi ……………………………………………………………… .. 7

• Ekstrak Jaringan …………………………………………………………………… ... 8
6. Protokol yang Direkomendasikan ………………………………………………………………. 9

• Persiapan Reagen ……………………………………………………………… ... 9
• Sandwich ELISA ……………………………………………………………………… 10
• ELISA Tidak Langsung ……………………………………………………………………. 12
• ELISA Langsung ……………………………………………………………………… 14
• ELISA Kompetitif …………………………………………………………………… 16
7. Panduan mengatasi masalah ………………………………………………………………….. 19
• Lemah atau Tidak Ada Sinyal ………………………………………………………………… .. 19
• Sinyal Jenuh …………………………………………………………………… .. 20
• Latar Belakang Tinggi ………………………………………………………………… .... 21
• Sensitivitas Rendah ………………………………………………………………………… 23
• Kurva Standar Buruk ……………………………………………………………… ... 24
• Data Replikasi Buruk …………………………………………………………………. 25
• Hasil Assay-to-Assay yang Tidak Konsisten …………………………………………………. 26
• Perkembangan Warna Lambat ……………………………………………………………. 26
• Masalah Pencitraan Plat ……………………………………………………………… 27
8. Tanya Jawab ……………………………………………………………………………………… .. 28
9. Informasi Pemesanan ……………………………………………………………………. 30
1
pengantar
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) adalah teknik pengujian berbasis plat yang dirancang untuk mendeteksi dan
mengukur peptida, protein, antibodi dan hormon. Dalam ELISA, antigen harus diimobilisasi ke permukaan padat dan kemudian
dikomplekskan dengan antibodi yang dihubungkan ke enzim. Deteksi dilakukan dengan menilai aktivitas enzim terkonjugasi
melalui inkubasi dengan substrat untuk menghasilkan produk yang dapat diukur. Unsur terpenting dari strategi deteksi adalah
interaksi antibodi-antigen yang sangat spesifik.
ELISA biasanya dilakukan di pelat polistiren 96-lubang (atau 384-sumur), yang secara pasif akan mengikat antibodi dan protein. Pengikatan
dan imobilisasi reagen inilah yang membuat ELISA sangat mudah untuk dirancang dan dijalankan. Reaktan ELISA yang diimobilisasi ke
permukaan pelat mikro memudahkan untuk memisahkan ikatan dari bahan tidak terikat selama pengujian. Kemampuan untuk membersihkan
bahan yang tidak terikat secara spesifik ini menjadikan ELISA alat yang ampuh untuk mengukur analit spesifik dalam sediaan kasar.
Prosedur ELISA Umum
Kecuali Anda menggunakan kit dengan pelat yang sudah dilapisi antibodi, ELISA dimulai dengan a lapisan langkah, di mana lapisan pertama, yang terdiri
dari antigen target atau antibodi, diadsorpsi ke pelat polistiren 96-sumur. Ini diikuti dengan a pemblokiran langkah di mana semua situs tidak terikat dilapisi
dengan agen pemblokiran. Setelah serangkaian pencucian, pelat tersebut diinkubasi dengan antibodi terkonjugasi enzim. Serangkaian pencucian
lainnya menghilangkan semua antibodi yang tidak terikat. SEBUAH substrat kemudian ditambahkan, menghasilkan sinyal kalorimetrik. Akhirnya, piringnya
Baca.
Karena pengujian menggunakan pengikatan permukaan untuk pemisahan, beberapa pencucian diulangi di setiap langkah ELISA untuk menghilangkan bahan
yang tidak terikat. Selama proses ini, sangat penting bahwa kelebihan cairan dibuang untuk mencegah pengenceran larutan yang ditambahkan pada langkah
pengujian berikutnya. Untuk memastikan keseragaman, mesin cuci piring khusus sering digunakan.
ELISA bisa sangat kompleks dan mencakup beberapa langkah intervensi, terutama saat mengukur konsentrasi protein dalam sampel heterogen
seperti darah. Langkah yang paling kompleks dan bervariasi dalam keseluruhan proses adalah deteksi, di mana beberapa lapisan antibodi dapat
digunakan untuk memperkuat sinyal.
Untuk dilanjutkan di halaman berikutnya
2
Jenis ELISA
ELISA dapat dilakukan dengan sejumlah modifikasi pada prosedur dasar: langsung, tidak langsung, sandwich
atau kompetitif. Langkah kunci, imobilisasi antigen yang diinginkan, dapat dilakukan dengan adsorpsi langsung ke pelat uji atau secara
tidak langsung melalui antibodi penangkap yang telah dipasang ke pelat. Antigen kemudian dideteksi baik secara langsung (antibodi
primer berlabel enzim) atau tidak langsung (antibodi sekunder berlabel enzim). Antibodi pendeteksi biasanya diberi label dengan alkaline
phosphatase (AP) atau horseradish peroksidase (HRP). Banyak pilihan substrat tersedia untuk melakukan ELISA dengan konjugat HRP
atau AP. Pemilihan substrat bergantung pada sensitivitas pengujian yang diperlukan dan instrumentasi yang tersedia untuk deteksi sinyal
(spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer).
Di antara format pengujian standar yang dibahas dan diilustrasikan di bawah ini, di mana perbedaan dalam penangkapan dan deteksi menjadi
perhatian, penting untuk membedakan antara strategi tertentu yang ada secara khusus untuk deteksi langkah. Namun antigen ditangkap ke piring
(dengan adsorpsi langsung ke permukaan atau melalui antibodi "penangkap" pra-dilapisi, seperti dalam sandwich ELISA), itu adalah langkah
deteksi (baik sebagai deteksi langsung atau tidak langsung) yang sangat menentukan sensitivitas ELISA.
3
1. ELISA langsung
Untuk deteksi langsung, antigen yang dilapisi ke multi-well plate dideteksi oleh antibodi yang telah dikonjugasikan secara langsung ke enzim.
Metode deteksi ini adalah pilihan yang baik jika tidak ada kit ELISA yang tersedia secara komersial untuk protein target Anda.
Keuntungan
• Cepat karena hanya satu antibodi dan lebih sedikit langkah yang digunakan.
• Reaktivitas silang antibodi sekunder dihilangkan.
Kekurangan
• Imunoreaktivitas dari antibodi primer mungkin terpengaruh secara merugikan oleh pelabelan dengan enzim atau tag.
• Memberi label pada antibodi primer untuk setiap sistem ELISA tertentu memakan waktu dan mahal. Tidak ada fleksibilitas dalam
• pemilihan label antibodi primer dari satu percobaan ke percobaan lainnya. Amplifikasi sinyal minimal.
2. ELISA Tidak Langsung
Untuk deteksi tidak langsung, antigen yang dilapisi ke pelat multi-sumur dideteksi dalam dua tahap atau lapisan. Pertama, antibodi
primer tanpa label, yang khusus untuk antigen, diterapkan. Selanjutnya, antibodi sekunder berlabel enzim terikat ke antibodi pertama.
Antibodi sekunder biasanya merupakan antibodi antispesies dan seringkali poliklonal. Uji tidak langsung, format paling populer untuk
ELISA, memiliki kelebihan dan kekurangan:
Keuntungan
• Berbagai macam antibodi sekunder berlabel tersedia secara komersial.
• Serbaguna karena banyak antibodi primer dapat dibuat dalam satu spesies dan antibodi sekunder berlabel yang sama dapat digunakan
untuk deteksi.
• Imunoreaktivitas maksimum dari antibodi primer dipertahankan karena tidak diberi label.
• Sensitivitas meningkat karena setiap antibodi primer mengandung beberapa epitop yang dapat diikat oleh antibodi sekunder
berlabel, memungkinkan penguatan sinyal.
Kekurangan
• Reaktivitas silang mungkin terjadi dengan antibodi sekunder, menghasilkan sinyal nonspesifik.
• Langkah inkubasi ekstra diperlukan dalam prosedur ini.
4
3. Sandwich ELISA
Sandwich ELISA biasanya memerlukan penggunaan pasangan antibodi yang cocok, di mana setiap antibodi spesifik untuk bagian yang
berbeda dan tidak tumpang tindih (epitop) dari molekul antigen. Antibodi pertama (dikenal sebagai antibodi penangkap) dilapisi ke sumur.
Larutan sampel kemudian ditambahkan ke dalam sumur. Antibodi kedua (dikenal sebagai antibodi pendeteksi) mengikuti langkah ini untuk
mengukur konsentrasi sampel. Jenis ELISA ini memiliki keunggulan sebagai berikut:
• Spesifisitas tinggi: antigen / analit ditangkap dan dideteksi secara spesifik
• Cocok untuk sampel yang kompleks (atau kasar / tidak murni): antigen tidak memerlukan pemurnian sebelum pengukuran
• Fleksibilitas dan sensitivitas: baik metode deteksi langsung maupun tidak langsung dapat digunakan
4. ELISA Kompetitif
Peristiwa utama ELISA kompetitif (juga dikenal sebagai ELISA penghambatan) adalah proses reaksi kompetitif antara antigen
sampel dan antigen yang terikat ke lubang pelat mikrotiter dengan antibodi primer. Pertama, antibodi primer diinkubasi dengan
antigen sampel dan kompleks antibodi-antigen yang dihasilkan ditambahkan ke sumur yang telah dilapisi dengan antigen yang
sama. Setelah masa inkubasi, setiap antibodi yang tidak terikat dicuci. Semakin banyak antigen dalam sampel, semakin banyak
antibodi primer yang akan terikat pada antigen sampel. Oleh karena itu, akan ada jumlah yang lebih kecil dari antibodi primer
yang tersedia untuk mengikat antigen yang dilapisi pada sumur, menghasilkan reduksi sinyal. Keuntungan utama dari jenis
ELISA ini muncul dari kepekaannya yang tinggi terhadap perbedaan komposisi dalam campuran antigen kompleks,
5
Ringkasan Langkah-Langkah Kunci dalam Berbagai Jenis ELISA
Tidak langsung Langsung Sandwich Kompetitif

Tangkap Lapisan Ab X X √ X
Lapisan Antigen √ √ X √
Pemblokiran √ √ √ √
Inkubasi Sampel (Antigen) X X √ √
Inkubasi Ab Primer √ √ √ √
Inkubasi Ab Sekunder √ X √ √
Persiapan Substrat √ √ √ √
Deteksi Sinyal √ √ √ √
Analisis data √ √ √ √
Interpretasi Data ELISA
Uji ELISA menghasilkan tiga jenis keluaran data:
1) Kuantitatif: Data ELISA dapat diinterpretasikan sebagai perbandingan dengan kurva standar (pengenceran serial yang diketahui,
antigen yang dimurnikan) untuk menghitung dengan tepat konsentrasi antigen dalam berbagai sampel.
2) Kualitatif: ELISA juga dapat digunakan untuk mencapai jawaban ya atau tidak yang menunjukkan apakah antigen tertentu
hadir dalam sampel, dibandingkan dengan sumur kosong yang tidak mengandung antigen atau antigen kontrol yang tidak terkait.
3) Semi-Kuantitatif: ELISA dapat digunakan untuk membandingkan tingkat relatif antigen dalam sampel uji, sejak
intensitas sinyal akan bervariasi secara langsung dengan konsentrasi antigen.
Data ELISA biasanya digambarkan dengan kepadatan optik vs konsentrasi log untuk menghasilkan kurva sigmoidal seperti yang ditunjukkan di bawah ini.
Konsentrasi antigen yang diketahui digunakan untuk menghasilkan kurva standar dan kemudian data ini digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel yang
tidak diketahui dengan membandingkan bagian linier dari kurva standar. Faktanya, ini adalah wilayah linier yang relatif panjang dari kurva yang membuat hasil
ELISA akurat dan dapat direproduksi. Konsentrasi yang tidak diketahui dapat ditentukan secara langsung pada grafik atau dengan perangkat lunak penyesuaian
kurva yang biasanya ditemukan pada pembaca pelat ELISA.
6
Persiapan Sampel
Prosedur di bawah ini memberikan panduan umum untuk persiapan sampel yang umumnya diuji untuk digunakan dalam pengujian ELISA. Di Boster, kami
sedang mengerjakan protokol persiapan sampel terperinci kami yang mencakup lebih dari 20 jenis sampel dan berharap untuk memperbarui buku pegangan ini
dalam waktu dekat. Silakan periksa literatur untuk eksperimen yang serupa dengan Anda untuk pengembangan pengujian baru Anda. Umumnya:
• Konsentrasi ekstrak protein minimal 1-2 mg / mL.
• Ekstrak sel dan jaringan diencerkan hingga 50% dengan buffer pengikat.
• Sampel disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4 ° C untuk menghilangkan endapan sebelum digunakan.
1. Supernatan Kultur Sel
Sentrifugasi media kultur sel pada 1.500 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ° C. Aliquot supernatant segera dan tahan
- 80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.
2. Ekstrak Sel
Tempatkan pelat kultur jaringan di atas es. Keluarkan media dan bersihkan sel sekali dengan PBS dingin. Lepaskan PBS dan tambahkan buffer ekstraksi
0,5 ml per pelat 100 mm. Miringkan pelat dan kikis sel menjadi tabung yang telah diisi sebelumnya. Vortex sebentar dan inkubasi di atas es selama 15-30
menit. Centrifuge pada 13.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ° C (ini menghasilkan pelet dari konten yang tidak dapat larut). Masukkan supernatan ke
dalam tabung yang bersih dan dingin (di atas es) dan simpan sampel pada -80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.
3. Media Berkondisi
Tempatkan sel dalam media pertumbuhan lengkap (dengan serum) sampai tingkat pertemuan yang diinginkan tercapai. Keluarkan media pertumbuhan dan
cuci sel dengan lembut menggunakan 2 - 3 mL PBS hangat. Ulangi langkah pencucian. Hapus PBS dan tambahkan media pertumbuhan bebas serum
dengan lembut. Inkubasi selama 1-2 hari. Keluarkan media ke dalam tabung sentrifus. Centrifuge pada 1.500 rpm selama 10 menit pada suhu 4 ° C. Aliquot
supernatan dan simpan sampel pada -80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.
7
4. Ekstrak Jaringan
Cincang jaringan di atas es dalam buffer dingin, sebaiknya dengan adanya protease inhibitor. Tempatkan jaringan dalam tabung sentrifugal mikro dan
celupkan ke dalam nitrogen cair agar membeku. Simpan sampel pada -80 ° C untuk digunakan nanti atau simpan di dalam es untuk homogenisasi segera.
Untuk setiap 5 mg jaringan, tambahkan 300 µL buffer ekstraksi ke tabung dan homogenkan:
• 100 mM Tris, pH 7,4

• 150 mM NaCl
• EGTA 1 mM
• 1 mM EDTA
• 1% Triton X-100 0,5%
• 0,5% natrium deoksikolat
(Bagian penyangga ini dapat disiapkan sebelumnya dan disimpan pada suhu 4 ° C. Segera sebelum digunakan, penyangga harus dilengkapi dengan
koktail penghambat fosfatase [seperti yang diarahkan oleh produsen], koktail penghambat protease [seperti yang diarahkan oleh produsen] dan
PMSF hingga 1 mM untuk menghasilkan solusi buffer ekstraksi lengkap.)
Bilas bilah homogenizer dua kali dengan penyangga ekstraksi 300 µL. Tempatkan sampel pada pengocok bersuhu 4 ° C selama 2 jam.
Sentrifugasi sampel selama 20 menit pada 13.000 rpm pada 4 ° C. Masukkan supernatan ke dalam tabung yang sudah didinginkan sebelumnya di dalam
es. Jaga sampel pada -80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.
Catatan: Volume buffer lisis harus ditentukan sesuai dengan jumlah jaringan yang ada. Konsentrasi khas dari ekstrak protein
akhir paling sedikit 1 mg / mL.
8
Protokol yang Direkomendasikan
Persiapan Reagen
1. Solusi Standar
• 10.000 pg / mL: Tambahkan 1 mL sampel buffer pengencer ke dalam satu tabung standar (10 ng per tabung) dan aduk rata. Catatan:
Simpan larutan ini pada 4 ° C hingga 12 jam (atau -20 ° C selama 48 jam) dan hindari siklus freezethaw.
• 5.000 pg / mL: Campurkan 0,3 mL 10.000 pg / mL dengan 0,3 mL sampel buffer pengencer dan aduk rata.
• 2.500 pg / mL: Campurkan 0,3 mL 5.000 pg / mL dengan 0,3 mL sampel buffer pengencer dan aduk rata.
• Lakukan pengenceran yang serupa sampai larutan standar dengan konsentrasi berikut (pg / mL) dibuat:
1.250, 625, 312, 156 dan 78.
• Tambahkan 100 µL dari setiap larutan standar yang diencerkan ke sumur kosong yang sesuai. Ulangi dalam rangkap dua atau rangkap tiga untuk
akurasi.
Catatan: Solusi standar paling baik digunakan dalam 2 jam.
2. Antibodi Biotinilasi
• Hitung total volume yang dibutuhkan untuk pengujian dengan mengalikan 0,1 mL / sumur dan jumlah sumur yang diperlukan. Tambahkan 2-3 sumur
ekstra ke jumlah sumur yang dihitung untuk memperhitungkan kemungkinan kesalahan pemipetan.
• Hasilkan volume antibodi yang diencerkan dengan melakukan pengenceran 1: 100 (Untuk setiap 1 µL antibodi pekat,
tambahkan 99 µL buffer pengenceran antibodi) dan aduk rata.
3. Avidin-Biotin-Peroksidase (ABC)
• Hitung total volume yang dibutuhkan untuk pengujian dengan mengalikan 0,1 mL / sumur dan jumlah sumur yang diperlukan. Tambahkan 2-3 sumur
ekstra ke jumlah sumur yang dihitung untuk memperhitungkan kemungkinan kesalahan pemipetan.
• Hasilkan volume larutan ABC yang diencerkan dengan melakukan pengenceran 1: 100 (Untuk setiap larutan ABC pekat 1 µL,
tambahkan 99 µL penyangga pengenceran ABC) dan aduk rata.
Catatan: Larutan ABC yang diencerkan tidak boleh disiapkan lebih dari 1 jam sebelum percobaan.
9
Sandwich ELISA
Semua kit ELISA dari Boster menggunakan format sandwich dan avidin-biotin kimia. Tes ELISA kami memerlukan pengenceran
larutan standar, antibodi terbiotinilasi (antibodi pendeteksi) dan avidin-biotinperoksidase.
1. Menangkap Lapisan Antibodi
(Langkah-langkah ini tidak diperlukan jika kit ELISA Picokine yang telah teradsorpsi dari Boster digunakan)
• Encerkan antibodi penangkap hingga konsentrasi akhir 1-10 μg / mL dalam pelapis antigen bikarbonat / karbonat ff er (100 mM NaHCO 3 dalam
air deionisasi; pH disesuaikan menjadi 9,6). Pipet 100 μL antibodi yang diencerkan ke setiap lubang pada pelat mikrotiter.
•
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi pada suhu 4 ° C semalaman (atau 37 ° C selama 30 menit).
• Hapus larutan pelapis dan cuci piring 3X dengan penyangga 200 μL PBS (Phosphate Buffered Saline)
(10 mM Na 2 HPO 4 dan 1,8 mM NaH 2 PO 4 dalam air deionisasi dengan 0,2% Tween 20; pH Disesuaikan menjadi 7,4) dengan selama 5 menit
setiap kali. Larutan pelapis / pencucian dapat dihilangkan dengan menjentikkan pelat
wastafel. Tetes yang tersisa dapat dihilangkan dengan menepuk piring di atas handuk kertas atau dengan aspirasi. Jangan biarkan sumur
mengering kapan saja.
2. Pemblokiran
(Langkah-langkah ini tidak diperlukan jika kit ELISA Picokine yang telah teradsorpsi dari Boster digunakan)
• Pipet 200 μL memblokir bu ff er (5% b / v susu kering tanpa lemak dalam buffer PBS) per sumur untuk memblokir situs pengikatan protein sisa. Sebagai
alternatif, BSA atau BlockACE dapat digunakan untuk menggantikan susu kering tanpa lemak.
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 1-2 jam pada suhu 37 ° C (atau 4 ° C semalaman).
• Hapus larutan pemblokiran dan cuci piring 2X dengan 200 μL PBS selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti yang
dijelaskan pada langkah pelapisan.
3. Persiapan Reagen
• Persiapkan larutan standar encer, antibodi terbiotinilasi dan larutan ABC seperti yang ditunjukkan pada hal.9.
4. Sampel (Antigen) Inkubasi
• Encerkan sampel secara serial dengan pemblokiran bu ff eh segera sebelum digunakan. Pengenceran yang optimal harus
ditentukan dengan uji titrasi menurut produsen antibodi.
• Pipet 100 μL dari masing-masing larutan sampel yang diencerkan dan kontrol ke setiap sumur kosong. Ulangi dalam rangkap dua atau rangkap
tiga untuk akurasi. Kontrol negatif harus sesuai dengan spesies dan isotipe serta imunoglobulin nonspesifik yang diencerkan dalam buffer PBS.
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 2 jam pada suhu kamar.
• Buang isi sumur dan cuci 3X dengan 200 μL PBS bu ff eh selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti
yang dijelaskan pada langkah pelapisan.
5. Inkubasi Antibodi Biotinilasi
• Pipet 100 μL antibodi yang diencerkan ke sumur dengan kontrol, larutan standar, dan sampel yang diencerkan.
10
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C (atau 2 jam pada suhu kamar). Waktu inkubasi ini harus
cukup untuk menerima sinyal yang kuat. Namun, jika sinyal lemah diamati, lakukan inkubasi semalaman pada suhu 4 ° C untuk mendapatkan
sinyal yang lebih kuat.
• Keluarkan konten dalam sumur dan cuci 3X dengan 200 μL PBS selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti yang
6. Inkubasi ABC
• Pipet 100 μL larutan ABC yang diencerkan ke sumur dengan kontrol, larutan standar dan sampel yang diencerkan.
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi selama 0,5 jam pada suhu 37 ° C.
• Buang isi sumur dan cuci 3X dengan 200 μL PBS bu ff er selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti yang
7. Persiapan Substrat
Siapkan larutan media segera sebelum digunakan atau bawa media yang telah dibuat sebelumnya ke suhu kamar. Dua enzim yang
banyak digunakan untuk deteksi sinyal adalah peroksidase lobak kuda (HRP) dan alkali fosfatase (AP), dan substrat yang sesuai, larutan
penghenti, panjang gelombang absorbansi deteksi, dan warna yang dikembangkan adalah sebagai berikut:
Enzim Substrat * Hentikan Solusi Warna Absorbansi (nm) Dikembangkan

HRP TMB 2 juta jam 2 BEGITU 4 450 Kuning
AP pNPP 0,75 juta NaOH 405 Kuning
* TMB: 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine; pNPP: p-nitrofenil-fosfat
catatan:
• Media TMB harus disimpan pada suhu 37 ° C selama 30 menit sebelum digunakan.
• Hidrogen peroksida juga dapat bertindak sebagai substrat untuk HRP.
• Sodium azide adalah penghambat HRP. Jangan menyertakan azida dalam buffer atau larutan pencuci jika konjugat berlabel HRP digunakan untuk
deteksi.
8. Deteksi Sinyal
• Pipet 90 μL larutan substrat ke sumur dengan kontrol, larutan standar dan sampel yang diencerkan.
• Inkubasi piring pada 37 ° C dalam gelap. Jika TMB digunakan, warna biru akan terlihat di sumur dengan larutan paling pekat. Sumur
lain mungkin tidak menunjukkan warna yang jelas.
• Warna harus dikembangkan dalam sumur positif setelah 15 menit. Setelah perkembangan warna yang memadai, pipet 100 μL larutan stop
ke sumur yang sesuai (jika perlu).
• Baca absorbansi (OD: Densitas Optik) masing-masing sumur dengan pembaca pelat.
9. Analisis Data
• Siapkan kurva standar menggunakan data yang dihasilkan dari larutan standar yang diencerkan. Gunakan absorbansi pada sumbu Y (linier) dan
konsentrasi pada sumbu X (skala log).
• Tafsirkan konsentrasi sampel dari kurva standar.
11
ELISA tidak langsung
Ini adalah protokol umum di mana lapisan antigen dan pemblokiran mungkin tidak diperlukan jika sumur dari pabrik telah diserap
sebelumnya dengan antigen.
1. Lapisan Antigen
• Encerkan antigen yang telah dimurnikan hingga konsentrasi akhir 1-10 μg / mL dalam lapisan antigen bikarbonat / karbonat bu ff er (100 mM NaHCO 3 dalam
air deionisasi; pH disesuaikan menjadi 9,6). Pipet 100 μL antigen yang diencerkan ke setiap lubang di pelat mikrotiter.
•
2. Pemblokiran
3. Persiapan Reagen
• Persiapkan larutan standar encer seperti yang ditunjukkan pada hal.9.
4. Inkubasi Antibodi Primer
• Encerkan antibodi primer pilihan secara berurutan dengan memblokir bu ff eh. Pengenceran yang optimal harus ditentukan
dengan uji titrasi menurut produsen antibodi.
• Pipet 100 μL dari setiap antibodi yang diencerkan per sumur. Ulangi dalam rangkap dua atau rangkap tiga untuk akurasi. Kontrol negatif harus
sesuai dengan spesies dan isotipe serta imunoglobulin non-spesifik yang diencerkan dalam buffer PBS.
• Hapus larutan antibodi encer dan cuci sumur 3X dengan 200 μL PBS selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti yang
5. Inkubasi Antibodi Sekunder
• Encerkan antibodi sekunder terkonjugasi secara seri dengan pemblokiran bu ff eh segera sebelum digunakan. Pengenceran
yang optimal harus ditentukan dengan uji titrasi menurut produsen antibodi.
12
• Pipet 100 μL larutan antibodi sekunder yang diencerkan ke setiap lubang.

catatan:
deteksi.
7. Deteksi Sinyal
• Pipet 90 μL larutan substrat ke dalam sumur dengan kontrol dan larutan standar.
• Warna harus dikembangkan dalam sumur positif setelah 15 menit. Setelah pengembangan warna yang memadai, pipet 100 μL larutan stop
ke sumur (jika perlu).
8. Analisis Data
13
ELISA langsung
1. Lapisan Antigen
• Encerkan antigen yang telah dimurnikan hingga konsentrasi akhir 1-10 μg / ml dalam lapisan antigen bikarbonat / karbonat bu ff er (100 mM NaHCO 3 dalam
air deionisasi; pH disesuaikan menjadi 9,6). Pipet 100 μL antigen yang diencerkan ke setiap lubang di pelat mikrotiter.
•
• Tutupi piring dengan plastik perekat dan inkubasi pada suhu 4 ° C semalaman (atau 37C selama 30 menit).
2. Pemblokiran
3. Persiapan Reagen
• Encerkan antibodi primer terkonjugasi secara berurutan dengan memblokir bu ff eh segera sebelum digunakan. Pengenceran yang
optimal harus ditentukan dengan uji titrasi menurut produsen antibodi.
14
catatan:
• Sodium azide adalah penghambat HRP. Jangan menyertakan azida dalam buffer atau larutan pencuci jika konjugat berlabel HR digunakan
untuk deteksi.
6. Deteksi Sinyal
• Pipet 90 μL larutan substrat ke dalam sumur dengan kontrol dan larutan standar.
• Warna harus dikembangkan dalam sumur positif setelah 15 menit. Setelah pengembangan warna yang memadai, pipet 100 μL larutan
penghenti ke sumur (jika perlu).
7. Analisis Data
15
ELISA Kompetitif
1. Lapisan Antigen
• Encerkan antigen yang telah dimurnikan hingga konsentrasi akhir 20 μg / ml dalam lapisan antigen bikarbonat / karbonat bu ff er (100 mM NaHCO 3 dalam
air deionisasi; pH disesuaikan menjadi 9,6).
• Pipet 100 μL antigen yang diencerkan ke setiap lubang di pelat mikrotiter.
(10 mM Na 2 HPO 4 dan 1,8 mM NaH 2 PO 4 dalam air deionisasi dengan 0,2% Tween 20; pH Disesuaikan menjadi 7,4) dengan selama 5 menit setiap
kali. Larutan pelapis / pencucian dapat dihilangkan dengan menjentikkan pelat di atas a
wastafel. Tetes yang tersisa dapat dihilangkan dengan menepuk piring di atas handuk kertas atau dengan aspirasi. Jangan biarkan sumur mengering
kapan saja.
2. Pemblokiran
• Pipet 200 μL memblokir bu ff er (5% b / v susu kering tanpa lemak dalam buffer PBS) per sumur untuk memblokir situs pengikat protein sisa. Sebagai
3. Persiapan Reagen
4. Sampel (Antigen) Inkubasi

• Encerkan sampel secara serial dengan pemblokiran bu ff eh segera sebelum digunakan. Pengenceran yang optimal harus ditentukan
• Pipet 100 μL sampel yang diencerkan ke setiap sumur.
• Buang isi sumur dan cuci 3X dengan 200 μL PBS bu ff eh selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti
yang dijelaskan pada langkah pelapisan.
• Encerkan antibodi primer pilihan secara berurutan dengan memblokir bu ff eh. Pengenceran yang optimal harus ditentukan
• Pipet 100 μL dari setiap antibodi yang diencerkan per sumur. Ulangi dalam rangkap dua atau rangkap tiga untuk akurasi. Kontrol negatif harus
sesuai dengan spesies dan isotipe serta imunoglobulin non-spesifik yang diencerkan dalam buffer PBS.
16
• Hapus larutan antibodi encer dan cuci sumur 3X dengan 200 μL PBS selama 5 menit setiap kali. Jentikkan pelat dan tepuk pelat seperti yang
6. Inkubasi Antibodi Sekunder
• Encerkan antibodi sekunder terkonjugasi secara seri dengan pemblokiran bu ff eh segera sebelum digunakan. Pengenceran yang
optimal harus ditentukan dengan uji titrasi menurut produsen antibodi.

catatan:
deteksi.
8. Deteksi Sinyal
• Pipet 90 μL larutan substrat ke sumur dengan kontrol, larutan standar dan sampel yang diencerkan.
• Inkubasikan piring pada 37C dalam gelap. Jika TMB digunakan, warna biru akan terlihat di sumur dengan larutan paling pekat. Sumur
• Warna harus dikembangkan dalam sumur positif setelah 15 menit. Setelah pengembangan warna yang memadai, pipet 100 μL larutan
penghenti ke sumur (jika perlu).
17
9. Analisis Data
• ELISA kompetitif menghasilkan kurva kebalikan: Nilai antigen yang lebih tinggi dalam sampel menghasilkan jumlah perubahan warna yang lebih kecil.
18
Panduan mengatasi masalah
Panduan berikut berfungsi sebagai daftar periksa untuk kemungkinan penyebab dan solusi sehubungan dengan beberapa masalah yang
paling sering ditemui dari tes ELISA.
1. Lemah atau Tidak Ada Sinyal
Kemungkinan penyebabnya Larutan

1 Memblokir protein dalam pelapisan Menghilangkan pemblokiran protein dari larutan larutan pelapis
2 Menangkap antibodi (atau antigen) tidak menggunakan pelat ELISA, bukan pelat kultur jaringan yang tidak terikat
ke pelat
Coba waktu pelapisan lebih lama
Meningkatkan konsentrasi komponen pelapis
3 Masalah dengan standar Gunakan sampel baru
Periksa apakah standar ditangani dengan tepat
4 Waktu inkubasi terlalu singkat Ikuti pedoman produsen (Jika masalah berlanjut, coba inkubasi sampel pada
suhu 4 ° C semalaman)
5 Suhu inkubasi terlalu rendah Pastikan inkubasi dilakukan pada suhu yang benar
Sebelum melanjutkan, semua reagen, termasuk pelat, harus pada

suhu kamar atau sesuai anjuran pabrik
6 Jenis sampel tidak kompatibel Gunakan sampel yang pengujiannya diketahui mendeteksi kontrol positif (Sertakan kontrol
tersebut dalam eksperimen Anda)
7 Buffer pengujian tidak kompatibel Pastikan buffer pengujian kompatibel dengan target yang diminati
8 Target ada di bawah deteksi Kurangi faktor pengenceran atau batas sampel konsentrat
10 Salah / Tidak Cukup / Tidak Periksa identitas media

substrat
Tingkatkan konsentrasi atau jumlah substrat
Ikuti pedoman pabrik
11 Salah / Tidak Cukup / Tidak Periksa identitas antibodi

antibodi
Ulangi pengujian dengan konsentrasi antibodi yang lebih tinggi untuk menemukan yang
optimal untuk eksperimen Anda
12 Antibodi disimpan pada suhu 4 ° C untuk beberapa Gunakan alikuot antibodi segar yang telah disimpan pada suhu -20 ° C atau
minggu atau mengalami pengulangan di bawah siklus
freeze-thaw
19
13 Salah reagen ditambahkan / Periksa protokol, pastikan reagen yang benar ditambahkan dengan benar
siap; Reagen hilang memesan dan disiapkan untuk mengoreksi konsentrasi (mis. TMB untuk antibodi
berlabel HRP)
14 Reagen kadaluwarsa / terkontaminasi Buat dan gunakan reagen segar / tidak terkontaminasi
15 Terdapat penghambat enzim Hindari natrium azida dalam reaksi HRP
Hindari fosfat dalam reaksi AP
16 Penyimpanan komponen yang salah Periksa kembali kondisi penyimpanan pada level kit (Sebagian besar kit perlu disimpan
pada suhu 4 ° C)
17 Pencucian piring yang sangat cepat Buffer pencuci pipet yang lembut (metode manual)
Pastikan tekanan yang benar (sistem pencucian otomatis)
18 Sumur mengering Tutupi pelat menggunakan selotip atau selotip untuk semua inkubasi
19 Sumur digores dengan pipet atau Keluarkan / aspirasi larutan dengan hati-hati ke dalam dan keluar dari sumur
ujung pipet
20 Pembacaan pelat pada deteksi yang salah Gunakan panjang gelombang / filter yang disarankan
panjang gelombang
Pastikan pembaca pelat diatur dengan benar untuk jenis media yang digunakan
21 Perkembangan warna lambat Siapkan media segera sebelum digunakan
Biarkan inkubasi lebih lama
Pastikan larutan stok tidak kedaluwarsa dan tidak terkontaminasi
22 Pengenalan epitop terhalang oleh peptida konjugasi ke protein pembawa besar sebelum melapisi
adsorpsi ke piring piring
2. Sinyal Jenuh

1 Konsentrasi sampel yang tinggi Gunakan pengenceran sampel yang lebih tinggi (Tentukan pengenceran optimal dengan
uji titrasi)
2 Substrat yang berlebihan Kurangi konsentrasi atau jumlah media: Ikuti panduan produsen (Media
yang disertakan dengan kit ELISA mungkin memerlukan pengenceran
lebih lanjut)
3 Warna media berubah sebelum digunakan Buat media segera sebelum digunakan
4 Pengikatan antibodi non-spesifik Coba formulasi berbeda dalam larutan pelapis
20
Pastikan sumur diproses sebelumnya untuk mencegah pengikatan non-spesifik
Gunakan antibodi yang dimurnikan afinitas dan lebih disukai antibodi yang diserap
sebelumnya.
Gunakan serum (5-10%) dari spesies yang sama sebagai antibodi sekunder
(serum sapi juga dianjurkan)
5 Waktu inkubasi terlalu lama Ikuti pedoman pabrik (Jika masalah tetap ada, coba inkubasi sampel pada
6 Antibodi berlebih Ulangi pengujian dengan konsentrasi antibodi yang lebih rendah untuk menemukan yang
7 Buffer yang terkontaminasi dengan logam Buat dan gunakan buffer baru atau HRP
9 Pencucian tidak cukup Ikuti pedoman pabrikan
Di akhir setiap langkah pencucian, jentikkan piring ke wastafel dan tepuk piring di
atas handuk kertas
10 Sealer pelat tidak digunakan atau digunakan kembali Selama inkubasi, tutupi pelat dengan penyegel pelat.
Gunakan sealer baru setiap kali sealer bekas dilepas dari pelat
11 Pembacaan pelat pada deteksi yang salah Gunakan panjang gelombang / filter yang disarankan
panjang gelombang
12 Waktu berlebih sebelum membaca pelat Baca pelat Anda dalam waktu 30 menit setelah menambahkan media (Jika
pembacaan tidak dilakukan dalam jangka waktu ini, tambahkan solusi penghenti
setelah warna yang cukup berkembang di pelat)
3. Latar Belakang Tinggi

atas handuk kertas
2 Tidak Efektif / Terkontaminasi Coba konsentrasi protein pemblokiran yang lebih tinggi
memblokir penyangga
Tambah waktu pemblokiran
21
Gunakan penyangga baru
3 Antibodi berlebih Ulangi pengujian dengan konsentrasi antibodi yang lebih rendah untuk menemukan yang
4 Substrat berlebih Kurangi konsentrasi atau jumlah substrat
Ikuti pedoman pabrikan (Catatan: Media yang disertakan dengan kit ELISA mungkin
memerlukan pengenceran lebih lanjut)
5 Reaktivitas silang (Deteksi Jalankan kontrol yang sesuai

antibodi bereaksi dengan antibodi
pelapis)
6 Pengikatan antibodi non-spesifik Coba formulasi berbeda dalam larutan pelapis
Pastikan sumur diproses sebelumnya untuk mencegah pengikatan non-spesifik
Gunakan antibodi yang dimurnikan afinitas dan lebih disukai antibodi yang diserap
sebelumnya
Gunakan serum (5-10%) dari spesies yang sama sebagai antibodi sekunder
(serum sapi juga dianjurkan)
7 Tween tidak mencukupi di buffer Gunakan PBS yang mengandung 0,05% Tween
8 Konsentrasi garam yang kurang optimal dalam Mengoptimalkan konsentrasi garam karena konsentrasi tinggi dapat mengurangi interaksi
buffer pencuci non-spesifik
9 Suhu inkubasi terlalu tinggi Optimalkan suhu inkubasi untuk pengujian Anda (antibodi mengikat secara optimal
pada suhu yang sangat spesifik)
10 Reagen tidak tercampur dengan benar Campurkan semua reagen dan sampel secara menyeluruh sebelum pemipetan
solusi ke dalam sumur
11 Kosong terkontaminasi Ubah ujung pipet saat beralih antara blanko dan sampel
sampel
Tutupi pate untuk menghindari tumpahan di antara sumur
12 Sampel terkontaminasi Uji sampel dengan substrat saja untuk memeriksa enzim yang terkontaminasi
enzim
13 Substrat TMB yang terkontaminasi Gunakan wadah yang bersih untuk memeriksa bahwa substrat di dalam tidak
terkontaminasi (substrat TMB harus bersih dan tidak berwarna sebelum ditambahkan ke
sumur)
22
14 Inkubasi substrat dalam cahaya Lakukan inkubasi media dalam gelap atau ikuti rekomendasi dari
produsen
15 Penguapan larutan yang tidak merata Selalu inkubasi dengan penutup pada pelat
dari sumur selama inkubasi
16 Endapan yang tercipta di dalam sumur setelah Meningkatkan faktor pengenceran sampel atau menurunkan konsentrasi
penambahan substrat substrat
17 Waktu inkubasi terlalu lama Ikuti pedoman pabrik (Jika masalah tetap ada, coba inkubasi sampel pada
18 Pengenceran kurva standar yang salah Periksa teknik pemipetan
Perhitungan cek ulang
19 Pelat ditumpuk selama inkubasi, Hindari menumpuk pelat

menyebabkan distribusi suhu yang tidak
merata
20 Pelat kotor atau rusak Bersihkan bagian bawah pelat
21 Perkembangan warna yang tidak terhentikan Gunakan solusi Stopping untuk mencegah pengembangan berlebihan
22 Waktu berlebih sebelum membaca pelat Baca pelat Anda dalam waktu 30 menit setelah menambahkan media (Jika
pembacaan tidak dilakukan dalam jangka waktu ini, tambahkan solusi penghenti
setelah warna yang cukup berkembang di pelat)
Catatan: Warna terus berkembang bahkan setelah menambahkan larutan penghenti

(meskipun pada kecepatan yang lebih lambat)
23 Pengaturan pembacaan pelat salah Gunakan panjang gelombang / filter yang direkomendasikan
4. Sensitivitas Rendah

1 Format pengujian tidak cukup sensitif Alihkan ke sistem deteksi yang lebih sensitif (mis. Kolorimetri
untuk chemiluminescence)
Beralih ke jenis pengujian yang lebih sensitif (misalnya ELISA langsung ke ELISA
sandwich)
Tingkatkan waktu inkubasi dan / atau suhu
2 Penyimpanan kit ELISA yang tidak tepat Simpan semua reagen seperti yang direkomendasikan
23
Catatan: Semua reagen mungkin tidak memiliki persyaratan penyimpanan yang identik
3 Target tidak mencukupi Kurangi pengenceran sampel atau konsentrasikan sampel
4 Substrat tidak aktif Pastikan enzim pelapor memiliki aktivitas yang diharapkan
5 Adsorpsi target yang buruk ke sumur Hubungkan target ke sumur secara kovalen
6 Substrat tidak mencukupi Tingkatkan konsentrasi atau jumlah substrat
7 Jenis sampel tidak kompatibel Gunakan sampel yang pengujiannya diketahui mendeteksi kontrol positif
Sertakan kontrol positif dalam eksperimen Anda
8 Bahan-bahan yang mengganggu dalam buffer Periksa reagen dari bahan kimia yang mengganggu, misalnya natrium azida dan sampel
dalam antibodi menghambat enzim HRP; EDTA digunakan sebagai antikoagulan karena
pengumpulan plasma menghambat reaksi enzimatik
9 Mencampur atau mengganti reagen Hindari mencampur komponen dari kit berbeda dari kit berbeda
10 Pengaturan pembacaan pelat salah Gunakan panjang gelombang / filter yang direkomendasikan
5. Kurva Standar Buruk

1 Solusi standar yang tidak tepat Pastikan pengenceran dilakukan dengan benar
Buat kurva standar baru yang sesuai
2 Standar disusun kembali secara tidak benar Putar botol sebentar sebelum dibuka
Periksa material yang tidak larut setelah rekonstitusi
3 Standar terdegradasi Simpan dan tangani standar seperti yang direkomendasikan
Siapkan standar tidak lebih dari dua jam sebelum digunakan
4 Pemasangan kurva yang tidak tepat Coba buat plot menggunakan skala yang berbeda, misalnya log-log, kesesuaian kurva
logistik 5 parameter
5 Kesalahan pemipetan Gunakan pipet yang telah dikalibrasi dan teknik pemipetan yang benar
24
atas handuk kertas
7 Reagen yang tercampur dengan buruk Campur reagen dengan seksama
8 Buruk / variabel adsorpsi Memperpanjang waktu inkubasi

reagen ke piring
Periksa buffer pelapis
Gunakan piring yang berbeda sesuai kebutuhan
Periksa homogenitas sampel
9 Piring ditumpuk selama inkubasi Pisahkan pelat jika tidak menggunakan pelat yang berputar
10 Pelat kotor atau rusak Bersihkan bagian bawah pelat
6. Replikasi Data yang Buruk

1 Gelembung di sumur Pastikan tidak ada gelembung sebelum pelat baca
2 Pencucian sumur tidak memadai Cuci sumur dengan hati-hati
Ikuti protokol yang direkomendasikan
Periksa apakah semua port mesin cuci pelat tidak terhalang
3 Pencampuran reagen tidak lengkap Pastikan semua reagen tercampur rata
4 Pemipetan tidak konsisten Gunakan pipet yang dikalibrasi dan teknik pemipetan yang benar
Jika pipet multi saluran digunakan, pastikan semua saluran memberikan volume
yang sama
5 Persiapan sampel tidak konsisten atau Pastikan persiapan sampel yang konsisten dan penyimpanan penyimpanan sampel yang optimal
kondisi (misalnya meminimalkan siklus pembekuan / pencairan)
6 Partikulat dalam sampel Hapus partikulat dengan sentrifugasi
7 Sealer pelat tidak digunakan atau digunakan kembali Selama inkubasi, tutupi pelat dengan penyegel pelat
8 Kontaminasi lintas sumur Pastikan sealer pelat dan ujung pipet tidak terkontaminasi reagen
25
9 Efek tepi (OD lebih tinggi atau lebih rendah Pastikan pelat dan reagen disimpan pada suhu kamar di sumur periferal daripada di
pusat sebelum memipet ke dalam sumur kecuali jika diinstruksikan sebaliknya)
Selama inkubasi, tutup pelat sepenuhnya dengan penyegel pelat dan hindari
menumpuk pelat
7. Hasil Assay-to-Assay yang Tidak Konsisten

1 Pencucian sumur tidak memadai Cuci sumur dengan hati-hati
Ikuti protokol yang direkomendasikan
Periksa apakah semua port mesin cuci pelat tidak terhalang
2 Variasi dalam inkubasi Patuhi suhu inkubasi yang direkomendasikan

suhu
Hindari piring inkubasi di tempat yang kondisi lingkungannya bervariasi
3 Variasi dalam protokol Patuhi protokol yang sama dari proses ke proses
4 Sealer pelat tidak digunakan atau digunakan kembali Selama inkubasi, tutupi pelat dengan penyegel pelat
5 Pengenceran salah Confirmdilutions dilakukan dengan benar untuk solusi standar, dll
Buat kurva standar baru yang sesuai
6 Buffer yang terkontaminasi Buat dan gunakan penyangga segar
7 Piring ditumpuk selama inkubasi Pisahkan pelat jika tidak menggunakan pelat yang berputar
8. Perkembangan Warna Lambat

1 Substrat terlalu tua, terkontaminasi atau Buat dan gunakan media baru dengan pH yang benar: media harus disiapkan segera
digunakan pada pH yang salah sebelum digunakan
2 Solusi kadaluarsa / Terkontaminasi Buat dan gunakan reagen segar
3 Suhu inkubasi salah Pastikan pelat dan reagen disimpan pada suhu kamar sebelum pemipetan ke
dalam sumur kecuali diinstruksikan lain
26
Selama inkubasi, tutup pelat sepenuhnya dengan penyegel pelat dan hindari
menumpuk pelat
4 Konsentrasi antibodi rendah Ulangi pengujian dengan konsentrasi antibodi yang lebih tinggi untuk menemukan yang
5 Konsentrasi substrat rendah Tambahkan lebih banyak substrat ke dalam sumur
Buat media tidak lebih dari satu jam sebelum digunakan
Catatan: Sensitivitas ELISA tipikal adalah ~ 0,1 pg / mL dengan nilai pasti tergantung pada
antibodi yang digunakan.
9. Masalah Pencitraan Plat

1 Gambar terlalu jenuh setelahnya Gunakan gambar resolusi penuh untuk menganalisis hasil (Jangan gunakan jpeg atau
Akuisisi format terkompresi lainnya)
2 Bintik kabur pada gambar Fokus ulang kamera Anda sebelum mengambil gambar baru
3 Nilai piksel berulang atau bintik Gunakan ukuran bin yang lebih rendah, resolusi gambar yang lebih tinggi dan / atau tipe
persegi panjang file lossless
4 Standar datar dalam gambar Kurangi waktu akuisisi
27
FAQ
1. Protokol ELISA tidak merekomendasikan pengocokan selama inkubasi. Sudahkah Anda menguji gemetar dan memutuskan untuk tidak
melakukannya atau apakah itu tidak perlu?
Kami menguji protokol kami dengan dan tanpa gemetar selama inkubasi dan menentukan bahwa tidak ada perbedaan antara kedua
pendekatan tersebut. Oleh karena itu, kami percaya bahwa gemetar tidak perlu.
2. Apakah kit ELISA Anda sesuai untuk digunakan dengan lisat jaringan? Jika ya, apa protokolnya?
Secara teoritis, kit ELISA kami dapat bekerja dengan lisat jaringan. Protokol persiapan sampel umum kami untuk lisat jaringan adalah sebagai berikut:
• Bilas jaringan dengan PBS untuk menghilangkan darah berlebih. Potong
• tisu menjadi potongan 1-2 mm.
• Dengan menggunakan penghomogen jaringan, homogenkan sampel dalam larutan PBS atau lisat seperti Reagen Ekstraksi Protein
Jaringan Mamalia (Nomor Katalog Boster Bio AR0101) dengan perbandingan 10 mL larutan lisat dengan 1 g jaringan.
• Sentrifugasi homogenat pada kira-kira 5000 xg selama 5 menit.

• Uji segera atau simpan homogenat pada -20 ° C (hindari siklus freeze-thaw yang berulang).
3. Sampel saya mengandung konsentrasi sitokin yang sangat rendah. Berapa konsentrasi minimum yang dapat diukur dengan percaya diri
menggunakan kit ELISA Anda?
Konsentrasi sitokin yang rendah adalah tipikal untuk banyak sampel biologis. Saat menentukan konsentrasi minimum yang dapat diukur
secara andal dengan ELISA, pertimbangkan hal berikut:
• Kurva standar: Karena kisaran konsentrasi ELISA biasanya 0 - 1000 pg / mL, poin data pada kurva standar untuk kisaran
ini sesuai dengan 0, 15,6, 31,25, 62,5, 125, 250, 500, dan 1000 pg / mL .
• Sensitivitas pengujian: Kit ELISA Picokine Boster biasanya memiliki sensitivitas yang dilaporkan sebesar 10 pg / mL. Konsentrasi
yang terdeteksi dalam banyak sampel biologis akan berada di antara titik data 0 dan 15,6 pg / mL dari kurva standar. Selama nilai
yang terdeteksi di atas sensitivitas statistik ELISA, (mis., 5 pg / mL atau lebih besar), nilai tersebut signifikan secara statistik. Hasil
di bawah batas deteksi ini validitasnya dipertanyakan.
4. Apakah kit ELISA Anda cocok untuk digunakan dengan jaringan homogenat?
Untuk kebanyakan kasus, ya. Jika terdapat cukup protein target di jaringan yang diinginkan, kit ELISA akan berfungsi. Selain itu, jika ada
pemrosesan alternatif protein yang diketahui dalam jaringan tertentu yang mengakibatkan perubahan reaktivitas protein ke kit, kami akan
mencatatnya di lembar data produk kami.
5. Apakah kit ELISA Anda sesuai untuk digunakan dengan jenis sampel yang tidak divalidasi?
Untuk menggunakan kit ELISA dengan jenis sampel yang tidak divalidasi, perlu dilakukan studi lonjakan dan pemulihan untuk menentukan apakah jenis
sampel yang tidak divalidasi akan berfungsi dengan kit tertentu. Untuk melakukan ini:
• Bagilah sampel menjadi dua alikuot.

• Di salah satu alikuot, Anda harus "memasukkan" jumlah standar kit yang diketahui.
• Lakukan seri pengenceran untuk membandingkan sampel berduri dengan sampel tak berduri.
Umumnya, sampel dengan pemulihan yang diharapkan dan linieritas antara 80-120% dapat diterima. Metode ini dapat digunakan untuk memvalidasi
semua jenis sampel yang belum pernah dievaluasi sebelumnya oleh Boster.
28
6. Dapatkah saya memperpanjang kurva standar?
Tidak ada yang bisa menjamin keakuratan assay setelah konsentrasi di luar kisaran yang ditentukan dalam kurva digunakan. Rentang
spesifik dibuat untuk memberikan kepercayaan statistik untuk akurasi pengujian.
7. Apa yang menyebabkan variabilitas tinggi antara duplikat sampel?
Dua alasan utama tingginya variabilitas sampel dalam suatu pengujian adalah pemipetan dan pencucian yang tidak konsisten. Jadi,
penting untuk menyempurnakan teknik ini. Namun, beberapa dari variabilitas ini tidak dapat dihindari - inilah alasan untuk menghitung
hasil rata-rata dari duplikat sampel. Penyebab lain yang mungkin untuk variabilitas tinggi adalah "efek tepi" di mana sumur terluar
pelat lebih rentan mengering karena penguapan. Penumpukan pelat juga akan menyebabkan variabilitas karena suhu tidak akan
merata di seluruh pelat.
8. Apa perbedaan ELISA sandwich dan ELISA kompetitif?
Sandwich ELISA biasanya memerlukan penggunaan pasangan antibodi yang cocok, di mana setiap antibodi spesifik untuk bagian yang berbeda
dan tidak tumpang tindih (epitop) dari molekul antigen. Antibodi pertama (dikenal sebagai antibodi penangkap) dilapisi ke sumur. Larutan sampel
kemudian ditambahkan ke dalam sumur. Antibodi kedua (dikenal sebagai antibodi pendeteksi) mengikuti langkah ini untuk mengukur konsentrasi
sampel. Output sinyal yang lebih tinggi mencerminkan konsentrasi antigen target yang lebih tinggi dalam sampel.
Peristiwa utama ELISA kompetitif adalah proses reaksi kompetitif antara antigen sampel dan antigen yang terikat ke lubang pelat
mikrotiter dengan antibodi primer. Pertama, antibodi primer diinkubasi dengan antigen sampel dan kompleks antibodi-antigen yang
dihasilkan ditambahkan ke sumur yang telah dilapisi dengan antigen yang sama. Setelah masa inkubasi, setiap antibodi yang tidak
terikat dicuci. Semakin banyak antigen dalam sampel, semakin banyak antibodi primer yang akan terikat pada antigen sampel. Oleh
karena itu, akan ada jumlah yang lebih kecil dari antibodi primer yang tersedia untuk mengikat antigen yang dilapisi pada sumur,
menghasilkan reduksi sinyal.
9. Mengapa sumur saya berubah menjadi hijau setelah saya menambahkan solusi stop?
Warna hijau adalah hasil pencampuran yang tidak sempurna antara substrat dan larutan penghenti. Setelah menambahkan larutan penghenti, ketuk
perlahan piring atau letakkan di atas pengocok sampai campuran di dalam sumur berubah menjadi kuning.
10. Mengapa endapan coklat atau oranye-coklat muncul di sumur saya setelah menambahkan larutan penghenti? Bagaimana cara mengatasi
masalah ini?
Endapan adalah hasil dari pencucian yang tidak memadai setelah inkubasi dengan antibodi deteksi berlabel HRP. Untuk mengatasi masalah ini,
lakukan perendaman selama 30 detik selama setiap langkah pencucian diikuti dengan menghilangkan semua cairan di dalam sumur.
11. Jika saya tidak menggunakan semua sumur dari pelat mikrotiter untuk pengujian ELISA saya saat ini, bagaimana saya dapat mengawetkan sumur
yang tidak terpakai untuk penggunaan di masa mendatang?
Pelat mikrotiter biasanya memiliki strip sumur yang bisa dilepas. Sumur yang tidak terpakai dapat dikeluarkan dari piring, dikembalikan ke kantong foil
yang berisi paket pengering dan disimpan pada suhu 2-8 ° C hingga satu bulan.
29
meminta informasi
Dengan lebih dari 20 tahun pengalaman dan kepercayaan dari 10.000+ ilmuwan, Boster dengan bangga menawarkan lebih dari
600 PicoKine TM Kit ELISA yang membantu mempercepat penemuan ilmiah di bidang penelitian termasuk imunologi ,
ilmu saraf dan kanker . Setiap kit ELISA kami memiliki reagen yang cukup untuk 96 tes per kit. Tabel di bawah ini menunjukkan beberapa kit ELISA
yang paling umum digunakan.
Sampl e Tipe s *
Target Jenis CCS Se P (h) P (e) P (c) U M CL T Kucing. Tidak.
Adiponektin Manusia √ √ √ √ √ √ EK0595
Angiopoietin-2 Mouse √ √ √ √ EK0938
BDNF Manusia √ √ √ √ √ EK0307
CRP Tikus √ √ √ √ EK0978
CTLA4 Mouse √ √ √ EK0717
EGFR Manusia √ √ √ √ √ EK0327
FGF21 Manusia √ √ √ √ EK0994
IFN Gamma Manusia √ √ EK0373
IL-6 Manusia √ √ √ √ √ EK0410
IL-8 Manusia √ √ √ √ √ EK0413
IL-10 Manusia √ √ √ √ √ EK0416
Leptin Mouse √ √ √ √ EK0438
MCP-1 Tikus √ √ EK0902
NGF Beta Tikus √ √ EK0471
P53 Manusia √ EK0895
PD-1 Manusia √ EK0959
TGF Beta 1 Manusia √ √ √ √ EK0513
TNF Alpha Mouse √ √ √ √ EK0527
* Kultur Sel Supernat [CCS], Serum [Se], Plasma: Heparin [P (h)], Plasma: EDTA [P (e)], Plasma: Sitrat [P (c)], Urine [U], Susu [ M], Lisat Sel
(CL), Jaringan (T)
Kami juga menawarkan berbagai komponen ELISA yang dapat dibeli terpisah dari kit:
• Standar rekombinan liofilisasi (1 ng hingga 100 ng)
• Plat 96-lubang (Tanpa lapisan antibodi)
• Kompleks Avidin-Biotin-Peroksidase (ABC)
• Buffer (Pengencer sampel, pengencer antibodi, pengencer ABC, PBS, TBS)
• Agen pengembangan warna TMB dan solusi hentikan
• Antibodi terbiotinilasi
Kontak informasi
Teknologi Biologi Boster

3942 Valley Ave., Suite B, Pleasanton, CA 94566 Telepon:
(888) 466-3604
Faks: (925) 485-4560
Penjualan dan Layanan Pelanggan: orders@bosterbio.com
Dukungan Produk dan Teknis: support@bosterbio.com

Pengembangan Bisnis: boster@bosterbio.com
30

ELISA Handbook - En.id

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

ELISA Handbook - En.id

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

Buku Pegangan ELISA

Prinsip, Pemecahan Masalah, Persiapan Sampel

2. Prosedur Umum ELISA ………………………………………………………… ... 2

3. Jenis ELISA ………………………………………………………………………… 3

• ELISA Langsung ………………………………………………………………….… 4

• Sandwich ELISA ………………………………………………………………… 5

• ELISA Kompetitif ……………………………………………………………… 5

4. Interpretasi Data ELISA ……………………………………………………………. 6

5. Persiapan Sampel ……………………………………………………………………. 7

• Supernatan Kultur Sel …………………………………………………………. 7

• Media Berkondisi ……………………………………………………………… .. 7

6. Protokol yang Direkomendasikan ………………………………………………………………. 9

• ELISA Langsung ……………………………………………………………………… 14

• ELISA Kompetitif …………………………………………………………………… 16

7. Panduan mengatasi masalah ………………………………………………………………….. 19

• Lemah atau Tidak Ada Sinyal ………………………………………………………………… .. 19

• Sinyal Jenuh …………………………………………………………………… .. 20

• Latar Belakang Tinggi ………………………………………………………………… .... 21

• Sensitivitas Rendah ………………………………………………………………………… 23

• Kurva Standar Buruk ……………………………………………………………… ... 24

• Data Replikasi Buruk …………………………………………………………………. 25

• Hasil Assay-to-Assay yang Tidak Konsisten …………………………………………………. 26

• Perkembangan Warna Lambat ……………………………………………………………. 26

• Masalah Pencitraan Plat ……………………………………………………………… 27

8. Tanya Jawab ……………………………………………………………………………………… .. 28

9. Informasi Pemesanan ……………………………………………………………………. 30

Prosedur ELISA Umum

digunakan untuk memperkuat sinyal.

Untuk dilanjutkan di halaman berikutnya

(spektrofotometer, fluorometer, atau luminometer).

• Reaktivitas silang antibodi sekunder dihilangkan.

2. ELISA Tidak Langsung

ELISA, memiliki kelebihan dan kekurangan:

• Berbagai macam antibodi sekunder berlabel tersedia secara komersial.

berlabel, memungkinkan penguatan sinyal.

• Langkah inkubasi ekstra diperlukan dalam prosedur ini.

• Spesifisitas tinggi: antigen / analit ditangkap dan dideteksi secara spesifik

Tidak langsung Langsung Sandwich Kompetitif

Interpretasi Data ELISA

Uji ELISA menghasilkan tiga jenis keluaran data:

kurva yang biasanya ditemukan pada pembaca pelat ELISA.

• Konsentrasi ekstrak protein minimal 1-2 mg / mL.

1. Supernatan Kultur Sel

- 80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.

Untuk dilanjutkan di halaman berikutnya

• 100 mM Tris, pH 7,4

PMSF hingga 1 mM untuk menghasilkan solusi buffer ekstraksi lengkap.)

es. Jaga sampel pada -80 ° C, hindari siklus pembekuan / pencairan.

akhir paling sedikit 1 mg / mL.

Untuk dilanjutkan di halaman berikutnya

Catatan: Solusi standar paling baik digunakan dalam 2 jam.

Untuk dilanjutkan di halaman berikutnya

1. Menangkap Lapisan Antibodi

4. Sampel (Antigen) Inkubasi

5. Inkubasi Antibodi Biotinilasi

Enzim Substrat * Hentikan Solusi Warna Absorbansi (nm) Dikembangkan

• Hidrogen peroksida juga dapat bertindak sebagai substrat untuk HRP.

• Tafsirkan konsentrasi sampel dari kurva standar.

• Persiapkan larutan standar encer seperti yang ditunjukkan pada hal.9.

4. Inkubasi Antibodi Primer

5. Inkubasi Antibodi Sekunder

Enzim Substrat * Hentikan Solusi Warna Absorbansi (nm) Dikembangkan

• Hidrogen peroksida juga dapat bertindak sebagai substrat untuk HRP.