BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

III.1 Alat Dan Bahan

III.1.1 Alat

Alat-alat yang digunakandalampenelitianiniadalahtimbangan analitik

(OhausPA2102), blender (Toshiba), toples kaca gelap, batangpengaduk,

aluminium foil, beaker glass 100 ml dan 500 ml (Iwaki Pyrex), corong kaca

(Iwaki Pyrex), kertas saring,vacuum rotary evaporator (Rotavator II

BUCHI),waterbath (Memmert WNB 22),cawan penguap,desikator,corong pisah

(Iwaki Pyrex),botolkaca gelap, tabung reaksi dan tutup, pipet tetes, mikropipet

(Rainin E1019705K), thermometer, penggaris, gelas ukur 50 ml dan 10 ml (Iwaki

Pyrex), erlenmeyer 100 ml dan 200 ml (Iwaki Pyrex), pipet volume 10 ml dan 25

ml (Iwaki Pyrex),cawan petri diameter 15 cm (Iwaki Pyrex),pinset anatomis,

inkubator (Memmert E24899), hot plate (SI Analytic GmbH D-55122) dan kertas

label.

III.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah albendazol,

akuades, asam asetat anhidrat, etil asetat, FeCl3, gelatin, HCl pekat, H2SO4pekat,

metanol, NaCl 0,9% fisiologis, n-heksan, pereaksi Liebermann Burchard, pereaksi

Mayer, pereaksi Wagner, pereaksi Dragendorff, pita magnesium, teripang keling

dan tisu.

III.2 Hewan Uji

Hewan percobaan yang digunakan adalah cacing gelang ayam (Ascaridia

24
 25

galli), cacing pita ayam (Raillietina sp), yang didapatkan dari tempat pemotongan

ayam kampung di daerah Sungai Jawi Pontianak.Cacing Ascaridia galli dan

cacing Raillietina sp diambil dari lumen usus ayam kampung.

III.3 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2017 hingga Agustus

2017.Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Fakultas Kedokteran

Universitas Tanjungpura dan Laboratorium Biologi Farmasi Badan Pengelola

Fakultas Farmasi Universitas Tangjungpura.

III.4 Subjek Penelitian

III.4.1 Bahan Baku dan Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah cacing gelang ayam (Ascaridia galli)

dan cacing pita ayam (Raillietina sp) yang didapatkan dari tempat pemotongan

ayam kampung di daerah Sungai Jawi, Kota Pontianak, Provinsi Kalimantan

Barat.

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah biota laut teripang

keling (Holothuria leucospilota) yang diduga memiliki daya sebagai antelmintik.

Biota laut teripang diperoleh di perairan Pulau Lemukutan, Kabupaten

Bengkayang, Kalimantan Barat.

III.4.2 Cara Pengambilan Sampel

Cacing diambil dari lumen usus halus ayam kampung. Teknik sampling

yang digunakan yaitu purposive sampling terhadap cacing Ascaridia galli dan

Raillietina sp dengan kriteria sebagai berikut;

 26

III.4.2.1 Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi sampel Ascaridia galli yaitu cacing dewasa (ukuran 7-11

cm), aktif bergerak, sedangkan kriteria inklusi sampel Raillietina sp yaitu dewasa

(ukuran 5-10 cm), dan aktif bergerak.

III.4.2.2 Kriteria Eksklusi

Kriteria eksklusi sampel yaitu cacing yang memiliki cacat anatomi.

III.5 Variabel Penelitian

III.5.1 Variabel Bebas (independent)

Variable bebas dalam penelitian ini adalah konsentrasi fraksi etil asetat

teripang keling (Holothurian leucospilota).

III.5.2 Variabel Terikat (dependent)

Variable terikat dalam penelitian ini adalah waktu kematian cacing

Ascaridia gall dan Raillietina sp.

III.6 Definisi Operasional

Penelitian ini merupakan penelitian true experimental yang meliputi

indentifikasi bahan baku, pegumpulan bahan baku, pembuatan ekstrak,

pemeriksaan karakteristik ekstrak dan pengujian daya antelmintik. Daya

antelmintik dilakukan dengan mengamati waktu kematian sampel. Sampel yang

digunakan sebagai hewan uji ialah cacing Ascaridia galli dan Raillietina sp.

Desain eksperimental yang dipilih adalah post test only control group design.

III.7 Jalannya Penelitian

III.7.1. Determinasi
Determinasi hewan uji Cacing Ascaridia galli dan Raillietina sp

dideterminasi Laboratorium Kesehatan Hewan Dinas Peternakan dan Kesehatan

Hewan Provinsi Kalimantan Barat, Jalan Adi Sucipto Pontianak.Teripang keling

 27

(Holothuria leucospilota) yang digunakan dalam penelitian ini dideterminasi di

Laboratorium Zoologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Tanjungpura Pontianak.

III.7.2 Pengumpulan Bahan Baku

Bahan baku yang digunakan adalah teripang keling (Holothurian

leucospilota) yang diperoleh dari perairan Pulau Lemukutan, Kabupaten

Bengkayang, Kalimantan Barat.

III.7.3 Preparasi Bahan baku

Bahan baku teripang dibersihkan dengan air mengalir setelah itu teripang

dipotong menjadi beberapa bagian dan khusus organ pecernaan seperti usus besar

yang berisi kotoran dan pasir dibuang. Selanjutnya, tubuh teripang dan organ

dalam lainnya dimasukkan ke dalam botol kaca, lalu diisi metanol hingga

terendam(19).

III.7.4 Pembuatan Ekstrak

Bahan baku basah teripang keling (Holothuria leucospilota) dipotong-

potong kecil dan ditambahkan 300 ml metanol sisa perendaman bahan untuk

diblender. Setelah halus, sampel dimasukkan ke dalam toples kacadan dimaserasi

dengan metanol 96%.Direndamteripang dengan pelarut metanol96% hingga

bening dengan pengadukan setiap 24 jam. Penggantian pelarut dilakukan setiap

1x24, 2x24, dan 3x24 jam kemudian dilakukan penyarian dengan kertas saring.

Semua maserat dikumpulkan dan dimasukkan kedalam vacuum rotary evaporator

pada suhu 30-400C dan kecepatan 90 rpm. Selanjutnya filtrat yang tersisa

diuapkan dengan menggunakan waterbath, kemudian ditimbang ekstrak yang

diperoleh dan dihitung nilai rendemennnya(19).

 28

III.7.5 Fraksinasi

Teripang keling (Holothuria leucospilota Brandt.) difraksinasi dengan n-

heksan, etil asetat dan air.Ekstrak cair dilarutkan dengan metanol diaduk hingga

homogen, kemudian dimasukkan kedalam corong pisah. Selanjutnya ekstrak

difraksinasi secara berturut-turut menggunakan metode ekstraksi cair-cair dengan

pelarut n-heksan, etil asetat dan air.Ekstraksi dilakukan sebanyak 4 kali untuk tiap

fraksi dengan menggunakan 25 ml pelarut untuk sekali penyarian.Hasil fraksinasi

dikumpulkan dan dipekatkan denganvacuum rotary evaporator hingga diperoleh

ekstrak kental.Filtrat dituang dalam cawan penguap, kemudian diuapkan lebih

lanjut pada waterbath.Ekstrak yang telah mengental kemudian ditimbang dan

dihitung rendemennya(47).

III.7.5.1 Uji Kandungan Kimia Fraksi

III.7.5..1 Alkaloid

Identifikasi alkaloid dilakukan dengan metode Mayer, Wagner dan

Dragendroff. Sebanyak 0,5 gram fraksi ditambahkan 1 ml HCl 2,0 M dan 9 ml

akuades, dipanaskan selama 2 menit. Dinginkan dan kemudian disaring. Filtrat

dibagi menjadi 3 bagian(42).Tabung pertama ditambahkan pereaksi Mayer 3 tetes,

jika positif terdapat alkaloid maka terbentuk endapan putih pada tabung.Tabung

kedua ditambahkan pereaksi Wagner 3 tetes, jika positif mengandung alkaloid

akanmembentuk endapan merah kecoklatan. Tabung ketiga ditambahkan pereaksi

Dragendorff 3 tetes(20).

III.7.5.1.2 Fenol

Identifikasi fenol dilakukan dengan melarutkn 0,5 gram fraksi kedalam

etanol.Kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl35%(62).

 29

III.7.5.1.3 Flavonoid

Identifikasi flavonoid dilakukan dengan melarutkan 0,5 gram fraksi dalam

etanol. Kemudian ditambahkan pita magnesium (Mg) dan 5 tetes HCl pekat(63,20).

III.7.5.1.5 Triterpenoid dan Steroid

Identifikasi steroid dan triterpenoid dilakukan dengan meggunakan reaksi

Liebermann Burchard.Fraksi dilarutkan dalam n-heksana, setelah itu ditambahkan

dengan asam asetat anhidrat. Selanjutnya ditambahkan 3 tetes H2SO4 pekat

melalui dinding tabung(20).

III.7.5.1.6 Saponin

Identifikasi senyawa saponin dilakukan dengan menambahkan 0,5 gram

fraksi kedalam air hangat, dikocok vertikal selama 10 detik kemudian dibiarkan

selama 10 detik. Penegasan keberadaan saponin dengan penambahan 1 tetes HCl

2,0 N(20).

III.7.6 Perlakuan Hewan Uji

III.7.6.1 Penyiapan Hewan Uji

Larutan NaCl 0,9% disiapkan secukupnya dalam toples. Ayam kampung

yang baru dipotong di tempat pemotongan ayam di Sungai Jawi dibelah satu per

satu ususnya. Bila ayam tersebut terinfeksi cacing maka akan ditemukan

Ascaridia galli dan Raillietina sp. Cacing diambil menggunakan pinset dan

dimasukkan kedalam larutan NaCl 0,9% yang telah disiapkan. Cacing diseleksi

dengan mengukur panjangnya (A.galli7-11 cm dan Raillietina sp5-10 cm)

sebanyak 15 ekor cacing Ascaridia galli dan 15 ekor cacing Raillietina sp. Cacing

hanya dapat digunakan satu kali setiap penelitian dan tidak dapat disimpan terlalu

lama. Cacing dimasukkan dalam sebuah termos yang berisi larutan NaCl
 30

fisiologis. Cacing yang diperoleh dicuci dan dibilas berulang-ulang hingga bersih

dengan larutan NaCl(65).

III.7.6.2 Pembagian Kelompok Perlakuan

Jumlah total sampel yang digunakan untuk uji antelmintik sebanyak 15

ekor Ascaridia galli dan 15 ekor Raillietina sp. Tiap perlakuan membutuhkan 3

ekor cacing Ascaridia galli dan 3 ekor cacing Railletina spsetiap kali percobaan

dibutuhkan dua kali perlakuan, yaitu dengan konsentrasi 50 µg/ml, 500 µg/ml,

dan 5000 µg/ml dan satu kontrol normal dengan NaCl 0,9% serta satu kontrol

positif yaitu albendazol 5 mg/ml. Penelitian ini diulang sebanyak lima kali.

III.7.6.3 Pembuatan Larutan Albendazol

Tablet albendazol 5 mg disiapkan, kemudian diencerkan dengan larutan

NaCl 0,9 % sehingga didapat konsentrasi albendazol 5 mg/ml sebanyak 10 ml.

Pada konsentrasi dilakukan pengulangan sebanyak 2 kali.

III.7.6.4 Uji Daya Antelmintik

Uji daya antelmintik dilakukan untuk mengetahui kemampuan fraksi etil

asetat teripang dalam membunuh cacing dan membandingkannya dengan

kelompok kontrol positif albendazol. Cacing yang digunakan sebanyak 30 ekor

cacing Ascaridia galli dan Raillietina sp yang dibagi menjadi 5 kelompok

perlakuan, dimana pada setiap kelompok menggunakan 6 ekor cacing. Perlakuan

dilakukan dengan merendam cacing Ascaridia galli dan Raillietina sp kedalam zat

uji pada masing-masing kelompok. Larutan untuk perlakuan dibuat dengan

melarutkan fraksi etil asetat teripang 50 µg/ml, 500 µg/ml, dan 5000 µg/ml

dengan DMSO dalam NaCl 0,9% fisiologis.Masing-masing larutan fraksi etil

asetat sebanyak 50 ml dengan konsentrasi 50 µg/ml, 500 µg/ml, dan 5000 µg/ml
 31

terlebih dahulu dihangatkan dalam inkubator suhu 370C selama kurang lebih 15

menit. Ascaridia galli dan Raillietina sp masing-masing sebanyak 3 ekor ditaruh

pada cawan petri dan diinkubasi pada suhu 370C.penelitian dilakukan 2 kali

pengulangan. Untuk mengetahui bahwa cacing telah mati setelah diinkubasi, maka

cacing-cacing tersebut diusik dengan batang pengaduk.Cacing yang diam

kemudian dipindahkan ke dalam air suhu 500C.Apabila dengan diusik tetap diam,

berarti cacing tersebut telah mati dan jika masih bergerak berarti cacing hanya

mengalami paralisis.Pengamatan pada kelompok perlakuan dan kelompok kontrol

dilakukan tiap jam ke-1, ke-3, ke-5, dan jam ke-7 dilanjutkan 24 jam. Jumlah

cacing yang mati dihitung dan dimasukkan kedalam tabel dan dianalisis dengan

uji statistik(64-66).

Tabel 3.Perlakuan pada uji

antelmintik
Kelompok Jumlah Zat Uji Volume Zat Uji
Perlakuan Cacing

K-1 6 NaCl 0,9% 50 ml

K-2 6 Albendazol 5 mg/ml 50 ml

K-3 6 Fraksi etil asetat 50 ml

teripang 50 µg/ml

K-4 6 Fraksi etil asetat 50 ml

teripang 500 µg/ml

K-5 6 Fraksi etil asetat 50 ml

teripang 5000 µg/ml

III.8 Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis menggunakan uji statistik.Analisis data

dilakukan dengan menggunakan IBM Statistic 21.Normalitas distribusi data diuji

menggunakan statistik Shapiro-Wilk.Homogenitas data diketahui dengan uji

 32

Levene.Data yang diperoleh terdistribusi normal dan homogen, maka dilanjtukan

analisis menggunakan uji One Way ANOVA.Uji ANOVA menghasilkan nilai

p<0,05, maka dilanjutkan dengan menggunakan analisis Post Hoc Test LSD.

III.9 Alur Penelitian

Teripang Dideterminasi
 33

Dibersihkan, dijemur, dipotong-potong

pengubahan bentuk.
Simplisia Teripang

Standardisasi ekstrak;
parameterspesifik dan Ekstrak Teripang
parameter non spesifik
Difraksinasi dengan n-heksan

Fraksi n-heksan Fraksi metanol

Fraksinasi dengan
-
Fraksi etil asetat Etil asetat

Uji antelmintik Fraksi air

Kelompok kontrol Kelompok perlakuan

Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok Kelompok V

normal positif III fraksi IV fraksi fraksi
NaCl 0,9% Albendazol teripang teripang teripang 5000
50 ml 5 mg/ml 50 µg/ml 500 µg/ml µg/ml

Inkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit

Perendaman 3 ekor cacing

Inkubasi pada suhu 37oC

Pengamatan dilakukan tiap jam ke-1, ke-3,ke-5 dan

jam ke-7 dilanjutkan 24 jam

Replikasi sebanyak 2 kali

Analisis data (One Way Anova)

Gambar 8.Alur Uji Daya Antelmintik
Keterangan: Jika pada jam ke-7 cacing belum mati maka dilanjutkan, dibiarkan
selama 24 jam.
III.10 Rencana Penelitian (Time table)
 34

Tabel 4.Rencana penelitian

Bulan ke
1 2 3 4
No. Penelitian
1. Persiapan alat dan
pengumpulan serta pengolahan
bahan baku teripang
2 Pembuatan ekstrak metanol
teripang dan pengujian
parameter spesifik dan
nonspesifik
3. Pembuatan fraksi etil asetat dan
uji fitokim fraksi
4. Persiapan alat dan
pengumpulan serta pengolahan
sampel cacing
5. Pengujian daya antelmintik
6. Analisis data