JOURNAL READING

“Evaluation of liquid from the Papanicolaou test and other liquid biopsies for the
detection of endometrial and ovarian cancers”

PEMBIMBING:

dr. Yoshep Aman Budi, Sp. OG

Disusun Oleh:

Antoro Rekso Samudro – 2016730015

KEPANITERAAN KLINIK STASE OBSTETRI DAN GINEKOLOGI

RSUD SEKARWANGI KABUPATEN SUKABUMI

PROGRAM STUDI PROFESI DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH JAKARTA

2020
 ABSTRAK

Deteksi kanker endometrium dan ovarium berdasarkan analisis genetik dari DNA yang diperoleh dari
cairan yang diambil selama tes Papanicolaou (Papsmear) rutin. Tes baru, yang disebut PapSEEK,
menggabungkan pengujian mutasi pada 18 gen serta pengujian aneuploidi. Dalam sampel Pap brush
dari 382 pasien kanker endometrium, 81% [95% confidence interval (CI), 77 sampai 85%] positif,
termasuk 78% pasien dengan penyakit stadium awal. Sensitivitas pada 245 pasien kanker ovarium
adalah 33% (95% CI, 27 hingga 39%), termasuk 34% pasien dengan penyakit stadium awal.
Sebaliknya, hanya 1,4% dari 714 wanita tanpa kanker memiliki sampel Pap brush positif (spesifisitas,
~ 99%). Selanjutnya, pengambilan sampel intrauterin dengan sikat Tao meningkatkan deteksi
keganasan pada pengambilan sampel endoserviks dengan sikat Pap: 93% dari 123 (95% CI, 87 hingga
97%) pasien dengan kanker endometrium dan 45% dari 51 (95% CI, 31 hingga 60%) pasien dengan
kanker ovarium adalah positif, sedangkan tidak ada sampel dari 125 wanita tanpa kanker yang positif
(spesifisitas, 100%). Akhirnya, pada 83 pasien kanker ovarium dalam plasma tersedia, DNA tumor
yang bersirkulasi ditemukan pada 43% pasien (95% CI, 33 sampai 55%). Ketika sampel plasma dan
Pap brush diuji, sensitivitas untuk kanker ovarium meningkat menjadi 63% (95% CI, 51 hingga 73%).
Hasil ini menunjukkan potensi diagnosis berbasis mutasi untuk mendeteksi kanker ginekologi pada
tahap yang kemungkinan besar dapat disembuhkan. pada 83 pasien kanker ovarium dalam plasma
yang tersedia, DNA tumor yang bersirkulasi ditemukan pada 43% pasien (95% CI, 33 sampai 55%).
Ketika sampel plasma dan Pap brush diuji, sensitivitas untuk kanker ovarium meningkat menjadi 63%
(95% CI, 51 hingga 73%). Hasil ini menunjukkan potensi diagnosis berbasis mutasi untuk mendeteksi
kanker ginekologi pada tahap yang kemungkinan besar dapat disembuhkan. pada 83 pasien kanker
ovarium dalam plasma yang tersedia, DNA tumor yang bersirkulasi ditemukan pada 43% pasien (95%
CI, 33 sampai 55%). Ketika sampel plasma dan Pap brush diuji, sensitivitas untuk kanker ovarium
meningkat menjadi 63% (95% CI, 51 hingga 73%). Hasil ini menunjukkan potensi diagnosis berbasis
mutasi untuk mendeteksi kanker ginekologi pada stadium yang masih dapat diterapi.
1. Pendahuluan
Tes Papanicolaou (Pap) diketahui dapat menurunkan mortalitas kanker serviks pada
populasi yang diskrining. Sayangnya, tes Pap umumnya tidak dapat mendeteksi kanker
endometrium atau ovarium. Mengingat keberhasilan tes Pap dalam mendeteksi stadium awal,
kanker serviks yang dapat disembuhkan, kanker ovarium dan endometrium saat ini
merupakan keganasan ginekologi yang paling mematikan dan paling umum, masing-masing,
di negara-negara di mana tes Pap dilakukan secara rutin. Bersama-sama, endometrium dan
kanker ovarium menyebabkan sekitar 25.000 kematian setiap tahunnya sebagai kanker nomor
tiga yang menyebabkan kematian pada wanita di US. Kebanyakan dari kasus tersebut
disebabkan oleh subtipe tumor high-grade yang mengalami metastasis sebelum munculm
gejala.
Kanker endometrium merupakan keganasan ginekologi tersering dengan estimasi kasus
baru sebanyak 61.380 pada tahun 2017 di US. Insiden kanker endometrium meningkat
dengan prevalensi obesitas dan meningkatnya harapan hidup. Pada saat yang bersamaan,
angka kelangsungan hidup relatif tidak mengalami peningkatan selama beberapa dekade.
Banyak upaya telah diarahkan dalam pengembangan tes skrining untuk jenis kanker ini. Tes
diagnostik yang paling umum adalah USG transvaginal (TVUS), yang mengukur ketebalan
endometrium. Potensi TVUS sebagai tes skrining dirusak oleh ketidakmampuannya untuk
secara andal membedakan antara lesi jinak dan ganas, membuat wanita tanpa kanker
menjalani prosedur invasif yang tidak perlu dan komplikasi yang terkait. Tingkat positif palsu
yang tinggi ditunjukkan oleh fakta bahwa sedikitnya 1 dari 50 wanita yang dites positif oleh
TVUS terbukti menderita kanker endometrium setelah menjalani prosedur diagnostik
tambahan.
Kanker ovarium adalah keganasan ginekologi paling umum kedua di Amerika Serikat dan
Eropa. Ini sering didiagnosis pada tahap akhir, ketika tingkat kelangsungan hidup 5 tahun
kurang dari 30%. Kematian yang tinggi telah menjadikan pengembangan uji skrining yang
efektif sebagai prioritas tinggi. Uji coba secara acak besar telah menilai penggunaan CA-125
dan TVUS sebagai tes skrining potensial untuk kanker ovarium. Namun, skrining dengan
pendekatan diagnostik saat ini tidak disarankan untuk populasi umum karena mengarah pada
“risiko bahaya, termasuk intervensi bedah besar pada wanita yang tidak menderita kanker”.
Dengan demikian, pengembangan pendekatan diagnostik baru menjadi penting.
Di antara kanker ovarium, karsinoma serosa tingkat tinggi (HGSCs) menyebabkan 90%
dari semua kematian akibat kanker ovarium. Bukti yang semakin banyak menunjukkan bahwa
sebagian besar HGSC muncul di tuba falopi dan kemudian ditanamkan di permukaan
ovarium. Sebuah studi prospektif baru-baru ini terhadap wanita bergejala melaporkan bahwa
kebanyakan HGSC yang didiagnosis lebih awal memiliki asal-usul ekstraovarian. Ini
mungkin menjelaskan rendahnya sensitivitas TVUS untuk penyakit dini, ketika tidak ada
 kelainan ovarium yang terdeteksi. Skrining multimodal dengan serumCA-125 meningkatkan
sensitivitas; namun, dengan cara penggunaannya saat ini, CA-125 kurang spesifik dan
meningkat dalam berbagai kondisi jinak yang umum.
Tidak seperti penanda yang terkait dengan neoplasia, mutasi gen pemicu kanker adalah
agen penyebab. Telah dibuktikan bahwa DNA tumor dapat dideteksi di saluran vagina wanita
dengan kanker ovarium. Lebih lanjut, penelitian terbaru menunjukkan bahwa kanker
endometrium dan ovarium melepaskan sel-sel yang terkumpul di serviks, memungkinkan
jumlah DNA tumor yang dapat dideteksi ditemukan dalam cairan yang diperoleh selama tes
Pap rutin. Sel-sel ini diambil sampelnya dengan kuas pap yang dimasukkan ke dalam saluran
endoserviks. Kuas tersebut kemudian dicelupkan ke dalam cairan pengawet. Untuk
mendeteksi kanker serviks, sel-sel dari cairan dioleskan ke slide untuk pemeriksaan sitologi
(Pap smear klasik). Selain itu, DNA sering dimurnikan dari cairan untuk mencari human
papillomavirus. Di sini, kami menggunakan DNA dari fluida ini dengan metode PCR, tes
multipleks untuk menilai perubahan genetik yang umumnya terjadi pada kanker endometrium
atau ovarium. Selain itu, kami mempelajari dua cara untuk meningkatkan sensitivitas.
Pertama, kami menguji pengambilan sampel intrauterine (dengan “ Kuas Tao ”), sebuah
metode yang memungkinkan pengumpulan sampel lebih dekat ke situs anatomi tumor.
Kedua, dalam penelitian terbaru, kami menunjukkan bahwa pengujian mutasi pada air liur
dan plasma dari individu yang sama meningkatkan sensitivitas pendeteksian tumor kepala dan
leher. Berdasarkan preseden ini, kami menilai apakah formutasi pengujian dalam plasma dan
cairan tes Pap akan meningkatkan sensitivitas untuk kanker ovarium.

2. Hasil
Evaluasi mutasi somatik pada sampel brush dari pasien dengan kanker endometrial
atau ovarium
Secara keseluruhan, 1915 sampel dari 1658 individu yang temasuk dalam penelitian ini.
Termasuk 656 pasien dengan kanker endometrium atau kanker ovarium dan 1002 kelompok
kontrol. Usia, suku, diagnosis histopatologi, stadium, dan gejala klinis lain yang digambarkan
pada tabel S1. Sampel yang diperiksa dari semua pasien ini dapat dilihat pada tabel S2.
Jumlah DNA yang terlepas dari sel neoplastik merupakan bagian kecil dari total DNA
pada sample pap brush, dengan DNA yang berasal dari sel normal. Kami juga menggunakan
pemeriksaan yang lebih sensitif yaitu PCR berbasis teknologi error-reduction, yang disebut
Safe-Suqencing, untuk mengidentifikasi mutasi pada sampel ini. Singkatnya, primer
dirancang untuk memperkuat 139 wilayah, mencakup 9392 posisi nukleotida berbeda dalam
18 gen yang diinginkan. Tiga PCR multipleks, masing-masing berisi amplikon
nonoverlapping, kemudian dilakukan pada setiap sampel.
 Kami menerapkan tes ini pada sampel Pap brush dari 382 wanita dengan kanker
endometrium, 245 wanita dengan kanker ovarium, dan 714 wanita tanpa kanker. Kami
menemukan bahwa 81% [95% confidence interval (CI), 76-84%] pasien dengan kanker
endometrium, termasuk 78% pasien dengan penyakit stadium awal (stadium I dan II) dan
89% pasien dengan penyakit stadium lanjut (stadium III dan IV; tabel S2). Gen yang paling
sering bermutasi adalah PTEN ( 64%), TP53 ( 41%), PIK3CA ( 31%), PIK3R1 ( 29%),
CTNNB1 ( 21%), KRAS ( 18%), FGFR2 (11%), POLE ( 9%), APC ( 9%), FBXW7 ( 8%),
RNF43 ( 7%), dan PPP2R1A (5%), konsisten dengan studi luas genom sebelumnya tentang
kanker endometrium ( 25, 28, 29). Fraksi alel mutan median (MAF) adalah 4,0% [kisaran
interkuartil (IQR), 1,3 sampai 12%] (tabel S4). 29% dari 245 pasien kanker ovarium
menyimpan mutasi yang dapat dideteksi dalam sampel Pap brush (95% CI, 24 hingga 36%).
Ini termasuk 28% pasien dengan penyakit stadium awal dan 30% pasien dengan penyakit
stadium lanjut (tabel S2). Gen yang paling sering bermutasi adalah TP53 ( 74%), konsisten
dengan penelitian luas genom sebelumnya dari jenis tumor ini ( 25, 30). MAF rata-rata adalah
0,54% (IQR, 0,22 hingga 2,6%) (tabel S4). Kami juga menerapkan uji ini pada 714 wanita
tanpa kanker dan menemukan bahwa 1,3% memiliki mutasi yang dapat dideteksi,
menghasilkan spesifisitas ~ 99% (Gbr. 1).
Jaringan tumor yang ada pada 83 dan 84% pasien kanker endometrium dan kanker
ovarium dari sampel Pap brush. Menggunakan multiplex assay yang sama yang diaplikasikan
pada sampel pap brush. Pencetus mutasi gen dapat diidentifikasi pada 98 dan 82% dari
jaringan kanker endometrium dan kanker ovarium masing-masing dapat dilihat pada tabel S5.
Pada pasien kanker endometrium dan ovarium dengan mutasi diidentifikasi pada tumor
primer, 85 dan 29%, masing-masing memiliki mutasi pada sampel Pap brus-nya. Sebaliknya,
pada Pap brush yang positif, 93% mengandung setidaknya satu mutasi gen yang identik
dengan tumor primernya. Bagian dari sampel Pap brush dengan mutasi yang juga ditemukan
pada tumor primer lebih tinggi pada kanker endometrium (97%) daripada kanker ovarium
(73%).
Evaluasi Aneuploidy pada sampel Pap brush.
Selain mutasi somatik, aneuploidi ditemukan pada sebagian besar kanker endometrium
dan ovarium ( 28, 30, 31). Untuk menilai aneuploidi, kami menggunakan metode berbasis
PCR untuk memperkuat ~ 38.000 lokus elemen nukleotida berpotongan panjang dengan
pasangan primer tunggal (32) menyebar ke seluruh genom melalui retrotransposisi dan
ditemukan pada lengan autosomal nonakrosentrik 39. Setelah sequencing, data diproses untuk
mengidentifikasi keuntungan atau kerugian pada lengan kromosom tunggal (lihat Bahan dan
Metode).
Aneuploidi terdeteksi dalam sampel Pap brush dari 38% (95% CI, 33 sampai 43%) dari
382 pasien dengan kanker endometrium, termasuk 34 dan 51% dari mereka dengan penyakit
stadium awal dan akhir, masing-masing (tabel S2) . Aneuploidi juga terdeteksi dalam sampel
Pap brush dari 11% (95% CI, 7 sampai 16%) dari 245 pasien kanker ovarium, termasuk 15
dan 9,3% dari mereka dengan penyakit stadium awal dan akhir (tabel S2) . Pada kanker
endometrium dan ovarium, lengan yang paling sering berubah adalah 4p, 7q, 8q, dan 9q,
sesuai dengan laporan sebelumnya ( 28, 30).
Sebaliknya, ketika kami menerapkan uji aneuploidi pada sampel Pap brush dari 714
wanita tanpa kanker, hanya satu wanita yang positif (spesifisitas, ~ 100%; Gbr. 1).
Bahkan jika sampel tidak mengandung perubahan genetik pada 1 dari 18 gen yang dinilai,
sampel tersebut mungkin masih aneuploid dan dapat dideteksi dengan pengujian kami.
Dugaan ini didukung oleh identifikasi kami terhadap enam pasien (tiga dengan endometrium
dan tiga dengan kanker ovarium) yang tidak memiliki mutasi pada sampel Pap brush atau
tumor primer (bila tersedia) tetapi sampel Pap brush menunjukkan aneuploidi. Tes gabungan,
menggabungkan tes yang dijelaskan di atas untuk mutasi ditambah aneuploidi, telah dihapus.
“ PapSEEK”. PapSEEK memberi skor sampel positif jika mengandung mutasi atau nomor
lengan kromosom yang abnormal. Delapan puluh satu persen (95% CI, 77 hingga 85%) dari
sampel Sapbrush dari wanita percobaan kanker PapSEEK-positif, termasuk 78% pasien
dengan penyakit stadium awal dan 92% pasien dengan penyakit stadium lanjut (Gambar 2 dan
3). Tiga puluh tiga persen (95% CI, 27 sampai 39%) dari sampel Pap brush dari wanita
dengan kanker ovarium adalah PapSEEK-positif, dalam mencakup 34% pasien dengan
penyakit stadium awal dan 33% pasien dengan penyakit stadium lanjut (Gambar 2 dan 3).
Hanya 1,4% dari sampel Papbrush dari 714 wanita tanpa kanker yang PapSEEK-positif,
menghasilkan spesifisitas ~ 99% (tabel S6 dan Gbr. 1).

Evaluasi sampel Tao Brush dari pasien dengan kanker ovarium dan endometroium.
Kami bertanya-tanya apakah pengambilan sampel rongga intrauterin yang lebih langsung
dan minimal invasif (daripada saluran endoserviks) dapat meningkatkan sensitivitas
pendekatan ini untuk mendeteksi kanker ginekologi. Untuk mengeksplorasi kemungkinan ini,
kami mengumpulkan sampel intrauterin menggunakan sikat Tao, yang merupakan sikat
fleksibel dan sempit yang ditutupi oleh selubung luar yang dapat ditarik yang memungkinkan
pengambilan sampel langsung dari seluruh rongga endometrium tanpa cedera pada
mikometrium atau kontaminasi dari saluran serviks ( 33). Ini telah disetujui oleh Food and
Drug Administration untuk pengambilan sampel endometrium dan dapat digunakan dalam
pengaturan rawat jalan tanpa memerlukan anestesi. Yang penting untuk tes skrining potensial,
itu ditoleransi dengan baik oleh pasien ( 33, 34).
Kami menerapkan PapSEEK pada sampel sikat Tao yang dikumpulkan dari 123 pasien
dengan kanker endometrium, 51 pasien dengan kanker ovarium, dan 125 wanita tanpa kanker.
Sembilan puluh tiga persen (95% CI, 87 sampai 97%) dari sampel sikat Tao dari pasien
kanker endometrium mengandung perubahan genetik yang terdeteksi oleh PapSEEK,
termasuk 90 dan 98% pasien dengan penyakit stadium awal dan akhir, masing-masing
(Gambar. 3). Gen yang paling sering bermutasi dalam sampel sikat Tao adalah PTEN ( 63%),
TP53 ( 42%), PIK3CA ( 36%), PIK3R1 ( 20%), KRAS ( 17%), CTNNB1 (15%), FGFR2
( 15%), RNF43 ( 11%), PPP2R1A ( 7%), POLE ( 7%), dan FBXW7 ( 6%), mirip dengan
yang diamati pada sampel sikat Pap. MedianMAF adalah 24,7% (IQR, 10,4 hingga 35,4%),
jauh lebih tinggi dari yang diamati pada sampel Pap brush, di mana PMK yang bertema
adalah 4,0% (IQR, 1,3 sampai 12%; tabel S4).
 Perubahan genetik yang terdeteksi oleh PapSEEKditemukan di 45% (95% CI, 31 sampai
60%) dari sampel sikat Tao dari 51 wanita dengan kanker ovarium, termasuk 47 dan 44%
pasien dengan kanker stadium awal dan akhir, masing-masing (Gbr. 3). Gen yang paling
sering bermutasi adalah TP53 ( 86%), konsisten dengan yang diamati pada sampel sikat Pap.
MAF median adalah 0,88% (IQR, 0,35 hingga 3,8%), yang lebih tinggi dari pada sampel Pap
brush (median, 0,54%; IQR, 0,22 hingga 2,6%; tabel S4).

PapSEEK diaplikasikan pada sampel sikat Tao dari 125 wanita tanpa kanker. Tidak ada
(0%) dari perempuan ini yang menguji formutasi positif, menghasilkan spesifisitas 100%
(tabel S6 dan Gambar 1).
Sampel Tao brush dan Pap brush dari wanita yang sama tersedia pada 145 pasien (103
dengan endometrium dan 42 dengan kanker ovarium). Pada kanker endometrium, PapSEEK
positif pada 91% sampel sikat Tao dan pada 82% sampel sikat Pap ( P = 0,02, pertengahan P.
Tes McNemar). Demikian pula, fraksi pasien kanker ovarium dengan tes PapSEEK positif
lebih tinggi untuk Tao brush (45%) dibandingkan dengan Pap brush [17%; P = 0,002,
pertengahan P. Tes McNemar (tabel S1)].
Jaringan tumor tersedia dari 90 dan 88% pasien dengan kanker endometrium dan ovarium
yang menyumbangkan sampel sikat Tao. PapSEEK mengidentifikasi mutasi gen pengemudi
pada 97 dan 80% jaringan kanker endometrium dan ovarium (tabel S5). Dari pasien kanker
endometrium dan ovarium dengan mutasi driver yang teridentifikasi pada tumor primer
mereka, 93 dan 42%, masing-masing, memiliki mutasi yang terdeteksi pada sampel sikat Tao
mereka. Sebaliknya, dari sampel sikat Tao positif dari pasien dengan kanker endometrium
atau ovarium, 91% mengandung setidaknya satu mutasi gen pendorong yang identik dengan
yang diamati pada tumor primer mereka. Fraksi sampel sikat Tao dengan mutasi yang juga
ditemukan pada tumor primer lebih tinggi pada pasien kanker endometrium (97%)
dibandingkan pada pasien kanker ovarium (53%).

Evaluasi dari ctDNA pada pasien dengan kanker ovarium

Kami berhipotesis bahwa kanker ovarium yang tidak dapat diakses dengan pengambilan
sampel sikat Pap atau Tao karena faktor anatomi atau faktor lain mungkin dapat dideteksi
dengan adanya sirkulasi tumorDNA (ctDNA) dalam plasma ( 35). Kami dapat menguji
hipotesis ini pada 83 pasien kanker ovarium yang telah menyumbangkan sampel Pap brush
dan plasma. Karena ukuran ctDNA terdegradasi yang lebih kecil, primer dirancang untuk
memperkuat jarak pendek 67 - menjadi 81 - fragmen DNA pasangan basa (bp), yang meliputi
1.933 posisi nukleotida berbeda dalam 16 gen yang diinginkan, seperti yang dijelaskan
sebelumnya ( 36).
Ketika uji ini diterapkan pada sampel plasma dari 192 individu sehat, tidak ada (0%) yang
dites positif, menghasilkan spesifisitas 100%.
Kami menemukan bahwa 43% (95% CI, 33 hingga 55%) plasma dari 83 pasien dengan
kanker ovarium memiliki ctDNA yang dapat dideteksi. Mutasi yang terdeteksi tercantum
dalam tabel S7. Seperti yang diharapkan, sensitivitas untuk ctDNA dalam plasma lebih tinggi
pada pasien dengan tumor stadium akhir dibandingkan pada pasien dengan tumor stadium
awal (56 berbanding 35%; Gambar 4). Untuk penyakit tahap awal, MAF median dalam
plasma adalah 0,85% (IQR, 0,40 hingga 3,4%), yang lebih rendah dari MAF median (5,7%;
IQR, 0,83 hingga 12%) pada sampel sikat Pap. Setidaknya satu dari mutasi yang diidentifikasi
dalam plasma dapat diidentifikasi pada 88% tumor primer yang sesuai.
Dalam sampel Pap brush dari kohort yang sama dari 83 pasien, 40% positif dengan tes
PapSEEK. Individu yang mendapat skor positif dalam Pap brush dan sampel plasma hanya
sebagian tumpang tindih (Gbr. 2). Hasilnya, 63% (95% CI, 51 hingga 73%) pasien positif
 dengan setidaknya satu dari dua tes. Mereka yang dites positif termasuk 54% pasien dengan
penyakit stadium awal dan 75% dengan penyakit stadium akhir, masing-masing (tabel S1 dan
Gambar. 4)

3. Diskusi
Di sini, kami merancang dan menerapkan tes berbasis PCR multipleks (PapSEEK) untuk
mendeteksi perubahan genetik pada sampel sikat Pap atau sikat Tao (Gbr. 5). Sampel-sampel
ini sangat invasif dan mudah diperoleh selama kunjungan rutin ke kantor. Sebagian besar
kanker endometrium dapat dideteksi dengan PapSEEK: 93% dengan Tao Brush dan 81%
dengan Pap brush. Sebagian besar kanker ovarium juga dapat dideteksi dengan PapSEEK:
45% denganTaoBrush dan33% denganPapbrush. Spesifisitas PapSEEK tinggi, dengan hanya
0 dan 1,4% wanita tanpa kanker yang dites positif dengan sampel Tao dan Pap brush. Kami
juga menunjukkan bahwa tes untuk ctDNA dalam plasma dapat digunakan bersama dengan
PapSEEK pada sampel Pap brush, meningkatkan sensitivitas pendeteksian kanker ovarium
hingga 63%.
kanker ovarium stadium sama tingginya dengan stadium akhir (47 berbanding 44% untuk
Tao; 34 berbanding 33% untuk Pap). Ada dua kemungkinan penjelasan untuk temuan yang
tidak terduga namun menarik ini. Pertama, telah dibuktikan bahwa beberapa kanker ovarium
berasal dari tuba falopi, yang dapat memfasilitasi deteksi dini mereka dengan PapSEEK
ketika sel tumor masuk ke dalam rongga rahim. Kedua, pada tumor stadium akhir, tuba falopi
sering kusut dan dilenyapkan oleh penyakit dan, dengan demikian, kecil kemungkinannya
untuk berfungsi sebagai saluran bagi sel tumor untuk masuk ke dalam rahim atau saluran
endoserviks. Dalam pengaturan ini, penambahan analisis ctDNA dalam plasma ke
pengambilan sampel sikat Pap atau Tao mungkin sangat bermanfaat. Bagian penting dari
sampel kami terdiri dari kanker stadium awal tingkat tinggi. Modalitas diagnostik yang
tersedia saat ini memiliki sensitivitas yang rendah untuk lesi ini ( 37 - 39). Meskipun subtipe
tingkat tinggi hanya mencakup sekitar 10% dari kejadian kanker endometrium, mereka
menyebabkan lebih dari 40% kematian akibat penyakit ( 7). Karena kanker derajat tinggi ini
sering muncul dari latar belakang endometrium atrofi dan dapat bermetastasis sebelum
kelainan yang terlihat pada pencitraan, TVUS memiliki peran terbatas dalam skrining dan
diagnosis dini. Dengan demikian, PapSEEK mendeteksi 85% sangat menggembirakan ( n =
34) dan 89% ( n = 9) kanker endometrium tingkat tinggi yang terbatas pada endometrium
masing-masing dalam sampel sikat Pap dan Tao. Dalam kasus kanker ovarium, kelompok
kami hanya menyertakan sejumlah kecil kasus stadium awal tingkat tinggi, konsisten dengan
fakta yang tidak menguntungkan bahwa kanker ini sering didiagnosis hanya pada stadium
lanjut. Namun demikian, temuan kami bahwa 36% ( n = 11) positif dengan tes gabungan Pap
dan sampel plasma dan 80% ( n = 5) positif dalam sampel sikat Tao penting. Meski
menjanjikan, penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan yang penting untuk diketahui.
Pertama, itu retrospektif daripada prospektif. Sampel yang kami periksa berasal dari pasien
dengan kanker yang diketahui, meskipun sebagian besar berasal dari pasien dengan lesi tahap
awal. Dalam pengaturan skrining, kanker diharapkan berada pada tahap awal, dan kepekaan
untuk pendeteksian diharapkan lebih dekat dengan kepekaan untuk kanker tahap awal yang
diamati dalam penelitian kami. Lebih lanjut, dapat dibayangkan bahwa pengujian gabungan
PapSEEK dalam hubungannya dengan metode konvensional, seperti pengujian CA-125 atau
TVUS, akan memberikan peningkatan sensitivitas tambahan. Sebagian besar pasien dalam
kohort retrospektif kami awalnya didiagnosis menggunakan metode konvensional ini dan,
oleh karena itu, dipilih sebelumnya karena memiliki hasil abnormal berdasarkan tes ini. Ini
menghalangi penilaian akurat dari pengujian gabungan PapSEEK dengan metode deteksi
konvensional dalam penelitian kami. Seorang calon, kelompok yang tidak bias akan lebih
sesuai untuk penilaian semacam itu. Selain itu, dalam studi prospektif, rentang usia dari
kontrol dan kasus akan lebih cocok daripada dalam studi retrospektif kami, dan akan
mencakup pasien dengan tumor jinak dan juga ganas. Kedua, beberapa pasien kanker ovarium
yang memiliki mutasi terdeteksi pada sampel Pap brush atau Tao brush tidak memiliki mutasi
yang identik pada tumor primer mereka. Ini bukan masalah dengan kanker endometrium,
dimana setidaknya satu mutasi pada sampel sikat hampir selalu (97%) ditemukan pada tumor
primer yang sesuai. Namun, itu menjadi masalah bagi pasien kanker ovarium, terutama
dengan sikat Tao. Setidaknya satu mutasi yang dapat diidentifikasi pada sikat Pap dapat
diidentifikasi di 73% dari tumor ovarium primer yang sesuai, sedangkan hal yang sama
berlaku untuk hanya 53% dari sampel sikat Tao. Satu penjelasan yang mungkin untuk
ketidaksesuaian antara mutasi pada sampel sikat dan kanker ovarium dari pasien yang sama
adalah bahwa pengujian tersebut mendeteksi mutasi yang tidak ada secara in vivo, yang
mewakili artefak teknis. Kami tidak percaya bahwa ini mungkin terjadi, mengingat bahwa
spesifisitas pengujian kami masing-masing adalah 100 dan 99% pada sampel sikat Tao dan
sikat Pap. Penjelasan lain yang mungkin adalah heterogenitas tumor ( 40). Hanya sebagian
kecil dari tumor primer yang kami analisis diambil sampelnya dan diurutkan; mutasi
tambahan yang ditemukan pada sampel sikat Pap atau Tao dapat mewakili mutasi dari bagian
lain tumor. Mungkin juga beberapa mutasi berasal dari sinkronus kecil kanker endometrium
atau lesi endometrium premaligna yang tidak diketahui oleh ahli patologi. Sebagian besar
wanita dengan kanker ovarium memiliki kanker endometrium sinkron ( 41 - 43), dengan
faktor risiko termasuk sindrom Lynch, sindrom ovarium polikistik, perimenopause, obesitas,
nuliparitas, dan terapi penggantian estrogen tanpa lawan ( 41, 44).
‘
 Meskipun heterogenitas tumor atau tumor sinkron multipel adalah penjelasan yang layak
yang sering digunakan untuk menjelaskan ketidaksesuaian dalam studi biopsi cair, kami
skeptis bahwa ini adalah penyebab utama. Kami percaya bahwa perluasan klonal dari sel non-
ganas mungkin lebih penting. Proliferasi klonal yang tidak dianggap neoplastik telah

dijelaskan di tulang tulang belakang, kulit, dan jaringan lain ( 45 - 48). Yang menarik adalah
proliferasi klonal sel endometrium yang menyebabkan endometriosis, suatu kondisi yang
berpotensi melemahkan yang mempengaruhi jutaan wanita. Baru-baru ini telah ditunjukkan
bahwa lesi ini, yang dapat terjadi di seluruh pelvis dan berasal dari endometrium, adalah
proliferasi klonal yang dapat didorong oleh mutasi yang sama yang kita deteksi pada kanker
endometrium ( 49). Kemungkinan bahwa mutasi ini mungkin mencerminkan lesi
endometrium jinak atau non-kanker juga konsisten dengan laporan mutasi terkait kanker yang
ditemukan pada lavages rahim wanita tanpa kanker ( 50). Akhirnya, ada kemungkinan bahwa
perubahan hormonal dan fisiologis yang berkontribusi atau diakibatkan oleh kanker ovarium
menstimulasi atau menyeleksi proliferasi klonal seperti itu di lapisan endometrium. Di satu
sisi, penjelasan ini mengkhawatirkan, karena bertentangan dengan spesifikasi khusus yang
menjadi dasar konseptual untuk semua biopsi cair. Di sisi lain, ini sebenarnya dapat
meningkatkan sensitivitas deteksi kanker ovarium, tanpa mengurangi spesifisitas, jika
proliferasi klonal besar hampir secara eksklusif ditemukan pada wanita dengan keganasan
ginekologi. Hanya proliferasi klonal yang mencapai> 0,03% dari total sel di lapisan
endometrium yang dapat dideteksi dengan pengujian kami.

Studi kami meletakkan dasar untuk mengevaluasi PapSEEK dalam studi prospektif yang
besar. Kelompok yang paling alami untuk penelitian semacam itu akan mencakup pasien yang
berisiko tinggi terkena kanker ginekologi karena faktor keturunan, obesitas, atau gejala seperti
perdarahan uterus pascamenopause atau disfungsional. Biaya tes PapSEEK akan lebih dari
 biaya tes Pap tetapi sebanding dengan kolonoskopi, mamografi, dan pencitraan tomografi
terkomputerisasi. Ada banyak masalah yang harus diselidiki dalam uji coba skala besar
tersebut. Misalnya, apakah pengambilan sampel sikat Tao lebih unggul daripada pengambilan
sampel sikat Pap, baik dalam hal sensitivitas dan kepatuhan pasien? Apakah analisis ctDNA
plasma dapat digabungkan dengan PapSEEK? Meskipun analisis ctDNA plasma dapat
meningkatkan sensitivitas dalam kombinasi dengan PapSEEK, hasil ctDNA positif dapat
berasal dari berbagai jenis kanker, dengan demikian mengangkat masalah tentang tindak
lanjut yang sesuai. Akan menggabungkan pengukuran serum CA-125 serial ( 14) atau
penanda protein lainnya ( 51) dengan PapSEEK, atau PapSEEK dengan analisis ctDNA,
menawarkan keuntungan dibandingkan dengan keduanya? Akan mengulangi pengujian
meningkatkan sensitivitas PapSEEK, seperti halnya untuk CA-125 ( 14), dan berapa interval
waktu yang tepat untuk pengulangan seperti itu? Terakhir, apa cara terbaik untuk menangani
pasien dengan tes PapSEEK positif? Haruskah wanita tersebut menjalani histeroskopi serta
TVUS, atau prosedur pencitraan lainnya? Selain itu, jika negatif, seberapa sering mereka
harus diuji ulang, baik dengan PapSEEK atau dengan modalitas pencitraan? Meskipun
jawaban atas semua pertanyaan ini harus menunggu uji coba di masa depan, PapSEEK
menambahkan dimensi lain untuk skrining kanker ginekologi.

4. Bahan dan Metode

Desain Studi
Penelitian retrospektif dengan jumlah sampel yang terkumpul dari 1658 individu ini,
termasuk 656 pasien dengan kanker ovarium atau endometrium dan 1002 kelompok
kontrol. Analisis data dilakukan denga blinded, dan semua pasien dalam sampel
diidentifikasi.

Sampel pasien
Semua sampel untuk penelitian ini diperoleh sesuai dengan protokol yang disetujui oleh
Institutional ReviewBoards of the Johns Hopkins Medical Institutions (Baltimore, MD),
McGill University (Montreal, Quebec, Canada), Sahlgrenska University Hospital
(Gothenburg, Swedia), BioreclamationIVT (Chestertown, MD), Pusat Kanker Memorial Sloan
Kettering (Kota New York, NY), dan Komite Etika Ilmiah Denmark (Kopenhagen, Denmark).
Data stadium demografis, klinis, dan patologis dikumpulkan untuk setiap pasien dengan
kanker dan tercantum dalam tabel S1. Usia rata-rata dari 714 wanita tanpa kanker yang
menjalani analisis Pap brush adalah 34 (kisaran, 17 hingga 67 tahun). Usia rata-rata 125
wanita tanpa kanker yang menjalani analisis sikat Tao adalah 29 (kisaran, 18 hingga 74 tahun).
Semua histopatologi ditinjau ulang oleh ahli patologi bersertifikat. DNA diekstraksi dari
tumor, 27, 52). Pasien yang dievaluasi dalam penelitian ini benar-benar berbeda dari yang
dievaluasi di ( 36). Untuk pengambilan sampel intrauterine, Tao Brush IUMC Endometrial
Sampler (Cook Medical Inc.) dimasukkan dengan hati-hati hingga setinggi fundus uterus.
Selubung luar kemudian ditarik ke belakang, dan sikat diputar 360 ° searah jarum jam dan
berlawanan arah jarum jam. Kemudian, selubung luar didorong lagi, dan perangkat dilepas.
Sampel ditempatkan ke dalam thin-prep buffer, dimana DNA dimurnikan menggunakan kit
pemurnian DNA (Qiagen) menurut produsen. ' s instruksi. DNA yang dimurnikan dari semua
sampel diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya ( 53).
Kontrol yang sehat termasuk pasien dengan temuan sitologi normal pada Pap smear dan
tidak ada riwayat tumor ginekologi. Pasien kanker ovarium dengan riwayat ligasi tuba
dikeluarkan dari penelitian.

Deteksi dan analisis aneuploidi

Untuk setiap sampel, satu pasangan primer digunakan untuk memperkuat ~ 38.000
lokus LINEs di seluruh genom ( 32). Salah satu primer termasuk urutan pengenal unik (UID)
sebagai barcode molekuler untuk mengurangi tingkat kesalahan yang terkait dengan PCR dan
sekuensing. Pengurutan paralel besar-besaran dilakukan pada instrumen Illumina. Data
sekuensing kemudian diolah untuk mengidentifikasi keuntungan atau kerugian lengan
kromosom tunggal, serta ketidakseimbangan alel pada 39 lengan kromosom, menggunakan
softwareWithin-Sample AneupLoidyDetectiOn (WALDO) ( 54). WALDO menggabungkan
mesin vektor dukungan (SVM) untuk membedakan antara sampel aneuploid dan euploid.
SVM dilatih menggunakan 3150 sampel aneuploid sintetik dengan kandungan neoplastik
rendah dan 677 sampel sel darah putih perifer euploid. Sampel dinilai sebagai positif
(aneuploid) jika skor diskriminan SVM melebihi ambang yang diberikan atau jika peningkatan
lengan kromosom 7q dan 8q diamati. Lengan kromosom ini sering ditemukan pada kanker
endometrium dan ovarium.

Deteksi dan analisis mutasi somatik

DNA dari sampel Pap brush, sampel Tao brush, atau tumor primer diamplifikasi dalam
tiga PCR multipleks dengan 139 pasang primer yang dirancang untuk memperkuat segmen
110 hingga 142 bp. Segmen ini berisi kawasan yang diminati dari 18 gen berikut: AKT1,
APC, BRAF, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, FBXW7, FGFR2, KRAS, MAPK1, NRAS,
PIK3CA, PIK3R1, POLE, PPP2R1A, PTEN, RNF43, dan TP53. Untuk setiap sampel, tiga
reaksi multipleks, masing-masing mengandung amplikon nonoverlapping, dilakukan, seperti
dijelaskan sebelumnya ( 55). Setiap sampel dinilai di dua sumur duplikat. DNA dari plasma
diamplifikasi dalam dua PCR multipleks yang terdiri dari 61 pasang primer yang dirancang
untuk perkuat perkuat segmen 67- hingga 81-bp. Setiap sampel dinilai di enam sumur
duplikat. Segmen ini berisi wilayah yang diminati dari gen berikut: AKT1, APC, BRAF,
CDKN2A, CTNNB1, EGFR, FBXW7, FGFR2, GNAS, HRAS, KRAS, NRAS, PIK3CA,
PPP2R1A, PTEN, dan TP53 (36). Safe-SeqS, teknologi pengurangan kesalahan untuk
mendeteksi mutasi frekuensi rendah ( 27), digunakan untuk semua analisis sekuensing. Satu
primer di setiap pasangan termasuk UID, yang terdiri dari 14 basa degenerasi dengan peluang
yang sama untuk menjadi A, C, T, atau G. Pembacaan urutan berkualitas tinggi dipilih
berdasarkan skor kualitas, yang dihasilkan oleh pengurutan instrumen untuk menunjukkan
probabilitas bahwa basis dipanggil karena kesalahan. Pembacaan yang berlebihan yang timbul
dari duplikasi optik dihilangkan dengan mewajibkan pembacaan dengan UID dan indeks
sampel yang sama setidaknya terpisah 5.000 piksel saat berada di ubin yang sama. Dibaca dari
templatemolekul umum kemudian dikelompokkan berdasarkan UID yang digabungkan
sebagai kode batang molekuler. Mutasi artefaktual yang diperkenalkan selama persiapan
sampel atau langkah-langkah pengurutan dikurangi dengan mewajibkan adanya mutasi pada>
90% pembacaan di setiap keluarga UID (untuk dinilai sebagai a “ supermutant ”)

Analisis data sequencing

Semua sampel Pap brush dan Tao brush dianalisis menggunakan pendekatan berbasis
MAF. Mutasi yang memenuhi salah satu dari dua kriteria berikut dianggap: (i) ada dalam
database COSMIC (Catalog of Somatic Mutations inCancer) ( 56) atau (ii) diperkirakan tidak
aktif pada gen penekan tumor (non-sensor, insersi atau penghapusan di luar bingkai, dan
sitemutasi sambungan kanonik). Mutasi sinonim [kecuali yang di ujung exon ( 57)] dan mutasi
intronik (kecuali untuk situs sambatan) dikeluarkan. Akhirnya, mutasi yang tidak dapat
dipetakan secara unik ke hg39 dikeluarkan dari analisis. MAF dari setiap mutasi dalam sampel
yang menjadi perhatian pertama-tama dinormalisasi berdasarkan bagaimana distribusi MAF
dari mutasi yang sama dalam kelompok kontrol dibandingkan dengan distribusi MAF dari
semua mutasi pada kelompok kontrol. Setelah normalisasi khusus mutasi ini, a P. Nilai
tersebut diperoleh dengan membandingkan MAF ternormalisasi dari setiap mutasi di setiap
sumur dengan referensi distribusi MAF ternormalisasi yang dibangun dari kontrol normal di
mana semua mutasi dimasukkan. Stouffer ' s Z skor kemudian dihitung dari P. nilai dua sumur
independen, tertimbang dengan jumlah UIDnya. Stouffer ' Metode s digunakan karena jumlah
sampel di setiap sumur dinilai secara independen dari sumur lainnya. Untuk penilaian ini, 10
ng DNA di alikuotasikan ke masing-masing dua sumur, yang kemudian diamplifikasi secara
independen, diurutkan secara independen (melalui penggunaan barcode sumur), dan dianalisis
secara independen. Asumsi (hipotesis nol) di mana P. Nilai yang dihitung untuk setiap sumur
adalah sebagai berikut: Kami berasumsi bahwa sumur tidak mengandung mutasi driver dan
bahwa setiap mutasi latar belakang yang diidentifikasi sebenarnya adalah PCR atau artefak
sekuensing, yang mengikuti distribusi referensi yang dibangun dari kontrol normal. Oleh
karena itu, hipotesis nolnya adalah bahwa mutasi latar belakang di dua sumur berasal dari
distribusi referensi yang sama, tetapi kedua sumur itu independen (variabel acak yang
terdistribusi secara independen dan identik).

Sampel diberi skor sebagai positif ketika salah satu mutasinya memiliki nilai di atas
ambang batas yang sesuai untuk salah satu dari tiga kriteria berikut: (i) perbedaan antara
MAF-nya dan MAF maksimum terkait yang diamati untuk mutasi tersebut pada kontrol, (ii)
rasio Stouffer-nya ' s skor Z ke rata-rata dari enam Stouffer bukan nol tertinggi ' skor s Z untuk
mutasi yang sama pada kontrol, atau (iii) Stouffer-nya ' s skor Z sendiri saat mutasi tidak
terlihat di kontrol. Ambang batas ditentukan untuk memastikan keseluruhan spesifisitas yang
diinginkan.

Sensitifitas dan spesifitas diperoleh dari persilangan 10 kali lipat. validasi. Di masing-
masing dari 10 putaran, sampel Pap brush dari 90% dari 714 wanita tanpa kanker berfungsi
sebagai kontrol dalam set pelatihan, dengan 10% sisa sampel Pap brush dari wanita tanpa
kanker dinilai untuk mendapatkan spesifisitas. Kontrol di setiap putaran dipilih secara acak
untuk memastikan bahwa masing-masing dari 714 sampel normal Pap brush diberi skor tepat
satu kali setelah 10 putaran validasi silang untuk mendapatkan spesifisitas keseluruhan. Semua
sampel lainnya diberi skor satu kali di masing-masing dari 10 putaran dengan total 10 kali dan
dianggap positif secara keseluruhan jika mereka mencetak positif lebih dari separuh waktu
(lima putaran atau lebih). Mutasi pada sampel sikat Pap dan Tao yang mendapat skor positif
tercantum pada tabel S4.

Untuk sampel plasma, sensitivitas dan spesifisitas juga diperoleh dari validasi silang 10
kali lipat. Di masing-masing 10 putaran, sampel plasma dari 90% dari 192 individu sehat
berfungsi sebagai kontrol dalam set pelatihan, dengan 10% sisanya diberi skor untuk
mendapatkan spesifisitas, seperti untuk sampel sikat Pap dan Tao yang dijelaskan di atas.
Kontrol dalam set pelatihan di setiap putaran dipilih secara acak dengan cara memastikan
bahwa masing-masing dari 192 sampel plasma normal diberi skor tepat sekali dalam 10
putaran validasi silang untuk mendapatkan spesifisitas keseluruhan. Selain itu, analisis sampel
plasma dilakukan dengan menggunakan pendekatan Bayes empiris. Dalam setiap putaran
validasi silang, a b distribusi dipasang berdasarkan MAFs dalam kontrol normal (90% dari 192
sampel plasma dari individu sehat yang digunakan pada putaran tertentu) menggunakan
estimasi kemungkinan maksimum (MLE). Selanjutnya, MAF dari semua mutasi pada kontrol,
serta sampel yang akan diberi skor, disesuaikan sebagai berikut dimana Sebuah dan b adalah
parameter yang diperoleh dari MLE.
 Nilai kemudian dihitung untuk setiap mutasi di masing-masing sumur independen dengan
perbandingan dengan distribusi MAF yang disesuaikan di antara kontrol. Keseluruhan P. nilai
untuk setiap mutasi diperoleh sebagai produk dari P. nilai dari keenam sumur independen.
Sebuah sampel dianggap positif jika positif dalam lima putaran atau lebih dari validasi silang
10 kali lipat. Mutasi pada sampel dengan skor positif tercantum dalam tabel S7. Interval
kepercayaan untuk sensitivitas dan spesifisitas dihitung dengan asumsi distribusi binomial,
dengan sensitivitas dan spesifisitas aktual ditetapkan sebagai probabilitas keberhasilan yang
sesuai.