Prosedur Operasional Baku

Standard Operating Procedure

SOP

UJI HAEMAGGLUTINASI

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
INHIBISI (HI) UNTUK
DETEKSI ANTIBODI
NEWCASTLE DISEASE
(ND)

Balai Veteriner Lampung

Jl. Untung Suropati No.2 Labuan Ratu, Bandar Lampung
Phone : (0721) 701851, Fax : (0721772894
Email: Bppvreg3@gmail.com
1
HALAMAN REVISI

Revisi Penulis Mengesahkan Tanggal

pengesahan

Revisi Tanggal Rincian perubahan

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
Penulis Drh. Syarifah Alawiah Agustus 2018
Drh. Septianita Evarozani
Disahkan oleh Drh. Nasirudin, MS.c
Publikasi oleh Balai Veteriner Lampung

i
 DAFTAR ISI

1. PENDAHULUAN 1
1.1 Penyakit Newcastle Disease 1
1.2 Etiologi 1
1.3 Diagnosa Newcastle Disease 1
1.4 Uji Haemaglutinasi & Uji Haemaglutinasi Inhibisi (HI) 2
1.5 Daftar Pustaka 2
2. PERALATAN 2
3. BAHAN UJI 3
3.1 Reagensia 3
3.2 Contoh Uji. 3
3.3 Antigen 3
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

3.4 Bahan Acuan 3

4. PERSIAPAN 3
4.1 Kualifikasi Penguji 3
4.2 Persiapan contoh 3
4.3 Persiapan Peralatan 4
5. PROSEDUR UJI 4
5.1 Uji Haemagglutinasi (HA) 4
5.2 Uji Haemaglutinati Inhibisi (HI) 5
6. HASIL 5
6.1 Pembacaan Uji Haemagglutinati Inhibisi (HI) 5
7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN CONTOH 6
7.1 Contoh negatif 6
7.2 Contoh positif 6
8. JAMINAN MUTU 6
9. LAMPIRAN 6
9.1 Sel Darah Merah / Red Blood Cell (RBC 10%) 6
9.2 Phosphate Buffered Saline (PBS) 7
9.3 Pembuatan Alsever’s Solution 7
10. LEMBAR KERJA 8

ii
1. PENDAHULUAN
1.1 Penyakit Newcastle Disease
Newcastle Disease (ND) adalah penyakit viral pada unggas. Meskipun
banyak jenis unggas yang dilaporkan dapat terserang ND, namun ayam
merupakan jenis unggas yang paling rentan. Gejala klinis beragam mulai
dari gejala subklinis sampai kematian mendadak, tingkat kematian
(morbiditas dan mortalitas) mencapai 100% dan kerugian ekonomi yang
tinggi. Penyakit ND termasuk dalam daftar A dari Office International
des Epizootica (OIE), yaitu penyakit yang sifat penyebarannya cepat.
Sumber virus biasanya berasal dari eksreta ayam terinfeksi baik melalui
pakan, air minum, lendir, feses, udara yang tercemar virus, peralatan
dan pekerja kandang. Patogenitas virus ND dipengaruhi oleh galur virus,
rute infeksi, umur ayam, lingkungan dan status kekebalan ayam saat
terinfeksi virus. Selama sakit ayam mengeluarkan virus melalui feses.

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
1.2 Etiologi
Virus ND atau Avian paramyxovirus-1 diklasifikasikan dalam golongan
genus Avulavirus. Virus ini berbentuk pleomorfik, sebagian besar
berbentuk bulat kasar dengan diameter 100-500 nm dan bentuk
filament dengan diameter 100 nm. Genom virus ND bersifat single-
stranded (ss), berpolaritas RNA negative dengan panjang genom 15,186
nukleotida dan tidak bersegmen. Virus ND dikelompokkan ke dalam
4 galur, yaitu: velogenik (keganasannya paling tinggi), mesogenik
(keganasannya sedang), lento-genik (keganasannya paling rendah)
dan asimtomatik enterik (sama sekali tidak ganas). Dari 6 jenis
protein tersebut, hanya dua jenis protein yakni protein F dan HN, yang
merangsang pembentukan antibodi protektif.

1.3 Diagnosa Newcastle Disease

Diagnosis penyakit ND dapat dilakukan dengan uji serologis antara lain
Haemaglutinasi (HA), Haemaglutinasi Inhibisi (HI), Neutralisasi virus
dalam embrio ayam, netralisasi virus dalam kultur sel, MIT test, Egg bit,
ELISA, Agar Gel Presipitasi (AGP). Sedangkan antigen virus dapat dilacak
dengan teknik Imunohistokimia dan Immunoflurescence dan uji PCR.
Uji yang akurat dan spesifik diperlukan untuk ketepatan diagnosa virus
penyebab ND. Standar referensi untuk mendiagnosis virus ND adalah
isolasi virus.

1
 1.4 Uji Haemaglutinasi & Uji Haemaglutinasi
Inhibisi (HI)
Prinsip uji Hemaglutinasi (HA) dan Hemagglutinati Inhibisi (HI) adalah
melihat kemampuan antigen ND mengaglutinasi sel darah merah yang
ditetapkan dengan nilai HAU dan kemampuan antibodi ND dalam
menghambat terjadinya aglutinasi sel darah merah. Uji HA & HI ini
bertujuan untuk mengetahui titer antibodi yang masih menghambat
secara total, mengukur kekuatan antigen dan untuk menentukan titer
antigen (4 HAU).

1.5 Daftar Pustaka

Alexander, D.J. 1988a. Newcastle disease Virus- An Avian Paramyxivirus
In: Newcastle Disease.(ed. D.J. Alexander).pp 11-12. Kluwer Academic
Publication. London.
Hewajuli. D.A.,dkk. 2011. Patogenitas Virus New Castle Disease Pada
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

Ayam. Bogor
Krisnamurthy, S. and S.K.Samal. 1988. Nucleotide sequences of
the trailer, nucleocapsid protein gene and intergenic regions of
Newcastle disease virus strain Beaudette C and completion of the
entire genom sequence.J.Gen.Virol.79:2419-2424.
Panda, A., Z. Huang, S. Elankumarang, D.D. Rockeman and SK. Samal.
2004. Role of fusion protein cleavage site in the virulence of
Newcastle disease virus. Mocrobiol.Pathol. 36: 1-10.
OIE. Office International Des Epizooties. 2012. OIE Terrestrial Manual.
NewcastleDisease.
http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/
2.03.14._ND.pdf

2. PERALATAN
Peralatan yang digunakan pada pengujian ini adalah single and
multichannel mikropippet terkalibrasi, mikroplate tipe V yang memiliki
96 lubang, mikromixer, penutup plate refigerator, multidrop digunakan
sebagai tempat reagensia dan waterbath.

2
3. BAHAN UJI
3.1 Reagensia
Reagen yang dipakai adalah Phosphate Buffered Saline (PBS), Sel Darah
Merah Ayam 10% dan Alsever’s.

3.2 Contoh Uji.

Contoh uji adalah serum ayam. Serum ini bisa berasal dari hewan
sembuh dari ND atau post vaksinasi.

3.3 Antigen
Antigen yang digunakan untuk uji deteksi antibodi ND ini bisa diperoleh
secara komersial yang bersertifikat dan memiliki nilai acuan tertentu.

3.4 Bahan Acuan

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
3.4.1. Kontrol positif
Bahan acuan yang digunakan adalah serum kontrol positif
terstandard dan bersertifikat yang dibuat oleh BVet Lampung
dan memiliki nilai acuan tertentu.
3.4.2. Kontrol negatif
Bahan acuan yang digunakan adalah serum kontrol negatif
terstandard dan bersertifikat yang dibuat oleh BVet Lampung
dan memiliki nilai acuan 0

4. PERSIAPAN
4.1 Kualifikasi Penguji
Uji Haemaglutinasi ND ini harus dilakukan oleh penguji yang
bersertifikat. Ditunjuk oleh atau SK Ka. Balai/Personil penguji
memahami penanganan dan keamanan bahan uji serta keamanan
lingkungan pengujian. Personil penguji bekerja menggunakan Alat
Pelindung Diri (APD) sesuai prosedur yaitu jas laboratorium, sarung
tangan dan masker.

4.2 Persiapan contoh

Contoh yang dipakai yaitu serum ayam. Sebelum di uji, semua serum
diinaktifkan pada suhu 56oC selama 30 menit.

3
 4.3 Persiapan Peralatan
Pengujian menggunakan peralatan yang sudah terkalibrasi.
Menggunakan bahan uji yang terstandar dan tersimpan baik.

5. PROSEDUR UJI
5.1 Uji Haemagglutinasi (HA)
Uji Haemagglutinasi (HA) dilakukan untuk mengukur titer antigen ND.
Uji ini menetapkan nilai 1 HAU dan nilai 4 HAU antigen ND. Uji HA harus
dilakukan sebelum Uji Haemaglutinasi inhibisi (HI).

1. Siapkan mikroplate tipe V

2. Tambahkan 25 µl PBS ke semua lubang
(3 baris , contoh baris A,B,C)
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

3. Tambahkan 25 µl antigen pada lubang 1(copntoh :

A1,B1 C1)
4. Lakukan pengenceran dari lubang 1 sampai 12, buang 25 µl lubang
terakhir
5. Tambahkan 25 µl PBS pada semua lubang, campur dengan
menggunakan micromixer selama 10 detik
6. Tambahkan 25 µl sel darah merah ayam 1% pada semua lubang,
campur dengan menggunakan micromixer selama 10 detik dan
inkubasi selama 40 menit
7. Baca hasil

5.1.1. Pembacaan uji HA

Hasil uji HA dilakukan dengan menentukan nilai 1 HAU antigen
ND yaitu pemgenceran tertinggi yang memperlihatkan reaksi
aglutinasi sel darah merah dengan optimal. Dengan diketahui
nilai pengenceran virus ND = 1 HAU, maka dapat ditentukan
pengenceran antigen ND senilai 4 HAU.
5.1.2. Perhitungan HA Unit
Jika uji HA antigen didapat nilai 1 HAU 256 maka di dapatkan
nilai 4 HAU 64. Sehingga pengenceran yang dipakai yaitu 1:63
unit.

4 2 1 – HAU

4
5.2 Uji Haemaglutinati Inhibisi (HI)
1 Siapkan mikroplate tipe V dan label mikroplate
2 Tambahkan 25 µl PBS pada semua lubang
3 Tambahkan 25 µl serum pada lubang 1 dan lubang 12 (sebagai kontrol)
4 Buat pengenceran pada lubang pertama sampai lubang 11, buang 25
µl dari lubang 11
5 Tambahkan 25 µl antigen pada lubang 1-11, campur menggunakan
mikromixer selama 10 detik dan inkubasi selama 30 menit
6 Tambahkan 25 µl RBC 1% pada lubang 1-12, campur menggunakan
mixer selama 10 detik dan inkubasi selama 40 menit
7 Baca Hasil
Aglutinasi positif ditunjukkan dengan adanya lapisan merah granular,
difusi pada dasar plate sedangkan aglutinasi negatif ditunjukkan dengan
tidak adanya lapisan merah granular pada dasar plate.

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
6. HASIL
6.1 Pembacaan Uji Haemagglutinati Inhibisi (HI)
Jika waktu inkubasi selesai segera dimulai pembacaan nilai titer dari
serum yang diuji. Serum yang positif mengandung antibodi virus ND
ditandai dengan endapan seperti lubang kontrol (tetesan airmata). Titer
serum ditentukan dari pengenceran serum tertinggi yang masih mampu
menghambat antigen 4 HAU untuk mengaglutinasi sel darah merah 1%.
Apabila pada pengenceran serum 1:16 terjadi hambatan haemaglutinasi,
maka titer antibodi adalah 16.
Nilai titer ≥16, contoh dinyatakan positif dan nilai titer <16 contoh
dinyatakan negatif.
Hasil pengujian dicatat dan dilaporkan pada lembar uji yang di
dokumentasikan.

5
 7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN
CONTOH/BIOSAFETY & BIOSECURITY
7.1 Contoh negatif
Contoh yang memiliki titer rendah atau negatif haemaglutinasi disimpan
pada suhu 4 °C jika hanya disimpan selama 7 hari dan -80°C jika akan
disimpan lama. Contoh dapat disimpan sebagai referen / koleksi dan
dimusnakan sesuai dengan SOP pemusnahan.

7.2 Contoh positif

Contoh yang memiliki titer antibodi sedang dan titer antibodi tinggi
yang dinilai positif haemaglutinasi disimpan pada suhu 4 °C jika hanya
disimpan selama 7 hari dan -80°C atau suhu dibawahnya jika akan
disimpan lama. Contoh dapat disimpan sebagai referen / koleksi dan
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

dimusnakan sesuai dengan dokumen prosedur.

8. JAMINAN MUTU
Titer antigen dapat diterima jika nilai Antigen Back Titrasi tepat
(menunjukan nilai antara 2 dan 8 HA Unit), maka uji HA dan HI absah/
nilainya benar. Sehingga pengujian tidak perlu diulang.

9. LAMPIRAN
9.1 Sel Darah Merah / Red Blood Cell (RBC 10%)
9.1.1. Darah ayam dalam Alsever dapat disimpan pada 4°C
selama 1 bulan namun jika terjadi hemolisis yang ditandai
perubahan warna maka tidak dapat digunakan.
Catatan: ratsio darah dan Alsever adalah 1:1.
9.1.2. Darah dan alsever dimasukan pada sentrifus tube ukuran
50 ml secara hati-hati.
9.1.3. Tube diisi dengan PBS dan disentrifus pada 1500 g selama
5 menit.
9.1.4. Buang supernatan dan tube diisi lagi dengan PBS.
9.1.5. Sel darah dicuci sebanyak 3 kali. Pencucian terakhir,
supernatan dibuang dan pada sel darah merah ditambahkan

6
 kembali 5 ml PBS secara perlahan. Dan didapatkan nilai
konsentrasi 10% sel darah merah.
9.1.6. Packed cell volume (PCV) pada sel darah merah diukur
dengan menggunakan tabung hematokrit. Sel darah merah
10% dalam hematokrit disentrifus selama 5 menit. Perhitungan
volume akhir sel darah yaitu: Volume akhir = (PCV / 10) x 5
9.1.7. Sel darah merah yang sudah dicuci disimpan pada 4°C
dan diencerkan dengan perbandingan1 :9 dengan PBS untuk
mendapatkan konsentrasi 1%.

9.2 Phosphate Buffered Saline (PBS)

NaCL 8.0 g
KC1 0.2 g
Na2HPO4 1.15 g

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
KH2PO4 0.2 g
Dilarutkan dengan 1 liter aqua destilata pH 7.3

9.3 Pembuatan Alsever’s Solution

Citric acid 0.55 g
Glucose 20.50 g
NaCl 4.20 g
Sodium Citrate 8.00 g
Dilarutkan dengan 1 literaqua destilata dan Autoclave selama 15
minutes pada suhu 115°C.

7
 10. LEMBAR KERJA

LEMBAR KERJA
Uji Haemaglutinasi Inhibisi (HI)

Nomor Epi : .......................................................................................

Kode Lab : .......................................................................................
Jumlah contoh uji : .......................................................................................
Jenis contoh uji : .......................................................................................
Jenis Hewan : .......................................................................................
Tanggal terima : .......................................................................................
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

Tanggal pengujian : .......................................................................................

Penguji : .......................................................................................
Penyelia : .......................................................................................
Operator Input Data : .......................................................................................
Kondisi contoh uji : .......................................................................................

Identifikasi Reagen
Kontrol Positif : ……………………. Produksi …………………
No Batch………..……..Titer………………….
Kontrol Negatif : ……………………. Produksi …………………
No Batch ………………Titer………………….
Antigen: ……………………. Produksi …………………
Tgl buka …………….. Expeted titer ……….
PBS : ……………………….
Tgl Buat ………….........................
RBC : …………% ...........
Tgl Buat ………………………………….

8
Komentar Penguji:
…………………………………………………………………………………
………………………………………………………………..

Hasil Uji
Uji HA antigen................

Plate 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1
B
C
D
E

UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)
F
G
H

HAU :
4 HAU :

Uji AST

Plate 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C

Lampiran

No No Epi Kode Asal Hasil Ctatan

Lab Contoh

dst

9
 Kesimpulan
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..
Saran
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..

Tanggal .....................................

Penguji Penanggung Jawab Lab

............................................ ...................................................
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)

10
11
UJI HAEMAGGLUTINASI INHIBISI (HI) UNTUK DETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE (ND)