Prosedur Operasional Baku

Standard Operating Procedure

SOP

ISOLASI DAN
IDENTIFIKASI VIRUS

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
AVIAN INFLUENZA
PADA TELUR AYAM
BERTUNAS

Balai Besar Veteriner Wates

Jl. Raya Yogya – Wates Km. 27, TP 18, Giri Peni, Wates, Kabupaten Kulon Progo,
Daerah Istimewa Yogyakarta 55651
Tlp: (0274) 773168; FAX: (0274) 773 354
email: bbvetwates@pertanian.go.id
website:bbvetwates.ditjenpkh.pertanian.go.id
1
HALAMAN REVISI

Revisi Penulis Mengesahkan Tanggal

pengesahan

Revisi Tanggal Rincian perubahan

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
Penulis Drh. Trian Mahawan 15 Maret 2019
Drh. Hendra Wibawa MSc., Ph.D
Disahkan oleh Drh. Bagoes Purmadjaja
Publikasi oleh BVET Subang – BBVET Wates

i
 DAFTAR ISI

1. PENDAHULUAN 1
1.1 Avian Influenza 1
1.2 Etiologi Penyakit 1
1.3 Diagnosa Penyakit 1
1.4 Uji Isolasi Virus Ai pada Telur Ayam Bertunas dan
Identifikasi 3
1.5 Daftar Pustaka 3
2. PERALATAN 4
2.1 Peralatan Untuk Isolasi Virus Pada T.A.B 4
3. BAHAN 4
3.1 Reagensia 4
3.2 Bahan Biologik 5
3.3 Contoh Uji 5
3.4 Bahan Acuan 5
4. PERSIAPAN 6
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

4.1 Kualifikasi Penguji 6

4.2 Persiapan Peralatan 6
4.3 Persiapan Bahan dan Reagen 6
4.4 Persiapan Contoh 6
5. PROSEDUR 6
5.1 Pembuatan inokulum contoh 6
5.2 Inokulasi TAB 7
5.3 Uji aglutinasi cepat (kualitatif) 7
5.4 Inaktivasi Virus Avian Influenza Menggunakan
Binary Ethlenimine (BEI) 8
5.5 Identifikasi Virus 9
6. HASIL 10
6.1 Interpretasi 10
6.2 Identifikasi virus dari cairan allantois 10
7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN CONTOH 10
8. JAMINAN MUTU /QUALITY ASSURANCE 11
9. LAMPIRAN 11
9.1 Reagensia 11
9.2 Pencampuran PBS dengan Antibiotik 12
10. LEMBAR KERJA 13

ii
1. PENDAHULUAN
1.1 Avian Influenza
Penyakit highly pathogenic avian influenza (HPAI) H5N1 telah mewabah di
Indonesia pada unggas golongan ayam (gallinaceous) seperti ayam layer,
ayam broiler, ayam kampung dan puyuh, sedangkan itik dan unggas air
yang lainnya relatif tahan sejak pertengahan tahun 2003. Namun, pada
akhir 2012 terjadi outbreak penyakit HPAI H5N1 pada itik dengan tingkat
morbiditas dan mortalitas tinggi. Akhir 2016 juga dilaporkan adanya
outbreak penyakit LPAI H9N2 pada peternakan layer yang dikenal dengan
istilah sindrom drop produksi “90/80 – 40/50”. Sindrom penyakit ini ditandai
dengan penurunan produksi telur dari puncak produksi 90/80% menjadi
40/50% dengan tingkat kematian yang rendah (dibawah 5%). Selain
penyakit HPAI H5N1 dan LPAI H9N2 yang ada di Indonesia, juga patut
diwaspadai adanya ancaman penyakit AI lain yang masih eksotik (exotic
disease) yang menjadi isu global.

1.2 Etiologi Penyakit

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
Avian Influenza (AI) adalah penyakit hewan menular yang menyerang
unggas disebabkan oleh virus Influenza tipe A. Virus AI merupakan virus
RNA dengan 8 segmen genom (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP, NS) dan
termasuk dalam famili virus Orthomyxoviridae. Virus ini dapat dibagi
menjadi beberapa subtipe berdasarkan kharakteristik antigen permukaan
virus, yaitu hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA). Telah ditemukan 18
subtipe HA (H1-H18) dan 11 subtipe NA (N1-N11), dimana subtipe H1-H16
dan N1-N9 umum ditemukan pada bangsa burung dan beberapa pada
mamalia, sedangkan subtipe H17-H18 dan N10-N11 sampai saat ini hanya
ditemukan pada kelelawar. Selain itu virus AI dapat digolongkan menjadi
virus AI patogen (highly pathogenic avian influenza/HPAI) dan virus AI non/
low patogen (low pathogenic avian influenza/LPAI).

1.3 Diagnosa Penyakit

Diagnosa penyakit AI secara laboratoris dilakukan dengan isolasi virus AI
pada telur ayam bertunas yang dilanjutkan dengan identifikasi subtyping
AI dengan uji hemaglutination inhibition (HI). Selain itu deteksi antigen
bisa dilakukan dengan teknik polymerase chain reaction (PCR) dan antigen
capture rapid test. Untuk deteksi antibodi AI metode yang dilakukan adalah
uji agar gel immunodiffusion (AGID), uji HI (hemagglution inhibition) dan uji
ELISA. Menurut OIE masing-masing uji memiliki kelebihan dan kekurangan.
Namun, untuk deteksi agen penyakit metode yang direkomendasikan
adalah isolasi virus dan PCR, sedangkan untuk deteksi respon kekebalan
antibodi direkomendasikan dengan uji HI sebagaimana petunjuk dari OIE
(2015) dalam tabel di bawah ini.
1
2
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

Tabel 1. Jenis pengujian untuk diagnosis AI dan tujuan pengujian (OIE, 2015)
Method Purpose
Population Individual animal freedom Contribute to Confirmation of Prevalence Immune status in
freedom from from infection prior to eradication clinical cases of infection - individual animals or
infection movement policies surveillance populations post-
vaccination
Agent identification1
Virus -
isolation + +++ + +++ +
Antigen -
detection + + + + +
Real-time -
RT-PCR ++ +++ ++ +++ ++
Detection of immune response
AGIO + + ++ + ++ ++
(Influenza A) (Influenza A) (Influenza A) (convalescent) (Influenza A) (Influenza A)

HI +++ (HS or H7) ++ (H5 or H7) +++ (H5 or H7) ++ +++ (HS or H7 +++ (H5 or H7)
(convalescent)
ELISA + + ++ + ++ ++
(convalescent)
Key: +++ = recommended method; ++ = suitable method; + = may be used in some situat ions,but cost, reliability, or other factors severely limits its application; - = not
appropriate for this purpose.
Although not all of the tests listed as category +++ or ++ have undergone formalvalidation,their routine nature and the fact that they have been used widely without
dubious results, makes them acceptable.
RT-PCR = reverse-transc ription polymerase chain reaction; AG ID = agar gel immunodiffusion; HI = haemagglutination inhibition test ELISA = enzyme-linked
immunosorbent assay.
1.4 Uji Isolasi Virus Ai pada Telur Ayam Bertunas
dan Identifikasi
Contoh dapat berupa swab/organ/feses/bulu/contoh lingkungan
atau material lain yang terkontaminasi virus AI, dipreparasi dan
diinokulasikan ke dalam ruang alantois (saccus allantois) telur ayam
bertunas (TAB) umur 9-11 hari. Dalam TAB virus akan bereplikasi
dalam sel membran korio alantois (CAM) dan sel embryo; dan akan
ditemukan bebas dalam konsentrasi tinggi dalam cairan alantois. Virus
dapat mematikan dan juga tidak mematikan TAB ketika bereplikasi
dalam sel. Cairan alantois dari TAB yang diinokulasi selanjutnya
diuji hemagglutinasi (HA) sel darah merah ayam untuk mengetahui
ada tidaknya virus hidup setelah pasase pertama dan kedua. Uji HA
dilakukan untuk mengukur secara kuantitatif titer virus/antigen AI. Jika
hasil uji HA pasase pertama negatif maka dilanjutkan dengan minimal
dua kali pasase tambahan. Jika HA positif, dilanjutkan identifikasi virus
AI dengan uji hambatan hemaglutinasi atau hemaglutination inhibition
(HI) menggunakan antiserum standard yang spesifik terhadap subtipe
virus AI.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
1.5 Daftar Pustaka
Anonim, 2008, Manual Test Methods of Standard Operating Procedure
Haemagglutination (HA) Isolation, Australian Animal Health
Laboratory, CSIRO Livestock Australia, p. 1-19
Muflhanah, Andesfha E, Wibawa, H., Zenal C.F., Hendrawati, F., Siswani,
Wahyuni, Kartini, Dini., et all 2018. Kasus Pertama Low Pathogenic
Avian Influenza Subtipe H9N2 pada Peternakan Ayam Petelur di
Kabupaten Sidrap Sulawesi Selatan Indonesia. Proceding Rapat
Teknis dan Pertemuan Ilmiah, Yogyakarta, April 2018
OIE. 2015. Chapter 2.3.4: Avian Influenza (Infection with Avian Influenza).
OIE Terrestrial Manual, Office International des Epizooties (OIE). Pp.
465-481.
Swayne D. 2007. Understanding the complex pathobiology of high
pathogenicity avian influenza viruses in birds. Avian Diseases, 51 (1):
242-249
Swayne, D.E., D.A. Senne, and C.W. Beard, 1998, Avian Influenza, In A
Laboratory Manual for The Isolation and Identification of Avian
Pathogens, 4th edition, Pp. 150-155
Swayne, D.E. and D.A. Halvorson , 2003, Influenza, In Disease of Poultry,
11th edition, Iowa State Press, A Blackwell Publishing Company, Pp.
135-160

3
 Tong S., Li Y., Rivailler P., Conrardy C., Castillo D.A., Chen L.M., Recuenco
S., Ellison J.A., Davis C.T., York I.A., et al. 2012. A distinct lineage of
influenza A virus from bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 109:4269–4274.
WHO/OIE/FAO) H5N1 Evolution Working Group. 2012. Revised and
updated nomenclature for highly pathogenic avian influenza A
(H5N1) viruses. Influenza Other Respir Viruses, 8(3): 384–388.
Wibawa H., Walujo B.P., et al. 2012 Investigasi Wabah Penyakit Itik di
Jawa Tengah, Yogyakarta dan Jawa Timur: Identifikasi Sebuah
Clade Baru Virus Avian Influenza Subtipe H5N1 di Indonesia. Buletin
Laboratorium Veteriner Vol 14 No.4 2012.Pp 2-9.

2. PERALATAN
2.1 Peralatan Untuk Isolasi Virus Pada T.A.B
1. Biosafety Cabinet (BSC) Class II
2. Inkubator telur
3. Sentrifus
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

4. Mortir dan pastel steril

5. Gunting dan Pinset steril
6. Tabung 5 ml dan 10 ml steril
7. Spuit 1 ml dengan jarum 26 G
8. Mikropipet uk 100 – 1000 µl
9. Vortex Mixer
10. Lemari Pendingin (40C)
11. Pelubang Telur
12. Peneropong telur / Candler
13. Papan datar dan pengaduk
14. Botol penyimpan jarum suntik

3. BAHAN
3.1 Reagensia
3.1.1. Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,2-7,4
3.1.2. Alkohol 70%
3.1.3. Cat kuku (nail polish)
3.1.4. Antibiotik Penicillin/Streptomycin –
10.000 IU/10.000 µg/ml
3.1.5. Antibiotik Gentamycin – 2500 µg/ml

4
 3.1.6. Larutan Binary Ethlenimine (BEI)
3.1.7. Sodium Thiosulfat

3.2 Bahan Biologik

3.2.1. Telur ayam bertunas umur 9 – 11 hari dari ayam spesific
antibody negative (SAN) atau spesific pathogenic free (SPF)
3.2.2. 5% Sel darah merah ayam

3.3 Contoh Uji

3.3.1. Organ (dapat berupa: trachea, paru, kantung udara, usus
dan isinya, limpa, ginjal, otak, hati, dan jantung)
3.3.2. Swab Oropharyngeal/Trachea
3.3.3. Swab Kloaka
3.3.4. Feses
3.3.5. Bulu
3.3.6. Contoh lingkungan (environment)
3.3.7. Material lain yang mengandung atau dicurigai

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
terkontaminasi virus AI

3.4 Bahan Acuan

3.4.1. Kontrol Positif
Bahan acuan kontrol positif AI yang digunakan adalah antisera
control positif terstandar bersertifikat produksi BBVET Wates.
Dapat pula digunakan kontrol positif produksi Pusvetma
sepanjang memiliki kualitas yang sama dengan bahan acuan
kontrol positif produksi BBVET Wates. Kontrol positif mempunyai
expected titer lebih besar atau sama dengan 256 berupa:
• Kontrol Positif Avian Influenza Type A Subtype H5N1 Clade
2.3.2.
• Kontrol Positif Avian Influenza Type A Subtype H5N1 Clade
2.1.3.
• Kontrol Positif Avian Influenza Type A Subtype H9N2.
3.4.2. Kontrol Negatif
Bahan acuan kontrol negatif AI yang digunakan adalah antisera
kontrol negatif AI terstandar bersertifikat produksi BBVet Wates.

5
 4. PERSIAPAN
4.1 Kualifikasi Penguji
Karena HPAI bersifat zoonosis maka penguji adalah personel yang
bersertifikat melakukan isolasi HPAI. Ditunjuk oleh Manager Teknis dan
mendapat SK dari Manager Puncak.

4.2 Persiapan Peralatan

Karena AI termasuk Zoonosis berbahaya, maka semua contoh untuk
isolasi virus dikerjakan di dalam BSC Class II di ruang isolasi virus,
laboratorium virologi.

4.3 Persiapan Bahan dan Reagen

Siapkan Telur ayam bertunas (TAB) umur 9-11 hari yang fertil lalu
pindahkan ke dalam inkubator suhu 370C di ruang isolasi virus. Jumlah
telur yang digunakan adalah 3 butir per contoh.

4.4 Persiapan Contoh

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

4.4.1. Contoh uji dapat berupa swab kloaka atau trachea/

oropharyng baik dalam media transport viral maupun swab
kering. Untuk contoh swab kering (tanpa media), swab langsung
dimasukkan ke dalam media transport viral / larutan PBS steril.
Sedangkan contoh uji berupa organ dapat terdiri dari berbagai
macam jenis organ, dikerjakan secara terpisah atau dikumpulkan
(pool sample). Selain itu, terdapat contoh feses; bulu; dan
lingkungan. Contoh uji dapat dalam keadaan segar atau telah
disimpan beku/dingin.
4.4.2. Contoh uji disimpan sementara (maksimal 4 hari) dalam
lemari pendingin (40C) sampai proses isolasi virus dilakukan.
Untuk penyimpanan lebih lama maka contoh disimpan dalam
freezer -800C.

5. PROSEDUR
5.1 Pembuatan inokulum contoh
5.1.1. Contoh swab kloaka, trachea/oropharyng dan lingkungan
(environment)
Vortex contoh yang ada didalam media transport viral / larutan
PBS steril lalu tekan swab pada dinding tabung dan buang swab
diwadah pembuangan.
6
 5.1.2. Contoh organ; bulu; feses
Potong organ kecil2 dengan berat sekitar + 1 gram dan
tempatkan dalam mortar steril kemudian gerus menggunakan
pastel steril hingga halus. Buat suspensi 10% (m/v) dengan 9 ml
larutan PBS steril lalu tuang ke dalam tabung 10 ml steril.
Centrifus kedua jenis contoh tersebut (swab dalam media
transport viral/larutan PBS steril dengan kecepatan 1.000 g
selama 10 menit. Pisahkan supernatan dari pellet dan tempatkan
dalam tabung steril. Tambahkan larutan antibiotik (penicilin =
250 unit dan streptomysin 50ug/ml). ke dalam cairan supernatan
dengan konsentrasi akhir 10% (v/v) dan inkubasikan selama 1-2
jam pada suhu ruang.

5.2 Inokulasi TAB

5.2.1. Ambil 3 butir TAB SPF/SAN untuk satu contoh, dari
incubator dan masukkan ke BSC Class II. Desinfeksi bagian/sisi
telur yang akan diinokulasi dengan kapas yang dibasahi alkohol
70% dan biarkan mengering. Buat lubang pada kerabang telur

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
menggunakan pelubang telur, yaitu 2-3 mm di atas batas rongga
udara.
5.2.2. Inokulasi 0,2 ml, menggunakan spuit 1 ml dan jarum 26 G,
ke setiap telur pada ruang alantois (saccus allantois). Lepas Spuit
dan jarum bekas inokulum dan tempatkan dalam wadah khusus
jarum.
5.2.3. Desinfeksi kembali bagian/sisi inokulasi telur dengan
alkohol 70% dan biarkan mengering.
5.2.4. Tutup lubang dengan cat kuku/kuteks, lalu masukkan
telur ke dalam inkubator yang bersuhu 35 - 37º C selama 4 hari.
5.2.5. Teropong telur setiap hari. Pindahkan telur yang mati
ke dalam lemari pendingin (40C). Pindahkan pula telur yang
masih hidup dan tersisa sampai akhir masa inkubasi ke lemari
pendingin (40C).
5.2.6. Setelah minimal 4 jam dalam 4oC, keluarkan TAB dan
letakkan di BSC Class II dan ambil cairan alantoisnya semaksimal
mungkin dengan menggunakan spuit. Bila perlu gunting
kerabang telur di sekitar rongga udara.

5.3 Uji aglutinasi cepat (kualitatif)

Uji HA cepat kualitatif dilakukan untuk mengetahui apakah virus
mempunyai kemampuan mengaglutinasi darah ayam.

7
 Caranya:
5.3.1. Siapkan 5% sel darah merah ayam dalam larutan PBS.
5.3.2. Ambil cairan alantois dan campurkan dengan sel darah
merah ayam 5% (1:1) pada papan datar (obyek gelas) dan
lihat ada/ tidaknya aglutinasi sel darah merah. Bila pada uji
HA kualitatif tidak terjadi aglutinasi, maka lakukan pasase ke
2 dengan cara inokulasikan kembali cairan alantois pada TAB
umur 9-11 hari sejumlah 3 butir dengan 0,2 ml pada setiap telur.
Contoh dinyatakan negatif bila uji HA kualitatif tetap negatif pada
pasase yang ke 3.
5.3.3. Sebaliknya bila pada uji HA kualitatif terjadi aglutinasi
maka lanjutkan identifikasi virus dengan uji HA kuantitatif dan
uji HI (Lihat SOP HA & HI). Namun virus HARUS diinaktifkan
sebelum dilakukan uji identifikasi

5.4 Inaktivasi Virus Avian Influenza Menggunakan

Binary Ethlenimine (BEI)
5.4.1. Penyiapan Virus:
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

Centrifuse cairan allantois yang mengandung virus dengan

kecepatan 1000 g selama 15 menit dan simpan dalam freezer
-80oC hingga digunakan
5.4.2. Penyiapan larutan BEI (formula lihat lampiran reagensia)
Encerkan larutan BEI ph 8.5 (1:10) dalam cairan allantois untuk
menghasilkan konsentrasi akhir adalah 0,01 M. Inkubasikan
larutan BEI-cairan allantois pada suhu 37oC selama 24 jam.
Hentikan reaksi BEI-cairan allantois dengan 1 M sodium
thiosulfate steril dengan konsentrasi 10x konsentrasi akhir BEI.
5.4.3. Uji Infektifitas Virus
Uji infektifitas dilakukan untuk melihat apakah virus sudah
inaktif.
Caranya:
Inokulasikan 100 µl larutan BEI-cairan allantois 0,01 M pada
masing2 5 telur ayam berembrio umur 10 hari. Inkubasi telur
tersebut pada suhu 35oC-37oC dan amati telur selama 24 – 72 jam
post inokulasi. Inaktifasi berhasil apabila telur yang di inokulasi
tetap bertahan hidup pada masa inkubasi.

8
5.5 Identifikasi Virus
Penting: RBC yang digunakan untuk uji HA dan HI harus benar2 berasal dari
ayam yang negatif antibodi HPAI.
5.5.1. Uji Skrining HA:
• Masukkan 0,025 ml PBS ke dalam sumur mikrotiter plate 96 dasar
V.
• Tambahkan 0,025 ml cairan alantois ke dalam dua sumur
(duplo). Cairan alantois tesebut dapat berasal dari satu telur atau
pool dari beberapa telur.
• Tambahkan suspensi 0,025 ml sel darah ayam 1% ke dalam
semua sumur yang berisi cairan alantois. Pada mikrotiter plate
yang sama masukkan pula kontrol darah ayam pada minimal
dua sumur.
• Tutup mikrotiter plate dan kocok dengan baik dengan mengetuk
(tapping) plate secara perlahan dan inkubasikan plate pada suhu
40C selama 30-45 menit.
• Amati bentukan kontrol sel darah merah sampai terjadi endapan

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
sempurna. Cairan alantois yang positif akan terlihat adanya
hemaglutinasi.
• Cairan alantois yang positif pada uji skrining dilanjutkan dengan
uji HA kuantitatif.
5.5.2. Uji HA Kuantitatif
• Isikan 0,025 ml PBS ke dalam setiap sumur mikrotiter plate
plastik dengan dasar V
• Tambahkan 0,025 ml suspensi virus INAKTIF cairan alantois ke
dalam sumur pertama.
• Lakukan pengenceran kelipatan dua dari 0,025 ml suspensi virus
sepanjang plate.
• Tambahkan 0,025 ml PBS ke dalam setiap sumur.
• Lalu tambahkan 0,025 ml suspensi sel darah merah ayam 1%
(v/v) ke setiap sumur.
• Campur larutan dengan mengetuk (tapping) plate secara
perlahan
• Inkubasikan pada suhu ruang ± 40 menit, sampai sel darah
merah mengendap dan baca hasilnya.
• Nilai HA dideterminasi dengan memiringkan plate (tilting) dan
mengamati ada/tidaknya aliran sel darah merah. Titrasi dibaca
pada pengenceran tertinggi yang memberikan HA sempurna

9
 (tidak terlihat streaming) yang mewakili 1 HA unit (HAU) dan
dapat dikalkulasi secara akurat dari awal pengenceran.
• Untuk menentukan titer virus/antigen, harus ditentukan
posisi end point. End point adalah sumur terakhir dimana
masih terdapat 100% aglutinasi sel darah merah Sedangkan
titer HA virus/antigen adalah kebalikan angka pengenceran
pada sumur end point.
• (Contoh : misalnya end point pada sumur 8, maka titer virus/
antigen adalah 28 = 128 HA unit atau log2 8 = 8)
5.5.3. Uji HI (Lihat SOP UJI HI)

6. HASIL
6.1 Interpretasi
Contoh dinyatakan positif apabila mampu meng-aglutinasi sel darah
merah pada uji hemaglutinasi cepat. Isolat positif virus ini harus
di identifikasi lebih lanjut dengan Uji haemaglutinasi/HA dan uji
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

haemaglutinasi inhibisi/HI (Lihat SOP HI)

Negatif (apabila tidak mampu meng-aglutinasi sel darah merah).

6.2 Identifikasi virus dari cairan allantois

Identifikasi virus yang tumbuh di TAB dilakukan dengan uji HA dan HI
6.2.1. Contoh dinyatakan positif HA bila terjadi aglutinasi sel
darah merah ayam.
6.2.2. Contoh dinyatakan positif virus AI apabila uji HI
menunjukkan titer ≥8 dengan bahan acuan kontrol positif AI yang
digunakan.

7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN

CONTOH / BIOSAFETY & BIOSEQURITY
Contoh uji yang diterima oleh bagian laboratorium serologi disimpan
di dalam kulkas/freezer. Cuplikan contoh dari pelayanan aktif disimpan
selama 1 (satu) bulan dari tanggal penjawaban hasil uji sedangkan
cuplikan contoh dari pelayanan pasif (contoh kiriman) disimpan
selama 2 (dua) bulan dari tanggal penjawaban hasil uji dan sesudah itu
dimusnahkan dengan dibuatkan berita acara pemusnahan, selanjutnya
dilakukan autoclave dan dibakar melalui incenerator yang telah tersedia.

10
8. JAMINAN MUTU /QUALITY
ASSURANCE
Uji yang dilakukan harus dilakukan secara tepat berdasarkan jadwal
pengecekan secara berkala dan setiap pengujian yang dilakukan harus
menggunakan referens kontrol positif dan negatif buatan BBVET Wates
dan tercatat. Hasil kontrol kualitas internal harus disimpan dalam
komputer dan juga harus dicetak dalam bentuk rekaman hasil uji. Jika
kontrol-kontrol menunjukkan hasil yang berbeda dari semestinya, maka
perbedaan hasil uji harus didiskusikan dengan Manajer Teknis atau
Supervisor.

9. LAMPIRAN
9.1 Reagensia
9.1.1. Larutan Phosphate Buffered Saline (PBS)
NaCl 8,0 g

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
KCl 0,2 g
Na2HPO4 1,15 g
KH2PO4 0,2 g
Ditambahkan 1 liter aquabides dan ukur pH 7,3 ± 0,2 pada suhu
ruang
Larutan PBS disterilkan dengan cara di-autoclave pada suhu
1210C selama 15 menit.
9.1.2. Pembuatan Binary ethyleneimine (BEI) 0.1 M
Larutkan 0,041 g 2-bromo-ethylamine HBr (BEA) dalam 2 ml
0,175 NaOH
Inkubasikan larutan tersebut pada suhu 37oC selama 60 menit
Larutan BEI bisa digunakan untuk inaktivasi virus ketika pH turun
dari 12 menjadi 8,5.
9.1.3. Larutan 1 M sodium thiosulfate steril
Larutan ini digunakan untuk menghentikan proses inaktifasi BEI-
cairan alantois. Larutan tersebut adalah 1 M sodium thiosulfate
steril dengan konsentrasi 10 x konsentrasi akhir BEI.

11
 9.2 Pencampuran PBS dengan Antibiotik
Penicillin/Streptomycin - 5000 units/10,000 µg/ml
Stok penicillin/streptomycin/gentamycin dipersiapkan dengan
menambahkan 1.0 ml gentamycin dengan 9.0 ml penicillin/streptomycin
dan dicampur.
Stok solution diencerkan 1:10 dengan PBS.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

12
10. LEMBAR KERJA

Isolasi Virus Ai pada Tab

Nomor Epi : .......................................................................................

Kode Lab : .......................................................................................
Jumlah contoh uji : .......................................................................................
Jenis contoh uji : .......................................................................................
Jenis Hewan : .......................................................................................
Tanggal terima : .......................................................................................
Tanggal pengujian : .......................................................................................
Penguji : .......................................................................................
Penyelia : .......................................................................................
Operator Input Data : .......................................................................................

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS
Kondisi contoh uji : .......................................................................................

Identifikasi bahan Uji

Telur TAB : SAN/SPF ………………………
Umur………………………….asal Telur…………………………
Kontrol Positif
1………………………………: Produksi …..................Batch..............exp
titer...................titer….……………
2………………………………: Produksi …………………..Batch……………
exp titer………………..titer……………...
3………………………………: Produksi …………………..Batch……………
exp titer………………..titer……………...
4………………………………: Produksi …………………..Batch……………
exp titer………………..titer……………...
Kontrol Negatif : Produksi …..………........Batch..............exp
titer...................titer...............
PBS : Produksi …………....................
Tanggal pembuatan.........
RBC 5% : Produksi …………………………….
Tanggal pembuatan ………………................
13
 Kesimpulan Reagen:
…………………………………………………………………………………
………………………………………………………
Pengujian:
Tanggal Inokulasi ………………………………………..
Lama Inkubasi ……………………………………………………
Pasase Inokulasi …………………………………………
Lama Inkubasi …………………………………………………..
Posisi Inokulasi : Allantois /CAM…………………….
Keterangan ………………………………………………………
Hasil:

No Kode Pengamatan Tgl Hasil Hasil

Contoh Panen HA HI
No Kode Hari Hari Hari Hari
Epi Lab 1 2 3 …..
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

dst

Lampiran Hasil

NO NAMA KODE ASAL HASIL CATATAN

EPI CONTOH LAB CONTOH

dst

14
Kesimpulan
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..
Saran
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..

Tanggal .....................................

Penguji Penanggung Jawab Lab

............................................ ...................................................

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS

15
16
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI VIRUS AVIAN INFLUENZA PADA TELUR AYAM BERTUNAS