Prosedur Operasional Baku

Standard Operating Procedure

SOP

ENZYME LINKED

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
IMMUNOSORBENT ASSAY
(ELISA) CLASSICAL SWINE
FEVER VIRUS (CSFV)

Balai Veteriner Medan

Jl. Gatot Subroto No.255-A, Lalang, Medan Sunggal,
Kota Medan, Sumatera Utara 20127
Telp: 061 8452253; Fax:061 846 991
Email: bvetmedan@gmail.com
Website: http://bppvmedan.ditjennak.pertanian.go.id 1
HALAMAN REVISI

Revisi Penulis Mengesahkan Tanggal

pengesahan

Revisi Tanggal Rincian perubahan

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
Penulis Drh. Lilik Prayitno, M.Si Agustus 2019
Disahkan oleh Drh. H Agustia, MP
Publikasi oleh Balai Veteriner Medan

i
 DAFTAR ISI

1. PENDAHULUAN 1
1.1 Penyakit Clasical Swine Fever 1
1.2 Etiologi 1
1.3 Diagnosa Penyakit 1
1.4 Uji Serologis ELISA Terhadap Classical Swine Fever 2
1.5 Daftar Pustaka 2
2. PERALATAN 2
3. BAHAN UJI 3
3.1 Reagensia 3
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)

3.2 Contoh Uji 3

3.3 Bahan Acuan 3
4. PERSIAPAN 3
4.1 Kualifikasi Penguji 3
4.2 Preparasi Contoh 3
4.3 Preparasi Kit ELISA 3
4.4 Preparasi Reagen Buffer Pencuci 4
4.5 Preparasi ELISA Reader 4
5. PROSEDUR 4
5.1 Pengujian dan Pembacaan dengan ELISA Reader 4
5.2 Validasi Pengujian dan Perhitungan Hasil 5
6. HASIL 6
7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN CONTOH 6
8. JAMINAN MUTU /QUALITY ASSURANCE 6
9. LAMPIRAN 6
10. LEMBAR KERJA 7

ii
1. PENDAHULUAN
1.1 Penyakit Clasical Swine Fever
Classical swine fever (CSF) yang dikenal sebagai penyakit hog cholera
pada babi, adalah penyakit virus yang menular pada semua babi,
termasuk babi hutan (Lim et al., 2017). Penyakit ini dapat berjalan akut,
subakut, kronis, atau non spesifik, tergantung pada beberapa faktor
yang mempengaruhi seperti virus dan hewan penderitanya, selain
itu usia hewan, virulensi virus dan waktu infeksi virus (sebelum atau
sesudah kelahiran) merupakan hal yang penting terhadap perjalanan
penyakit (OIE 2014; Schulz et al., 2017). Babi dewasa biasanya tanda
serangan penyakitnya lebih ringan dan memiliki kemampuan bertahan
hidup yang lebih baik dari babi muda. Infeksi pada babi yang bunting,
virus dapat menembus plasenta dan mencapai fetus. Karier dapat
terjadi jika terserang oleh strain virus dengan virulensi moderat atau
virulensi rendah. Wabah CSF pada babi mempunyai dampak yang serius

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
terhadap perdagangan babi dan produk babi secara internasional (Leifer
et al., 2010)
Tanda klinis penyakit yang terlihat pada hampir semua kelompok umur
adalah pyrexia, meringkuk, nafsu makan turun, bulu kusam, lemah,
konjungtivitis dan konstipasi diikuti diare. Selain itu, babi kadang terlihat
sempoyongan, ataxia atau kejang-kejang, bagian telinga, perut dan paha
sebelah terlihat haemorrhagi petechia dengan perubahan berwarna
merah sampai keunguan (OIE 2014).

1.2 Etiologi
Classical swine fever disebabkan oleh virus virulen yang termasuk dalam
genus Pestivirus famili Flaviviridae (Lim et al., 2017). Virus ini termasuk
golongan virus RNA (Single Stranded RNA) yang hanya memiliki satu
serotype (OIE 2014). Virus CSF dapat ditumbuhkan dan di isolasi pada
kultur jaringan epitel ginjal babi yang disebut sel line Pk15-A.

1.3 Diagnosa Penyakit

Gambaran klinis CSF sangat bervariasi, sehingga diagnosis klinis dan
patologis sangat sulit dilakukan. Oleh karena itu, metode laboratorium
sangat penting untuk kepastian diagnosis. Diagnosa laboratorium
dapat dilakukan dengan isolasi virus pada kultur jaringan, uji netralisasi
(Neutralisng Peroxidase Linked Assay-NLPA), uji ELISA dan quantitative
reverse transcription polymerase chain reaction (QRT PCR) (Handel et
al., 2004; Lim et al., 2017). Diagnosa deferential dari CSF adalah Border
disease dan bovine viral diarrhoea (BVDV).

1
 1.4 Uji Serologis ELISA Terhadap Classical
Swine Fever
Prinsip dari uji ELISA adalah adanya ikatan antigen antibodi kemudian
direaksikan dengan anti-immunoglobulin yang telah disenyawakan
(conjugation) dengan enzim dan ditambahkan dengan substrat. Apabila
dipecah oleh enzim akan menghasilkan warna dan intensitas warna ini
kemudian diukur dengan spektrofotometer (ELISA Reader). Intensitas
warna tersebut menunjukkan kepekatan komplek antigen antibodi dan
enzim, berarti terdapat banyak antigen virus yang homolog dengan
antibodi.

1.5 Daftar Pustaka

Handel K, Kehler H, Hills K, Pasick J. 2004. Comparison of reverse
transcriptase–polymerase chain reaction, virus isolation, and
immunoperoxidase assays for detecting pigs infected with low,
moderate, and high virulent strains of classical swine fever virus.
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)

Journal of veterinary diagnostic investigation;16(2):132-8.

Leifer I, Hoffmann B, Höper D, Rasmussen TB, Blome S, Strebelow
G, Höreth-Böntgen D, Staubach C, Beer M. 2010. Molecular
epidemiology of current classical swine fever virus isolates of wild
boar in Germany. Journal of General Virology; 91(11):2687-97.
Lim SI, Kim YK, Lim J, Han SH, Hyun HS, Kim KS, Hyun BH, Kim JJ, Cho IS,
Song JY, Choi SH. 2017. Antigenic characterization of classical swine
fever virus YC11WB isolates from wild boar. Journal of veterinary
science;18(2):201-7.
OIE [World Organisation for Animal Health] [France]. 2014. OIE Terrestrial
Manual Classical Swine Fever Chapter 2.8.3.
Schulz K, Staubach C, Blome S. 2017. African and classical swine
fever: similarities, differences and epidemiological consequences.
Veterinary research;48(1):84.

2. PERALATAN
Beberapa peralatan yang digunakan seperti:
Tabung ependorf, Inkubator 56°C, Microplate, Single channel,
Multichannel dan Tip, Plate Shaker, Reservoar, Spectrofotometer
(ELISA Reader)

2
3. BAHAN UJI
3.1 Reagensia
ELISA Kit Hog Cholera VDPro yang siap pakai, Desinfektan dan Alkohol
70%

3.2 Contoh Uji

Contoh uji yang digunakan adalah serum darah dari hewan yang
sakit. Semua contoh serum yang masuk harus dianggap mengandung
patogen berbahaya. Oleh sebab itu, inaktifasikan semua serum dengan
pemanasan pada 56oC selama 30 menit.

3.3 Bahan Acuan

3.3.1. Kontrol serum positif
Bahan acuan kontrol serum positif yang digunakan adalah serum

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
positif terstandar bersertifikat buatan Bvet Medan
3.3.2. Kontrol serum negatif
Bahan acuan kontrol serum negative yang digunakan adalah
serum negatif terstandar bersertifikat buatan Bvet Medan

4. PERSIAPAN
4.1 Kualifikasi Penguji
Penguji adalah petugas lab yang bersertifikat pengujian ELISA CSF dan
ditunjuk oleh Ka Balai.

4.2 Preparasi Contoh

4.2.1. Sesuaikan No.Agenda dan jumlah contoh yang diterima
dengan yang tertera pada surat pengantar Epidemiologi,
kemudian catat pada buku Agenda
4.2.2. Masukkan dalam tabung ependorf dan Susun sesuai
dengan nomor urut
4.2.3. Simpan pada suhu 2-5ºC selama 24 jam atau dapat
disimpan -40ºC dalam waktu yang lebih lama sebelum diuji

4.3 Preparasi Kit ELISA

4.3.1. Periksa kelengkapan isi kit dan waktu kadaluwarsa kit
ELISA yang diterima

3
 4.3.2. Simpan kit pada suhu 2-8ºC, keluarkan pada temperature
ruangan saat akan melakukan uji dan simpan kembali ke tempat
semula sesudah melakukan uji
4.3.3. Dilarang mencampurkan komponen kit yang sudah lama/
sisa dengan kit yang baru
4.3.4. Hindarkan bahan – bahan yang dapat mengkontaminasi
kit ELISA

4.4 Preparasi Reagen Buffer Pencuci

4.4.1. Hitung dengan teliti volume buffer yang dibutuhkan untuk
pencucian saat pengujian
4.4.2. Encerkan Buffer pencuci dengan perbandingan 1:9 (1 ml
stok buffer pencuci dan 9 bagian aquadestilata (dH2O)
4.4.3. Larutan yang didapat bersifat stabil dan dapat disimpan
dalam suhu ruangan atau suhu 4ºC
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)

4.5 Preparasi ELISA Reader

4.5.1. Hidupkan komputer dan ELISA reader dengan menekan
tombol ON
4.5.2. Buka softwear ELISA dan program sesuai urutan contoh
yang diuji
4.5.3. Pilih panjang gelombang yang sesuai dengan buku
panduan pada kit ELISA
4.5.4. Periksa kembali dengan teliti pelabelan dan penomoran
plate sebelum contoh dimasukkan untuk dibaca
4.5.5. Contoh yang telah diberikan stop solution siap
dimasukkan untuk dibaca.

5. PROSEDUR
5.1 Pengujian dan Pembacaan dengan ELISA
Reader
5.1.1. Siapkan reagen, contoh serta tulis posisi contoh pada
gambaran plate uji.
5.1.2. Siapkan lubang A1-A2 sebagai kontrol positif dan lubang
B1-B2 sebagai kontrol negative Hog Cholera.
5.1.3. Masukkan 50 ul diluent buffer pada semua lubang pada
plate uji.

4
 5.1.4. Tambahkan 50 ul contoh (1 plate untuk 92 contoh) pada lubang
yang telah berisi diluent buffer, tambahkan juga kontrol negative dan
kontrol positif pada lubang yang sudah ditentukan (A1-A2 dan B1-B2)
5.1.5. Plate ditutup dan diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur
ruangan 15-27 0C (direkomendasikan diinkubsikan selama satu malam
untuk mendapatkan uji yang lebih sensitive dan akurat)
5.1.6. Cuci tiap lubang plate dengan menggunakan buffer pencuci (300
ul tiap tabung), buang isinya dengan sempurna. Ulangi sebanyak 3 kali
pencucian.
5.1.7. Masukkan 100 ul Konjugate HPRO Anti-E2 pada tiap lubang plate.
Plate ditutup dan diinkubasikan selama 30 menit pada temperatur
ruangan 15-27 0C.
5.1.8. Cuci tiap lubang plate dengan menggunakan buffer pencuci (300ul
tiap lubang), buang isinya dengan sempurna. Ulangi sebanyak 3 kali
pencucian.
5.1.9. Masukkan 100 ul larutan substrate pada tiap lubang plate uji.

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
5.1.10. Plate ditutup dan diinkubasikan selama 15 menit pada
temperatur ruangan 15-27 0C, lihat perubahan warna yang terjadi dengan
menggunakan mata.
5.1.11. Hentikan rekasi enzimatik yang terjadi dengan menambahkan stop
solution 50ul dan baca hasilnya dengan panjang gelombang 450nm.
5.1.12. Hitunglah hasilnya dengan menggunakan rumus.

5.2 Validasi Pengujian dan Perhitungan Hasil

5.2.1. Validasi Pengujian
• Lihat angka kontrol positif dan kontrol negatif yang tertera pada
kertas hasil
• Kontrol positif harus menunjukkan nilai lebih daro 0.5
• Kontrol negatif harus menunjukkan nilai kurang dari 0.2
Perhitungan Hasil
• Hitung rata-rata nilai OD untuk kontrol positif (PCx) dan kontrol negatif
(NCx)
• Nilai rata-rata OD kontrol negatif dikurangi dengan nilai OD masing-
masing contoh (S1-S92)
• Nilai rata-rata OD kontrol negatif dikurangi dengan nilai rata-rata OD
kontrol positif (NCx-PCx)
• Selanjutnya hasil perhitungan No.2 dibagi dengan hasil perhitungan
No.3 dikalikan dengan 100%
• Formula diatas adalah % competition (%PC=(NCx-ODcontoh)/(NCx-
PCx)x100).
5
 6. HASIL
Hasil uji ditentukan oleh hasil perhitungan dari %PC yaitu:
Jika %PC > 40% : Hasil Uji dinyatakan positif dan
%PC < 40% : Hasil Uji dinyatakan negatif

7. RETENSI DAN PEMUSNAHAN

CONTOH / BIOSAFETY & BIOSECURITY
Contoh yang telah dilakukan pengujian biasanya disimpan pada suhu
-200C. Setelah dilakukan pengujian contoh masih disimpan selama
1 tahun dan setelah itu dilakukan pemusnahan sesuai dengan SOP
pemusnahan contoh dalam dokumen ISO 17025. Penyimpanan atau
pembuangan spesimen diagnostik harus mengikuti prinsip Biosafety
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)

dan biosekuriti Laboratorium melalui dokumentasi spesimen.

8. JAMINAN MUTU /QUALITY

ASSURANCE
Personel penguji memastikan menggunakan kontrol positif dan negatif
dalam setiap pengujian serta memastikan bahwa kontrol tersebut
bekerja dengan baik dan layak.
Contoh yang diuji harus memenuhi persyaratan yaitu dengan jumlah
yang cukup, kondisi tidak rusak dan dikemas dengan aman, memiliki
nomor dan kode contoh.
Bahan yang digunakan dalam kondisi baik (tidak expired), tercantum
no batch, disimpan sesuai dengan jenis, sifat dan kondisi bahan pada
tempat yang sesuai. Peralatan yang digunakan berfungsi dengan baik
sesuai dengan petunjuk kerja Pengoperasian alat dan instruksi kerja.

9. LAMPIRAN

6
10. LEMBAR KERJA

LEMBAR KERJA
Uji ELISA CSF

Nomor Epi : .......................................................................................

Kode Lab : .......................................................................................
Jumlah contoh uji : .......................................................................................
Jenis contoh uji : .......................................................................................
Jenis Hewan : .......................................................................................
Tanggal terima : .......................................................................................

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
Tanggal pengujian : .......................................................................................
Penguji : .......................................................................................
Penyelia : .......................................................................................
Operator Input Data : .......................................................................................
Kondisi contoh uji : .......................................................................................

Identifikasi Bahan dan Reagen

KIT ELISA Ab/Ag : _____________Produksi ___________
#Bacth ________Tgl expired ______
Kontrol Positif Serum : ­__Produksi___________ _
#Bacth ________Expected Titer____
Kontrol Negatif Serum : __Produksi ___________
#Bacth ________Titer ____________
Konjugat : ________Produksi
____________#Bacth ________________________
Sample Diluent : __Produksi ____________
Tgl buat _______________________
Washing Buffer : ________Produksi ____________
Tgl buat _________________
Treatmen Contoh
Serum____________________________________________________
7
 Kesimpulan Bahan dan Reagen
__________________________________________________________
_______________________

Lembar Hasil Uji ELISA

Plate no. _______________
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1A
B
C
D
E
F
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)

G
H

Plate no. _______________

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2A
B
C
D
E
F
G
H

8
Lampiran Hasil

NO KODE KODE HASIL CATATAN

EPID LAB CONTOH INTERPRETASI

dst

Kesimpulan
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..

ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)
Saran
....................................................................................... .............................................
.......................................... ....................................................................................... ..

Tanggal .....................................

Penguji Penanggung Jawab Lab

............................................ ...................................................

9
10
ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS (CSFV)