MAKALAH

TEKNIK IMMUNOASSAY
Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Disusun untuk memenuhi tugas mata kuliah Mikrobiologi Terapan

yang dibina oleh Prof. Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd

Kelompok 4/Off B
Haryatin Nurul Afifah 190341864411
Lidiya Praktika Rosa 190341864447
Mahathir Muhammad 190341864423
Zurienia Mimi Bibiyana 190341864402

PROGRAM STUDI MAGISTER PENDIDIKAN BIOLOGI

PASCASARJANA
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
NOVEMBER 2019

i
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT, yang telah

melimpahkan rahmat, taufik dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan makalah dengan judul “Teknik Immunoassay”. Makalah ini
diselesaikan untuk memenuhi Tugas Mata Kuliah Ekologi dan Menejemen
Lingkungan. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof.
Dr. Dra. Utami Sri Hastuti, M.Pd selaku dosen pengampu mata kuliah Mikrobiologi
Terapan yang banyak membantu dan membimbing penulis.
Penyusunan makalah ini tentu masih terdapat kekurangan dan kesalahan.
Untuk itu penulis berharap adanya masukan yang bersifat inovatif dan konstruktif
agar makalah ini menjadi lebih sempurna. Di samping itu penulis berharap agar
hasil tugas ini nantinya dapat berguna bagi semua pihak khususnya kalangan
pendidikan.

Malang, November 2019

Penulis

ii
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................i

KATA PENGANTAR ............................................................................... ii
DAFTAR ISI ............................................................................................. iii
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................... 1
1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................................. 2
1.3 Tujuan ................................................................................................... 2
BAB II KAJIAN PUSTAKA ...................................................................... 3
2.1 Pengertian Metode ELISA ...................................................................... 4
2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA...................................................................... 5
2.3 Prinsip Kerja Metode ELISA ................................................................ 10
2.4 Alat dan Bahan dalam Metode ELISA.................................................. 11
2.5 Cara Kerja Metode ELISA ................................................................... 12
2.6 Kelebihan dan Kekurangan Metode ELISA .......................................... 13
BAB III PENUTUP .................................................................................. 16
3.1 Kesimpulan........................................................................................... 16
3.2 Saran..................................................................................................... 16
DAFTAR RUJUKAN ............................................................................... 17

iii
iv
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Reaksi antigen dan antibodi bersifat spesifik. Antigen akan breaksi hanya
dengan antibodi yang khas untuk antigen tersebut. Spesifitas yang tinggi ini, rekasi
anatara antigen dan antibodi dapat digunakan untuk mengindentifikasi salah satu
menggunakan satu lainya. Spesifitas ini merupakan dasar reaksi serologis. Reaksi
silang yang mungkin terjadi antara antigen yang berhubungan dapat membatasi
spesifitas tes. Immunoassays secara umum dapat dibagi menjadi yang tidak berlabel
dan berlabel. Kebanyakan teknik tanpa label didasarkan pada reaksi imun
sekunder, seperti, misalnya, presipitasi dan aglutinasi. Mereka diukur dengan
metode hamburan cahaya atau partikel. Immunoassay berlabel didasarkan pada
reaksi imun primer (Porstmann & Kiessig, 1992).
Immunoassay adalah metode bioanalitik di mana kuantitasi analit tergantung
pada reaksi antigen (analit) dan antibodi. Pada prinsipnya, metode ini didasarkan
pada pengikatan kompetitif yang mengikat antara jumlah tetap bentuk berlabel dari
analit dan jumlah variabel analit sampel tidak berlabel untuk jumlah terbatas dari
situs pengikatan pada antibodi anti-analit yang sangat spesifik Ketika reagen
immunoanalytical ini dicampur dan diinkubasi, analit terikat pada antibodi yang
membentuk kompleks imun. Kompleks ini dipisahkan dari fraksi reagen tidak
terikat dengan teknik pemisahan fisik atau kimia. Analisis dilakukan dengan
mengukur aktivitas label (mis. Radiasi, fluoresensi, atau enzim) di salah satu fraksi
terikat atau bebas. Kurva standar, yang merepresentasikan sinyal terukur sebagai
fungsi konsentrasi analit tak berlabel dalam sampel dikonstruksi. Konsentrasi analit
yang tidak diketahui ditentukan dari kurva kalibrasi ini (Darwish, 2006).
Pada tahap awal penemuan dan pengembangan obat, terutama selama studi
farmakokinetik klinis untuk kandidat obat baru, diperlukan skrining sejumlah besar
sampel. Ini hanya dapat dicapai dengan menggunakan metode analitik throughput
tinggi (20-22). Analisis matriks biologis kompleks (mis. Darah dan urine) dengan
metode immunoassay, yang didasarkan pada reaksi pengikatan tertentu, dapat
dicapai tanpa pretreatment untuk sampel (23-25). Meskipun pengembangan

1
metode imunoassay baru untuk analit dapat memakan waktu berbulan-bulan
(karena waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan antibodi yang diinginkan),
namun, begitu reagen immuoanalitik yang sesuai tersedia, metode immunoassay
dapat dibuat dalam kerangka waktu yang bersaing dengan metode kromatografi.
Selanjutnya, teknik baru dikembangkan untuk memungkinkan produksi antibodi
spesifik secara cepat.
Imunoassay digunakan untuk menghitung secara kuantitatif malikula-kuman
dari kepentingan biklogikal berdasarkan spesifisitas dan selektivitas reagen
antibodi yang dihasilkan. Dalam proyek Hrrs dan timbal aptinmizatoe, pengujian
dirancang untuk mendeteksi molekul yang diproduksi secara intraseluler atau
disekresikan sebagai tanggapan terhadap penyaringan ciupoinds (Cox, 2011). Salah
satu metode yang diguanakn dalam teknik Immunoassay adalah Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay (ELISA).
ELISA adalah salah satu dari beberapa metode yang digunakan di
laboratorium untuk mendeteksi dan mengukur molekul tertentu. ELISA
mengandalkan pada kemampuan yang melekat dari suatu antibodi untuk mengikat
pada struktur spesifik suatu molekul. Untuk mengoptimalkan ELISA dan di
dapatkan sensitivitas dan rentang dinamis yang diperlukan untuk pengujian khusus
yang sedang dikembangkan, semuanya berbagai komponen pengujian harus
dievaluasi. Komponen akan bervariasi tergantung pada immunoassay format yang
dipilih. Berikut ini adalah deskripsi dari berbagai jenis format ELISA serta reagen
yang perlu dioptimalkan untuk mendapatkan pengujian yang kuat (Cox, 2011).
Makalah ini menjelaskan mengenai jenis, prinsip kerja, cara kerja dan kelebihan
serta kekurangan metode ELISA.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah di atas, maka rumusan masalah yang
dapat diajukan adalah sebagai berikut:
1. Apa itu metode ELISA?
2. Apa saja jenis-jenis ELISA?
3. Bagaimana prinsip kerja dari metode ELISA?
4. Apa alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA?

2
5. Bagaimana cara kerja metode ELISA?
6. Apa kelebihan dan kekurangan dari metode ELISA?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah yang ada maka tujuan dari makalah ini adalah:
1. Mengetahui pengertian ELISA
2. Mengetahui jenis-jenis ELISA
3. Mengetahui prinsip kerja dari metode ELISA
4. Mengetahui alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA
5. Mengetahui cara kerja dari ELISA
6. Mengetahui kelebihan dan kekurangan dari ELISA

3
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia
yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran
antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat
diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang
industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal
ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada
permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini
terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang
dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA
fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada
suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah
antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas
untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter
polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau
spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen
yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi
pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi
pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara
langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui
biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen
lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat.
Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik
untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen
dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik,
meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh
lebih sensitif .

4
2.2 Jenis-Jenis Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik
ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat
antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi
(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibody kedua
(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.
Teknik ELISA telah berkembang menjadi berbagia macam jenis teknik.
Perkembangan ini didasari pada tujuan dari dilakukannya uji dengan teknik
ELISA tersebut sehingga dapat diperoleh hasil yang optimal. Berikut ini adalah
beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain: ELISA
Direct, ELISA Indirect, ELISA Sandwich (Salazar, 2017).

Gambar 1. ELISA assays

2.2.1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Direct
Teknik ELISA ini merupakan teknik ELISA yang paling sederhana. Teknik
ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen pada
sampel ELISA direct menggunakan suatu antibody spesifik (monoklonal) untuk
mendetaksi keberadaan antigen yang diinginkan pada sampel yang diuji. Pada
ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen
yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat menempel pada bagian dinding-
dinding lubang microtiter, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen
yang tidak menempel pda dinding lubang microtiter. Lalu antibodi yang telah

5
ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang lubang microtiter
sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang diinginkan, yang dilanjutkan
dengan membilas microtiter untuk membuang antibody tertaut enzim signl yang
tidak berinteraksi dengan antigen. Lalu, ke dalam lubang-lubang microtiter
tersebut ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga
enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan signal dapat
dideteksi. Pendeteksian interaksi antara antibodi dengan antigen tersebut
selanjutnya dapat dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent,
atau fluorescent end-point.
2.2.2 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Indirect
ELISA Indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA yang paling
sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi dan diukur
konsentrasinya merupakan antibody. ELISA indirect menggunakan suatu antigen
spesifik (monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk
mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Tahap umum yang digunakan dalam ELISA indirect untuk mendeterminasi
konsentrasi antibodi dalam serum adalah:
a. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan
pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada
permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang
diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk
mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
b. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin
(BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap
ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-
spesifik dari protein lain ke plate.
c. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel
serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama
dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam
tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total
harus sama dengan antigen standar.

6
d. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji
dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen
terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau
protein yang terbloking.
e. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi,
ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi
enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi
berkonjugasi dengan enzim.
f. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak
terikat.
g. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal
kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.
h. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat
optik/ elektrokimia lainnya.
Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat
enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul
sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi
antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel
pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel
harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan
lubang. ELISA indirect dapat dilihat pada gambar berikut:

Gambar 2. Indirect ELISA

(Sumber: Lakna, 2018)

7
2.2.3 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Sandwwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer spesifik untuk
menangkap antigen yang diinginkan dan antibody sekunder tertaut enzim signal
untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip
kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA
sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi. Namun, karena
antigen yang diinginkan tersebut harus dapat berinteraksi dengan antibody primer
spesifik dan antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA
sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki minimal 2 sisi
antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent
seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA sandwich,antibody primer seringkali
disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali
disebut sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder seringkali
disebut sebagai antibody deteksi.
ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan
antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan
tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki tingkat
sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen
tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibody.
Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:
a. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’
b. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir
c. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate
d. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat
e. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen
f. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan
berikatan dengan antibodi primer.
g. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang.
h. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/
berfluoresensi/ elektrokimia.
i. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

8
 Faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian dengan
teknik ELISA sandwich, antara lain :
a. Banyak molekul antibody penangkap yang berhasil menempel pada dinding-
dinding microtiter.
b. Avinitas dari antibody penangkap dan antibody detector terhadap antigen
sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik
ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct.
Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

Gambar 3. Prinsip kerja Sandwich ELISA

Keterangan:
1. Plate dilapisi dengan antibodi penangkap yang cocok. Buffer blocking
ditambahkan ke situs pengikatan protein yang tersisa di piring
2. Sampel ditambahkan ke wadah dan setiap antigen yang ada terikat oleh
antibodi penangkap
3. Antibodi pendeteksi berlabel biotin yang cocok ditambahkan ke plate dan
juga mengikat antigen yang ada di sumur
4. Ultra Aidin HRPO ditambahkan dan mengikat antibodi deteksi berlabel
biotin
5. Media TMB ditambahkan dan dikonversi oleh HRPO ke bentuk yang dapat
dideteksi.

9
2.3 Prinsip kerja Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Berbagai kombinasi antigen-antibodi yang digunakan dalam ELISA selalu
termasuk antigen atau antibodi berlabel enzim, dan aktivitas enzim diukur secara
kolorimetri. Aktivitas enzim diukur dengan menggunakan substrat yang berubah
warna ketika dimodifikasi oleh enzim (Medical and Biological Laboratory, 2017).
Penyerapan cahaya produk yang terbentuk setelah penambahan substrat diukur dan
dikonversi ke nilai numerik. Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simple dapat
dijabarkan sebagai berikut:

Gambar 4. Prinsip sederhana ELISA

Apabila menggunakan kit dengan pelat yang sudah dilapisi antibodi, ELISA
dimulai dengan langkah pelapisan, di mana lapisan pertama terdiri dari antigen
target atau antibodi, diadsorpsi ke dalam pelat polistiren 96-well. Hal ini diikuti
oleh langkah pemblokiran di mana semua site yang tidak terikat dilapisi dengan
agen pemblokiran. Setelah serangkaian pencucian, pelat diinkubasi dengan antibodi
yang terkonjugasi enzim. Serangkaian pencucian lainnya menghilangkan semua
antibodi yang tidak terikat. Substrat kemudian ditambahkan, menghasilkan sinyal
kalorimetri dan akhirnya pelat dapat dibaca (ELISA Handbook, -).
Pengujian menggunakan pengikatan permukaan untuk pemisahan, beberapa
pencucian diulang dalam setiap langkah ELISA untuk menghilangkan bahan yang
tidak terikat. Selama proses ini, sangat penting bahwa kelebihan cairan dihilangkan
untuk mencegah pengenceran larutan yang ditambahkan pada langkah pengujian

10
berikutnya. Untuk memastikan keseragaman, mesin pencuci pelat khusus sering
digunakan. ELISA bisa sangat kompleks dan mencakup beberapa langkah
intervensi, terutama ketika mengukur konsentrasi protein dalam sampel heterogen
seperti darah. Langkah paling kompleks dan bervariasi dalam proses keseluruhan
adalah deteksi, di mana beberapa lapisan antibodi dapat digunakan untuk
memperkuat sinyal (ELISA Handbook, -).

2.4 Alat dan Bahan Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Alat dan bahan yang digunakan dalam metode ELISA antara lain:
2.4.1 Bahan Metode ELISA
Kit ELISA yang terdiri dari:
a. Plate ELISA yang telah dilapisi (coated) dengan antibodi atau antigen
b. Antigen yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antibodi).
c. Antibodi yang dimurnikan (jika sampel yang hendak dideteksi atau
dikuantifikasi berupa antigen).
d. Larutan standard (kontrol positif dan negatif).
e. Sampel yang ingin diuji.
f. Standar antibiotik
g. Konjugate atau enzim penanda
h. Substrat yang bersifat spesifik terhadap enzim signal
i. Larutan pencuci ( Buffer )
j. Larutan penghenti reaksi (stop solution)
2.4.2 Alat Metode ELISA
a. Timbangan
b. Gelas ukur
c. Single mikro pipet 5-50 µl, 50-1000 µl
d. Multi channel mikro pipet 5-50 µl, 50-300 µl
e. Bak reservoar
f. Homogenizer/stomacher/mortar,
g. Sentrifuger atau filter
h. Penangas air

11
 i. Inkubator
j. ELISA Plate washer atau labu semprot
k. ELISA Plate Reader dengan filter panjang gelombang 400-600 nm untuk
pengukuran kuantitatif
l. Komputer

2.5 Cara Kerja Metode ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Berikut ini adalah contoh langkah kerja beberapa macam teknik ELISA,
yaitu:
a. Pendeteksian antibodi dengan ELISA indirect:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/permukaan
selama 30-60 menit.
2. Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh
antigen dengan protein yang tidak berhubungan/tidak spesifik (seperti
larutan susu bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan
membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6. Membilas antibody yang tidak terikat.
7. Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada
antibody yang spesifik (sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang
berikatan dengan IgG manusia). Daerah Fc pada anti-Ig akan berikatan
secara kovalen dengan enzim.
8. Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang
terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spectrometer. Jika semakin pekat warna yang dideteksi, maka
makin besar kadar antibody spesifik dalam sampel.

12
b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:
1. Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/permukaan
selama 30-60 menit.
2. Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3. Melapisi sisi-sisi tertentu yang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen
dengan protein yang tidak berhubungan tidak spesifik (seperti larutan susu
bubuk).
4. Membilas protein yang tidak melekat.
5. Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan
antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6. Membilas antigen yang tidak terikat.
7. Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat
spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga
terbentuk sandwich.
8. Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9. Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang
terikat.
10. Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang
terdeteki, maka makin besar kadar antigen spesifik dalam sampel.

2.6 Kelebihan dan Kekurangan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent

Assay)
Berikut merupakan penjelasan mengenai kelebihan dan kekurangan dari
masing-masing jenis metode ELISA.
2.6.1 ELISA Direct
ELISA direct memiliki beberapa kelemahan, antara lain:
a. Immunoreaktifitas antibodi kemungkinan akan berkurang akibat bertaut dengan
enzim.
b. Penautan enzim signal ke setiap antibodi menghabiskan waktu dan mahal.

13
c. Tidak memiliki fleksibilitas dalam pemilihan tautan enzim (label) dari antibodi
pada percobaan yang berbeda.
d. Amplifikasi signal hanya sedikit.
e. Larutan yang mengandung antigen yang diinginkan harus dimurnikan sebelum
digunakan untuk uji ELISA direct.
Sedangkan kelebihan dari ELISA direct antara lain:
a. Metodologi yang cepat karena hanya menggunakan 1 jenis antibody.
b. Kemungkinan terjadinya kegagalan dalam uji ELISA akibat reaksi silang dengan
antibody lain (antibody sekunder) dapat diminimalisasi.
2.6.2 ELISA Indirect
ELISA indirect memiliki kelemahan, antara lain: membutuhkan waktu
pengujian yang relative lebih lama daripada ELISA direct karena ELISA indirect
membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi interaksi antara
antigen spesifik dengan antibody yang dinginkan dan antara antibody yang
diinginkan dengan antibody sekunder tertaut enzim signal, sedangkan pada
ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu pada saat terjadi
interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibody spesifik tertaut enzim
signal.
Sedangkan kelebihan dari ELISA indirect antara lain:
a. Terdapat berbagai macam variasi antibody sekunder yang terjual secar komersial
di pasar.
b. Immunoreaktifitas dari antibody yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibody sekunder karena penautan dilakuka pada
wadah berbeda.
c. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibody yag diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibody sekunder.
2.6.3 ELISA Sendwich
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
sensitivitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus
dapat berinteraksi dengan dua jenis antibody, yaitu antibody penangkap dan
antibody detector, kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu
mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama

14
antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum)
dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas
antigen yang terimobilisasi.
Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu
teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk medeteksi antigen yang bersifat
multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibody yang dapat berinteraksi
antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).

15
 BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
1. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia
yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
2. Metode ELISA yang relatif sering digunakan, antara lain: ELISA Direct, ELISA
Indirect, ELISA Sandwich.
3. Prinsip kerja ELISA: Pertama antigen atau antibodi yang hendak diuji
ditempelkan pada suatu permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut
dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan
adsorbs ke permukaan microtiter, dan penempelan secara spesifik dengan
menggunakan antibody atau antigen lain yang bersifat spesifik dengan
antigen atau antibodi yang diuji.
4. Metode ELISA memiliki kelebihan dan kekurangan dalam proses
pemeriksaannya.

3.2 Saran
Sebaiknya dilakukan kajian referensi yang lebih mendalam lagi agar
mencapai penjelasan dan hasil analisis yang lebih runtut, terstruktur, dan
komperhensif. Selain itu juga sebaiknya dilakukan peningkatan dalam hal
pemilihan bahasa agar makalah lebih mudah dipahami oleh pembaca

16
 DAFTAR RUJUKAN

Cox, K. L. 2011. Immunoassay Development, Optimization and Validation Flow

Chart. ImmunoAssay Methods, (Md), 1–38.

Darwish, I. A. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in

Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances.
International Journal of Biomedical Science: IJBS, 2 (3), 217–235.
Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23674985%0Ahttp://www.pubmedc
entral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC3614608.

ELISA Handbook. -. Principle, Troubleshooting, Sample Preparation and Assay

Protocols. Boster. Online.
https://www.bosterbio.com/media/pdf/ELISA_Handbook.pdf Diakses
pada 15 November 2019.

Lakna. 2018. What is the Difference Between Direct and Indirect ELISA.
https://pediaa.com/what-is-the-difference-between-direct-and-indirect-elisa/
(Diakses pada tanggal 14 November 2019).

Medical and Biological Laboratory. 2017. The principle and method of ELISA.
Online. https://ruo.mbl.co.jp/bio/e/support/method/elisa.html diakses pada
15 November 2019.

Porstmann, T., & Kiessig, S. T. 1992. Enzyme immunoassay techniques an

overview. Journal of Immunological Methods, 150(1–2), 5–21.
https://doi.org/10.1016/0022-1759(92)90061-W.

Salazar, A., Henry, V., Julio A, & Maria C. J. 2017. Allergen-Based Diagnostic:
Novel and Old Methodologies with New Approaches. Intech.
http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.69276.

17