Jurnal Kedokteran Forensik dan Medikolegal

Estimasi Post Mortem Interval menggunakan microRNA pada Tulang

Joo-Young Na1
Departemen Patologi, Universitas Nasional Pusan, Rumah Sakit Yangsan, 20,
Geumo-ro, Mulgeum-eup, Yangsan, 50612, Republik Korea
Abstrak
MicroRNA (miRNA) sering digunakan dalam kedokteran forensik karena
karakteristik yang beragam dari miRNA, terutama stabilitasnya. Akan tetapi post
mortem interval (PMI) sangat penting dalam menginvestigasi tempat kejadian
perkara. Namun, perkirakan PMI merupakan sebuah tantangan terutama dalam
kasus-kasus yang melibatkan tubuh yang telah membusuk atau hancur secara
signifikan, seperti pada kasus yang menyisakan tulang belulang saja.
Pada penelitian ini, 71 tulang (patella) dikumpulkan dari jenazah selama autopsi
(PMI berkisar dari 1 hari hingga 2 tahun). Pada penelitian sebelumnya, let-7e dan
miR-16 digunakan sebagai kontrol internal dari jaringan tulang sebagai target
untuk memperkirakan PMI. miRNA Ce_miR-39_1 digunakan sebagai tambahan
untuk kontrol internal dalam menormalkan target tingkat miRNA. Metode real
time dengan RT qPCR dilakukan untuk menghubungkan tingkat ekspresi miRNA
dari let-7e dan miR-16 dengan peningkatan PMI.
Korelasi negative diobservasi antara ekspresi miRNA dan peningkatan. Ekspresi
gen let-7e dan iR-16 diobservasi dan didapatkan terdpat perbedaan signifikan
antara kelompok A dan kelompok dengan PMI berbeda (kelompok A <1 bulan; 1
bulan <kelompok B<3 bulan; 3 bulan < kelompok C < 6 bulan; kelompok D > 6
bulan).
Sebagai kesimpulan, data yang didapatkan menunjukan bahwa tingkat ekspresi
gen spesifik miRNA (let-7e dan mIR-16) pada jaringan tulang dapat digunakan
untuk estimasi PMI. akan tetapi, penelitian lebih lanjut dengan menggunakan
sampel PMI jangka panjang diperlukan untuk menguatkan penelitian ini.
Kata kunci : patologi forensik, microRNA, post mortem interval, tulang
1. Pendahuluan
Estimasi PMI sangat penting pada kedokteran forensik dan berlanjut menjadi
tugas paling sulit bagi investigator forensik. Secara khusus, tantangan didapatkan
pada kasus dengan tubuh sudah terdekomposisi seperti pada kasus yang
menyisakan tulang belulang saja. Saat ini,parameter tradisional, seperti algor
mortis, livor mortis, rigor mortis, dan perubahan biokimia di dalam humor
vitreous, masih digunakan dalam kedokteran forensik untuk memperkirakan PMI
akan tetapi, metode-metode ini rentan terhadap faktor lingkungan eksternaf
sehingga terbatas pada PMI dalam periode non singkat (hari).
Jaringan tulang diperkirakan tahan terhadap stressor fisik dari lingkungan dan
biasanya masih ada di akhir saat sudah terjadi dekomposisi tubuh. Saat ini,
kedokteran forensik memperkenalkan pemanfaatan mikroRNA (miRNA).1 Secara
umum, RNA diduga lebih rentan terhadap degradasi dibandingkan dengan DNA;
pada penelitian sebelumnya, analisis kuantitatif dari degradasi RNA digunakan
dalam memperkirakan PMI. 2 Penelitian tersebut terbatas pada PMI yang pendek
disebabkan oleh instabilitas mRNA. miRNA merupakan RNA yang terdiri dari 22
nukleotida, miRNA tersebut mengatur ekspresi gen pasca-transkripsi dan
diharapkan berguna dalam kedokteran forensik karena banyak memiliki beragam
karakteristik, terutama stabilitasnya.3 Sebagai contoh, miRNA diidentifikasi dari
bentuk sediaan formalin tetap, jaringan yang sudah diberikan paraffin yang
diambil ketika autopsi.4 berdasarkan pada penelitian sebelumnya tentang miRNA
dalam cairan tubuh, 5 menunjukkan bahwa miRNA dapat bertahan di lingkungan
yang keras, seperti pada penembakan dan PMI jangka panjang, sehingga pada
penelitian ini kami menggunakan miRNA untuk diuji dalam menentukan PMI
menggunakan sampel mayat.
Penelitian ini menggunakan tingkat miRNA pada jaringan tulang pada PMI yang
berbeda dan diuji perkiraan PMI nya menggunakan sampel patella manusia dari
kasus yang diautopsi.
2. Metode dan Material
2.1 Subjek dan Etik
Pada penelitian ini, 71 tulang patella dikumpulkan dari jenazah saat autopsi
dengan PMI berkisar 1 hari sampai 2 tahun. subjek dikelompokkan menjadi empat
kelompok berdasarkan PMI (kelompok A dan kelompok dengan PMI berbeda
(kelompok A <1 bulan; 1 bulan <kelompok B<3 bulan; 3 bulan < kelompok C < 6
bulan; kelompok D > 6 bulan). Jumlah sampel pada masing-masing kelompok
adalah 37, 18, 11, dan 5 masing-masing. PMI secara komperhensif diperkirakan
melalui autopsi, tes post mortem, dan ulasan laporan investigasi.
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan sampel post-mortem yang
dikumpulkan selama autopsi forensik. Semua autopsi forensik yang digunakan
dalam penelitian ini adalah dilakukan dengan surat perintah pengadilan atas
permintaan jaksa publik. Penelitian tersebut dikonfirmasi sebagai kegiatan
penelitian yang melibatkan peserta non-manusia oleh Badan Peninjau
Kelembagaan Pusan Rumah Sakit Universitas Nasional Yangsan (No. 2020-3).
Semua data dianalisis secara anonim. Persyaratan untuk informed consent
dibebaskan oleh dewan.
2.2 Ekstraksi Total RNA
Patella dibelah dengan potongan sagittal. Permukaan dari tulang spongiosa patella
diambil dengan dilakukan pengerukkan untuk mengurangi risiko kontaminasi dan
0.01g tulang spongiosa berbentuk bubuk terkumpul. RNA total diekstrak
menggunakal reagen TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dan
kuantifikasi menggunakan NanoDrop 1000 Spectrophotemeter (Thermo Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA). Selama ekstraksi total RNA dari jaringan tulang,
Ce_miR-39_1 ditambahkan sebagai tambahan untuk menormalkan target tingkat
miRNA.
2.3 Reverse transcription dan real-time quantitative polymerase chain reaction
(RT-qPCR)
cDNA disintesis dari 100 ng RNA yang telah diekstrak menggunakan miScript II
RT kit (Qiagen, Hilden, Jerman) dengan mengikuti instruksi pabrik. Tingkat
ekspresi target miRNA, let-7e digunakan untuk memperkirakan PMI. miRNA ini
digunakan sebagai kontrol internal untuk jaringan tulang, dalam penelitian
sebelumnya tentang miRNA terkait osteoporosis, perubahan pada tulang manusia 6
miRNA ini terlibat dalam kanker kolorektal, payudara kanker, rinitis alergi, dan
karsinoma tiroid papiler, tetapi tidak pada penyakit tulang.7–10 miR-16 juga
digunakan sebagai target miRNA untuk memperkirakan PMI. miRNA ini
digunakan sebagai kontrol internal untuk menormalkan target lainnya. miRNA
dalam penelitian sebelumnya, termasuk penyakit tulang11-14 dan dilaporkan untuk
15
lebih spesifik untuk darah vena dalam studi forensik sebelumnya. Pada
pencarian menggunakan PubMed, tidak ada penelitian sebelumnya yang terkait
dengan let-7e dan miR-16 di patella. PT-qPCR dilakukan dengan 200 ng cDNA
menggunakan kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen, Hilden, Jerman) dengan
primer universal dan target miScript Primer Assays, mengikuti protokol pabrik.
Nilai Ct telah ditentukan sebagai nomor siklus di mana fluoresensi melebihi
ambang batas yang ditetapkan secara mandiri.
2.4 Analisis StatistiK
Sampel dihitung ganda dan data disajikan sebagai mean. Setiap target tingkat
miRNA dinormalisasi dengan menggunakan tambahan control (Ce_miR-39-1)
dan ekspresi kuantitatif diukur menggunakan metode –ΔCt, di mana –ΔCt = -
(Cttarget miRNA - Ctspike-in control).
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan kolerasi Pearson untuk
mengidentifikasi kolerasi antara tingkat miRNA target dan peningkatan PMI. T-
tes independen digunakan untuk membandingkan tingkat miRNA targer antar
kelompok dengan PMI yang berbeda. Semua analisis statistic menggunakan
GraphPad Prism software (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) dimana P <
0.05 sehingga dianggap perbedaan yang didapat signifikan.
3. Hasil
3.1 Hubungan antara Ekspresi miRNA dan Peningkatan PMI
Spike-in control (Ce_miR-39_1) menunjukkan Ct value 26-27 pada sampel.
Tingkat ekspresi miRNA target (let-7e dan miR-16) yang dinormalisasi dengan
spike in control, didapatkan berkurang dengan peningkatan PMI. R2 didapatkan -
0,3025 untuk let-7e dan - 0,3329 untuk miR-16.
3.2 Tingkat Ekspresi miRNA pada kelompok PMI yang Berbeda
Tingkat ekspresi let-7e dan miR-16 secara signifikan berbeda antara kelompok A
dan kelompok lainnya. Tidak didapatkan perbedaan statistik antara kelompok lain
kecuali kelompok A.

4. Diskusi
Perkiraan akurat dari PMI sangat penting untuk investigasi post mortem, tetapi
merupakan tantangan bagi ahli patologi forensik, terutama dalam kasus dimana
PMI lebih dari beberapa hari. Jaringan tulang dianggap tahan terhadap berbagai
tekanan, seperti fisik dan cedera termal dan predator. Beberapa metode analisis
seperti perubahan fisiokimia dan serologis serta perubahan pada konsentrasi
radioisotope, telah diperiksa untuk memperkirakan PMI dari sisa-sisa skeletal. 16-
21 Metode-metode tersebut tidak terlalu berguna untuk PMI selama beberapa
bulan, dan metode radioisotope mahal. Penelitian oleh Young22 telah memaparkan
penggunaan degradasi RNA dan peubahan morfologi pada pulpa gigi. Setelah
kematian molekul biologi mulai terdegradasi dan digunakan untuk pekiraan PMI
23,24
pada penelitian sebelumnya. Stabilitas post-mortem RNA berbeda menurut
jenis RNA.25 RNA ribosom, beberapa nukleolus, dan mitokondria sangat resisten
terhadap degradasi post-mortem.25
Secara khusus, miRNA memiliki banyak karakteristik; terutama, lebih stabil
daripada RNA yang lebih panjang, seperti mRNA. Penelitian sebelumnya, RNA
didapatkan dari tulang trabekuler dengan PMI kurang dari 48 jam.26 Dalam
penelitian ini, tingkat ekspresi miRNA jaringan tulang dianalisis untuk
memperkirakan PMI. Tulang patella digunakan karena beberapa alasan, salah
satunya adalah patella terdiri dari tulang kortikal luar dan bagian dalam terapat
tulang spongiosa. Tulang spongiosa bagian dalam terlindung dari elemen luar,
seperti paparan sinar matahari langsung, kondisi cuaca basah, infestasi bakteri,
dan serangga potensial atau pemakan bangkai darat, oleh tulang kortikal luar.
Selain itu, tulang spongiosa bagian dalam juga mudah kumpulkan dengan
menggiling. Patella bisa dikumpulkan, tanpa menggergaji, tubuh, dengan
memotong jaringan lunak, seperti beberapa ligamen, setelah irisan kulit . Para ahli
patologi forensik terkadang diharuskan mempertahankan kontur luar tubuh selama
pemeriksaan mayat, karena terdapat budaya penolakan autopsi di beberapa negara.
Ekspresi miRNA target, let-7e dan miR-16, menurun dengan memanjangnya PMI.
Apalagi ekspresi target miRNA yang spesifik secara statistik berbeda antara PMI
kelompok A (<1 bulan) dan kelompok lain. Jadi, mayoritas target miRNA di
tulang adalah dipercaya bahwa jenazah akan terdegradasi dalam waktu kurang
dari sebulan dalam hal PMI. Pada penelitian sebelumnya, setiap transkrip RNA
menunjukkan pola yang unik pada degradasi, dan peningkatan bertahap pada level
Ct melewati waktu yang dibutuhkan untuk dergradasi RNA.27 Namun penelitian
tersebut dilakukan dengan menggunakan cairan tubuh manusia dalam kondisi
terkontrol (disimpan pada suhu kamar di tempat kering yang gelap) dan sampel
forensik., termasuk mayat, tidak selalu disimpan di bawah serupa kondisi.
Penelitian saat ini menggunakan autopsi yang sebenarnya yang diharapkan
mempermudah mengaplikasikan praktik forensik
Pendekatan untuk memperkirakan PMI mulai dari hari hingga tahun tidak hanya
terbatas pada satu metode; pendekatan multi-metode direkomendasikan untuk
memperkirakan PMI. Metode klasik (patologis) menggunakan algor mortis, livor
mortis, rigor mortis, dan perubahan biokimia dalam vitreous humor dapat
digunakan untuk PMI beberapa hari, entomologi forensik dapat digunakan untuk
PMI 1–2 minggu, dan metode antropologis dapat digunakan digunakan untuk PMI
lebih dari tahun. Dalam penelitian ini, ekspresi miRNA spesifik menurun pada
PMI selama beberapa bulan. Ekspresi miRNA spesifik berbeda secara statistic
antara PMI dalam jangka waktu kurang satu bulan dan lebih dari satu bulan.
Penelitian ini mempunyai keterbatasan, sebagai contohnya, jumlah sampel tidak
mencukupi, terutama yang berkaitan dengan sampel PMI jangka panjang. Akan
tetapi , data ini menunjukkan analisis kuantitatif ekspresi miRNA dalam jaringan
tulang dapat digunakan untuk memperkirakan PMI beberapa bulan.

Gambar 1. (A) Tingkat ekspresi let-7e menunjukan kolerasi negatif dengan

penigkatan PMI (R2 – 0.3025) (B) tingkat ekspresi miR-16 menunjukan kolerasi
negative dengan penigkatan PMI (R2 – 0.3329)

Gambar 2. Tingkat ekspresi let-7e antara kelompok PMI yang berbeda. Kelompok
A memiliki perbedaan signifikan dari kelompok lain pada kedua ekspresi let-7e
dan miR-16. Tanda bintang menunjukan signifikan secara statistik (P<0.05)
Kesimpulan
Jaringan tulang tahan terhadap berbagai tekanan lingkungan; jaringan tulang
adalah yang terakhir tersisa di antara jaringan tubuh mati. miRNA lebih stabil
dibandingkan jenis RNA lainnya. Kesimpulannya, pendekatan multi-metode
direkomendasikan untuk memperkirakan PMI. Data disajikan dalam penelitian ini
menunjukkan bahwa tingkat ekspresi miRNA spesifik di jaringan tulang dapat
digunakan untuk memperkirakan PMI selama beberapa bulan. Penelitian yang
menggunakan sampel PMI jangka panjang diperlukan untuk menguatkan lebih
lanjut penemuan-penemuan ini.

Pendanaan
Penelitian ini didukung oleh penelitian dasar melalui Kementerian Yayasan
Pendidikan dan Riset Nasional Republik Korea(NRF-2018R1D1A1B07049459)
dan dengan hibah penelitian tahun 2020 dari Rumah Sakit Universitas Nasional
Pusan Yangsan.