PCR

Oleh:
Nama : Iqbal Auni Rahman
NIM : B1A018105
Rombongan :I
Kelompok :2
Asisten : Bramassetyo Aji

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2020
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum PCR adalah mengetahui cara teknik PCR gen beta
aktin dari sampel DNA yang diperoleh.

B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum PCR adalah DNA sampel,

primer forward, primer reverse, akuabides, MyTaqTM DNA Polymerase PCR mix
(buffer PCR, dNTP, MgCl2, DNA Taq Polymerase).
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum dalam praktikum PCR adalah
mikropipet, mikrotip, microtube 1,5 ml, microtube PCR 0.2 ml, dan PCR
apparatus.

C. Prosedur Kerja

1. Pembuatan PCR Mix

Setiap sampel uji diambil 3,5 μl, dimasukan pada microtube PCR
ukuran 0,2 ml

PCR mix diambil sebanyak 6,5 μl untuk satu sampel,

dimasukan ke dalam microtube yang berisi akuabides

Primer forward diambil sebanyak 1μl, dimasukan ke

microtube yang berisi akuabides dan PCR mix

Primer reverse diambil sebanyak 1μl, dimasukan ke microtube

yang berisi akuabides, PCR mix , dan primer forward

Hasil campuran PCR mix diambil sebanyak 12 μl

Sampel DNA diambil sebanyak 1 μl, dipindahkan ke

dalam campuran reagen PCR mix
2. Konfigurasi Mesin PCR

Tekan tombol mode, pilih menu ‘program’ dengan

menekan tombol Run

Tekan tombol ‘Alpha’ untuk mengubah mode pengetikan

menjadi Alphabet, ketikan nama file

Tekan tombol ‘Del’ jika ingin dihapus huruf yang

terblok

Tekan tombol ‘Alpha’ kembali jika ingin menggunakan angka

dalam penamaan file

Sesuaikan dengan menu yang akan dilakukan, pada tahap pertama yaitu
denaturasi pilih ‘TEMP’ lalu atur suhu dan waktu

Pada tahapan no 3 di menu PCR , pilih ‘LOOP’

Tahapan selanjutnya diisi sesuai kondisi tahapan denaturasi,

annealing dan polimerisasi, set pada ‘LOOP’

Pilih menu ‘END’ , tekan tombol ‘RUN’

Sampel dimasukan ke dalam mesin, pilih menu Select + Run Prg,

pilih program yang sudah di set sebelumnya

Tekan tombol run sampai mesin PCR bekerja

 Jika ingin langsung digunakan bisa dibatalkan dengan
memencet tombol ‘stop’

Buka penutup dan sampel diambil. Sampel siap digunakan

Mesin dimatikan
D. Hasil dan Pembahasan

Langkah pertama yang dilakukan dalam praktikum Polymerase Chain

Reaction (PCR) adalah 3,5μl diambil untuk tiap sampel seperti pada Gambar 1
lalu dimasukan pada microtube PCR ukuran 0,2 ml seperti pada Gambar 2.

Gambar 1. Pengambilan sampel uji

Gambar 2. Proses penempatan sampel uji pada microtube

PCR mix yang sudah disiapkan, diambil sebanyak 6,5 μl untuk satu sampel seperti
pada Gambar 3 dan dimasukan ke microtube yang telah berisi akuabides (ddH2O)
seperti pada Gambar 4. Fungsi dari larutan ddH2O adalah sebagai larutan
pengencer atau pelarut[ CITATION Kri19 \l 1033 ].

Gambar 3. Pengambilan PCR mix

 Gambar 4. Proses penempatan ke dalam microtube berisi akuabides
Selanjutnya primer forward diambil sebanyak 1μl menggunakan mikropipet
seperti pada Gambar 5 dan dimasukan ke microtube yang telah berisi akuabides
dan PCR mix seperti pada Gambar 6.

Gambar 5. Pengambilan primer forward sebanyak 1μl

Gambar 6. Primer reverse dimasukkan ke dalam microtube

Kemudian primer reverse diambil sebanyak 1μl menggunakan mikropipet seperti
pada Gambar 7 dan dimasukan ke microtube yang berisi akuabides, PCR mix dan
primer mix seperti pada Gambar 8.

Gambar 7. Pengambilan primer reverse sebanyak 1μl

 Gambar 8. Primer reverse dimasukkan ke dalam microtube
Langkah berikutnya mengambil campuran PCR mix sebanyak 12 μl umtuk
masing-masing sampel seperti pada Gambar 9 kemudian sampel diambil sebanyak
1 μl seperti pada Gambar 10 dan dipindahkan ke campuran reagen PCR mix
seperti pada Gambar 11.

Gambar 9. Pengambilan campuran mix sebanyak 12 μl

Gambar 10. Pengambilan sampel sebanyak 1μl

Gambar 11. Pemindahan ke campuran reagen PCR mix

 Langkah pertama yang dilakukan dalam konfigurasai mesin PCR adalah
menekan tombol mode, kemudian memilih menu ‘program’ dengan menekan
tombol Run seperti pada Gambar 12.

Gambar 12. Pilih menu program dan tekan tombol run

Kemudian tekan tombol ‘Alpha’ untuk mengubah mode pengetikan menjadi
Alphabet seperti pada Gambar 13 dan ketikan nama file.

Gambar 13. Tombol ‘Alpha’ ditekan, dan nama file diketik

Jika ingin menghapus tekan tombol ‘Del’ pada huruf yang terblok seperti pada
Gambar 14.

Gambar 14. Tombol Del ditekan untuk penghapusan huruf

Selanjutnya jika ingin menggunakan angka dalam penamaan file tekan tombol
‘Alpha’ kembali seperti pada Gambar 15.
 Gambar 15. Tombol ‘Alpha: ditekan kembali untuk menggunakan angka

Menyesuaikan dengan menu yang akan dilakukan. Tahap pertama denaturasi pada
suhu 95 selama 5 menit satu siklus dan pilih ‘TEMP’ lalu atur suhu dan waktu
seperti pada Gambar 16.

Gambar 16. TEMP dipilih untuk mengatur suhu dan waktu

Pada tahapan no 3 dimenu PCR pilih ‘LOOP’ seperti pada Gambar 17.

Gambar 17. Tahap no 3 pilih Loop

Tahapan selanjutnya diisi sesuai kondisi tahapan denaturasi, annealing dan
polimerisasi dan set pada ‘LOOP’ seperti pada Gambar 18.

Gambar 18. Set pada Loop dan ditekan

Pilih menu ‘END’ dan tekan tombol ‘RUN’seperti pada Gambar 19.
 Gambar 19. Pilih menu End dan tekan Run
Sampel dimasukan ke dalam mesin seperti pada Gambar 20 dan pilih menu Select
+ Run Prg seperti pada Gambar 21 dan pilih program yang sudah di set
sebelumnya. Tekan tombol run hingga mesin PCR bekerja seperti pada Gambar
22. Jika ingin langsung digunakan bisa dibatalkan dengan memencet tombol
‘stop’ seperti pada Gambar 23. Langkah terkahir yaitu membuka penutup dan
sampel diambil seperti pada Gambar 24 dan mesin nonaktifkan seperti pada
Gambar 25.

Gambar 20. Sampel dimasukkan ke dalam mesin

Gambar 21. Pilih menu Select + Run Prg

Gambar 22. Tekan tombol run sampa mesin menyala

Gambar 23. Tekan Stop jika ingin segera digunakan

Gambar 24. Pentup dibuka dan sampel diambil

Gambar 25. Mesin dimatikan

 Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknologi yang mampu
melipat gandakan sebagian fragmen DNA yang terdapat dalam kompleks
makromolekul genom dari berbagai sumber (hewan, tumbuhan, bakteri, dan
virus). PCR melibatkan beberapa tahapan yaitu, denaturasi, penempelan primer
pada templat (annealing), dan pemanjangan primer (extension)[ CITATION Ami19 \l
1033 ]. Metode konvensional perbanyakan DNA dengan PCR terdiri dari tiga
langkah yaitu denaturasi template DNA langkah ini memutuskan ikatan hidrogen
antar basa yang terdapat dalam pasangan untai DNA template. Untai
ganda DNA template dipisahkan pada suhu 94-95°C. Tahap selanjutnya adalah
annealing atau penempelan primer-primer pada segmen tertentu DNA
menggunakan suhu spesifik dimana fragmen DNA akan diperbanyak, dan proses
yang terakhir adalah pemanjangan primer atau polimerasi pada suhu 72°C yaitu
suhu optimal enzim untuk memanjangkan primer-primer yang sudah menempel
tadi. Waktu yang dibutuhkan untuk berpindah dari satu langkah ke langkah
selanjutnya dalam satu kali siklus PCR secara umum pada proses denaturasi
biasanya paling lama 30 detik, durasi annealing sangat bergantung pada
spesifikasi dan panjang primer yang dibuat tetapi untuk mudahnya durasi tidak
kurang dari 15 detik dan tidak lebih lama dari 1 menit, sedangkan durasi
polimerasi sangat ditentukan oleh panjang fragmen DNA yang dihasilkan. DNA
dengan ukuran 1 kb dibutuhkan durasi 1 menit tergantung pada jenis enzim
polimerase yang digunakan. Enzim DNA polimerase yang digunakan dalam tahap
ekstensi adalah Taq DNA polymerase[ CITATION Ang16 \l 1033 ].
Komponen yang digunakan dalam pembutan PCR mix antar lain adalah
DNA template, primer, dNTPs, ddH2O, buffer PCR, MgCl2 dan Taq polymerase.
Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru yang sama, sementara primer berfungsi untuk
inisiasi proses replikasi. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) berfungsi
sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTPs
akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru
yang komplementer dengan untai DNA template. Buffer PCR berfungsi
mengkondisikan reaksi agar optimum dengan menjamin pH larutan seimbang dan
stabilisasi enzim DNA polimerase, sementara ddH 2O berfungsi sebagi pelarut dari
master mix PCR. MgCl2 Bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi
aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer
dengan template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP. Taq DNA
polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq). Enzim ini memiliki
kemampuan polimerisasi DNA yang sangat tinggi, namun tidak memiliki aktivitas
eksonuklease 3’ ke 5’. Taq DNA polimerase mampu tahan sampai suhu mendidih
100ºC, dan aktivitas optimalnya dapat berlangsung pada suhu 92-95ºC [ CITATION
Mau16 \l 1033 ].
Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’
yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Dalam merancang suatu primer
perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer
berkisar antara 18-30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan
menjadikan spesifisitas primer rendah. Selain itu perlu diperhatikan
komposisinya. Urutan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini karena dapat
menurunkan spesifisitas primer. Kandungan (G+C) (% jumlah G dan C)
sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Melting
temperature (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah.
SebaiknyaTm primer berkisar antara 50- 65°C. Menghindari penempelanprimer di
tempat lain yang tidak diinginkan karena keadaan ini dapat berpengaruh pada
efisiensi proses PCR[ CITATION Ani19 \l 1033 ].
 DAFTAR REFERENSI

Aminah, Ramadini, R. & Naid, T., 2019. Analisis Cemaran DNA Tikus pada Bakso
Daging Sapi yang Beredar di Makassar dengan Metode Polymerase Chain
Reaction (PCR). Jurnal Farmasi Galenika, 5(1), pp. 93-100.

Anika, M., Putri, D. H. & Wahyuni, 2019. Primer Design for Identification of Beta-
Carotene Encoding Genes in Cassava. Bio Sains, 4(1), pp. 39-47.

Feranisa, A., 2016. Komparasi antara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Loop-
Mediated Isothermal Amplification (LAMP) dalam Diagnosis Molekuler.
Odonto Dental Journal, 3(2), pp. 145-151.

Maulana, K. A., Christiana, S. & Susilowati, A., 2016. Perbedaan Kekuatan Tekan
Bahan Fissure Sealant Berbasis Resin Filler dan Unfiller. Odonto Dental
Journal, 3(2), pp. 1-8.

Nugroho, K., Terryana, R. T., Reflinur & Lestari, P., 2019. Metode Ekstraksi DNA
Tanaman Tanpa Presipitasi Etanol untuk Kegiatan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia, 6(1), pp. 29-38.