NAMA : IQBAL AUNI RAHMAN

NIM : B1A018105
ASISTEN : PUTRI RAMADANI
KELOMPOK :2
ROMBONGAN : II
ACARA 2
ISOLASI MIKROORGANISME PATOGEN PADA PANGAN
Pangan adalah segala sesuatu yang berasal dari sumber hayati dan air, baik yang
diolah maupun tidak diolah, yang diperuntukkan sebagai makanan atau minuman bagi
konsumsi manusia termasuk bahan tambahan pangan, bahan baku pangan dan bahan lain
yang digunakan dalam proses penyiapan, pengolahan dan atau pembuatan makanan atau
minuman. Mikroorganisme patogenik adalah mikroorganisme yang menyebabkan penyakit
pada inangnya. Kontaminasi mikroorganisme patogenik maupun toksin yang dihasilkannya
pada produk makanan dapat menyebabkan foodborne disease atau penyakit terbawa pangan
jika produk tersebut dikonsumsi oleh manusia. Bakteri patogen merupakan penyebab
penyakit yang sering berhubungan dengan bidang penyehatan makanan, seperti diare,
muntaber, tifus, dan infeksi saluran pencernaan disebabkan masih tingginya tingkat
kontaminasi mikroorganisme pada makanan yang disajikan oleh berbagai penyedia makanan
(Yuliani & Oematan, 2013). Pangan dapat beracun karena telah terkontaminasi oleh bakteri
patogen yang kemudian dapat tumbuh dan berkembang biak selama penyimpanan, sehingga
bakteri tersebut mampu memproduksi toksin yang berbahaya bagi manusia (Ekawati, et al.,
2017).
Foodborne disease adalah penyakit akibat suatu bahan pangan yang terkontaminasi
oleh mikroorganisme atau racun. Makanan yang telah terkontaminasi oleh mikroorganisme
atau racun masuk ke dalam tubuh melalui proses pencernaan yang dapat menyebabkan
penyakit, seperti sindrom gastrointestinal atau gejala neurologis. Penyakit akibat pangan
yang terjadi segera setelah mengonsumsi pangan umumnya disebut keracunan. Penyebab
keracunan pangan bisa disebabkan oleh adanya bakteri. Tipe bakteri penyebab keracunan
pangan antara kain, bakteri yang menyebabkan penyakit infeksi apabila tertelan bersama
pangan, misalnya Salmonella sp., Escherichia coli, dan Vibrio sp. Kemudian ada bakteri
yang hidup dan melepaskan racun di dalam intestin contohnya, Clostridium weichii,
selanjutnya ada jenis bakteri yang tumbuh dan berkembang biak di dalam bahan pangan dan
menghasilkan racun sebelum pangan tersebut dikonsumsi contohnya adalah Staphylococcus
aureus, Clostridium botulinum, dan Bacillus cereus. Tipe berikutnya yaitu organisme
patogen yang menggunakan bahan pangan sebagai carrier misalnya Shigella brucella dan
golongan virus. Terdapat banyak faktor yang dapat mempengaruhi jumlah dan jenis mikroba
yang terdapat dalam makanan, diantaranya yaitu sifat makanan itu sendiri (pH, kelembaban,
nilai gizi), keadaan lingkungan darimana makanan tersebut diperoleh, kondisi pengolahan
ataupun penyimpanan (Apriani & Nurani, 2019). Isolasi mikroorganisme patogen pada
pangan penting karena pangan merupakan kebutuhan dasar manusia, jaminan proteksi
kesehatan publik terhadap bahaya mikroorganisme patogen, jaminan bahwa pangan secara
keseluruhan belum pernah tercemar, jaminan bahwa bahan pangan memiliki harapan waktu
simpan yang lama serta sebagai jaminan keamanan dan kualitas pangan, terutama berkaitan
dengan peran bahan pangan dalam penyebaran penyakit.
Alat yang digunakan praktikum isolasi mikroorganisme patogen pada pangan
adalah mortar dan pestle, tabung reaksi, cawan petri, jarum inokulasi (jarum ose), object dan
cover glass, pipet ukur 1 ml, pembakar bunsen, dan inkubator, sedangkan untuk bahan yang
digunakan adalah akuades/arutan garam fisiologis/peptone water, sampel pangan, reagen
pewarnaan Gram, media Salmonella Shigella Agar (SSA), Manitol Salt Agar (MSA),
Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar (TCBSA), Eosyn Methylene Blue Agar (EMBA),
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), dan Nutrient Agar (NA). Cara kerja praktikum yang pertama
yaitu isolasi bakteri Salmonella, Shigella, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
Tahap yang dilakukan diawali dengan, mengambil sampel pangan dari bagian tertentu
sebanyak 1 gram, kemudian dihancurkan dengan mortar dan pestle. Sampel kemudian diberi
akuades steril sebanyak 9 ml, sebagai suspensi pada pengenceran 10-1. Setelah proses
tersebut dilanjutkan dengan pengenceran bertingkat, pipet suspensi sebanyak 1 ml,
masukkan ke dalam tabung reaksi kedua, diperoleh maka diperoleh pengenceran 10-2, hal
yang sama dilakukan sampai dengan diperoleh tingkat pengenceran 10-5 dan 10-6. Pada
pengenceran 10-5 dan 10-6 diinokulasikan ke medium cawan SSA, MSA, dan EMBA masing-
masing 0,1 ml. Kemudian diratakan menggunakan batang Drugalsky, setelah itu bungkus
cawan petri, dan inkubasikan secara terbalik pada suhu 37oC selama 24 jam di dalam
inkubator, amati adanya pertumbuhan bakteri.
Hasil pengamatan pada media EMBA adalah terdapat koloni berwarna hijau dengan
kilap logam. Media EMBA mengandung laktosa, bila dalam biakan terdapat bakteri anggota
genus Escherichia maka asam yang dihasilkan dari fermentasi laktosa akan menghasilkan
warna koloni yang spesifik (Sari, et al., 2019). Hasil yang diperoleh pada uji MSA ini adalah
terdapat perubahan media dari warna merah menjadi kuning. Perubahan ini dikarenakan
adanya phenol acid serta karena fermentasi mannitol yang dilakukan Staphylococcus aureus.
Koloni Staphylococcus aureus dalam cawan terlihat berwarna kuning emas, bulat, dan
cembung (Odunayo, et al., 2011). Hasil yang diperoleh pada uji SSA adalah koloni
berbentuk bulat, elevasinya cembung dengan pinggiran rata, adanya perubahan warna media,
yaitu kuning pada butt (dasar) dan merah pada slant (permukaan miring). Perubahan warna
tersebut terjadi karena adanya fermentasi glukosa oleh Salmonella sp., sementara untuk
Shigella terbentuk koloni berwarna putih. Bakteri dari genus Shigella tidak memfermentasi
laktosa dan tidak menghasilkan H2S maupun enzim tiosulfat reduktase sehingga koloni yang
tumbuh berwarna putih atau tidak berwarna (bening) (Aini, 2018).
Cara kerja praktikum yang berikutnya adalah uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA),
langkah pertama yaitu isolat bakteri yang tumbuh pada medium NA diambil menggunakan
jarum ose steril, kemudian diinokulasikan isolat bakteri secara aseptis ke medium TSIA
dengan cara tusukan pada bagian tegak dan dengan cara gores pada bagian miring. Inkubasi
biakan pada suhu ±37oC selama 24 jam, setelah itu hasil diamati berupa terbentuknya
perubahan warna pada bagian tegak dan miring serta terbentuknya gas dan warna hitam
karena adanya H2S. Hasil interpretasi pada uji TSIA yaitu bagian tegak merah, bagian miring
merah (K/K) menunjukkan sukrosa, glukosa, dan laktosa tidak difermentasi oleh bakteri,
kedua bagian tegak kuning, ada gelembung udara, bagian medium pecah, dan bagian miring
kuning menunjukkan glukosa, sukrosa, dan laktosa difermentasi oleh bakteri. Medium yang
pecah menunjukkan bakteri tersebut menghasilkan gas. Bagian tegak kuning, bagian miring
merah (A/K) dan timbul warna hitam, menunjukkan hanya glukosa yang difermentasi oleh
bakteri sedangkan laktosa dan sukrosa tidak difermentasi. Timbulnya warna hitam dengan
bau khas menunjukkan bakteri menghasilkan H2S. Bagian tegak kuning, bagian miring
merah (A/K) dan timbul warna hitam, dan bagian tegak terangkat menunjukkan bahwa
fermentasi glukosa saja memproduksi gas dan H2S. Bagian tegak kuning, bagian miring
kuning (A/A), dan timbul warna hitam, menunjukkan glukosa, sukrosa, dan laktosa
difermentasi oleh bakteri-bakteri tersebut menghasilkan H2S (Hayati, et al., 2019).
Cara kerja yang terakhir yaitu pewarnaan Gram. Langkah pertama bersihkan object
glass dengan kapas yang telah dibasahi alkohol. Langkah berikutnya ulasan bakteri dibuat
pada object glass dengan cara 1 tetes akuades steril diteteskan dan sentuhkan jarum ose pada
bagian atas koloni bakteri, kemudian dicampurkan dengan akuades, ulasan dibuat seluas
kira-kira 1 cm2. Setelah itu difiksasi dengan api bunsen agar ulasan melekat erat pada object
glass. Ulasan selanjutnya ditetesi dengan reagen Gram A atau pewarna crystal violet (CV)
dan biarkan ±1 menit, setelah itu dicuci dengan air mengalir selama 5 detik. Selanjutnya
reagen Gram B atau mordant, yaitu larutan iodin lugol diteteskan, reagen ini berfungsi
menguatkan ikatan atau afinitas zat warna CV pada sel bakteri. Mordant kemudian dibiarkan
bereaksi selama ±1 menit. Tanpa dibilas, preparat langsung ditetesi reagen Gram C, yaitu
peluntur atau decolorizer berupa larutan etanol 96% atau bisa juga menggunakan aseton
selama 3 detik, dilanjutkan dengan pencucian dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Setelah kering, preparat ditetesi dengan reagen Gram D atau pewarna sekunder yaitu
safranin, biarkan selama 1 menit, selanjutnya dicuci dengan air mengalir selama 5 detik lalu
dikeringanginkan. Setelah preparat kering, kemudian diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran sedang lalu kuat menggunakan minyak imersi. Sel nampak berwarna ungu adalah
sel bakteri Gram positif dan berwarna merah atau pink adalah sel bakteri Gram negatif
(Waluyo, 2011).
 DAFTAR REFERENSI
Aini, F., 2018. Isolasi dan Identifikasi Shigella sp. Penyebab Diare Pada Balita. Biosite, 4(1),
pp. 1-40.
Apriani & Nurani, 2019. Isolasi Bakteri Aerob Patogen Pada Kue Siap Saji di Pasar Grogol
Jakarta. Jurnal Vokasi Kesehatan, 5(1), pp. 63-66.
Ekawati, E. R., Husnul, S. N. & Hamidi, F. R., 2017. Deteksi Escherichia coli Patogen Pada
Pangan Menggunakan Metode Konvensional dan Metode Multiplex PCR. Jurnal
Sain Health, 1(2), pp. 75-82.
Hayati, L. N., Tyasningsih, W. & Praja, R. N., 2019. solasi dan Identifikasi Staphylococcus
aureus pada Susu Kambing Peranakan Etawah Penderita Mastitis Subklinis di
Kelurahan Kalipuro Banyuwangi. Jurnal Medik Veteriner, 2(2), pp. 76-82.
Odunayo, A. A., Ogunkanmbi, D. & Adejumoke, M. B. J., 2011. Staphylococcus aureus
Isolated from Septic Caesaerean Wound at Ile Ife Nigeria: Antibiotics
Susceptibility Patterns. International Journal of Medicine and Medical Sciences,
3(5), pp. 149-154.
Sari, D. P., Rahmawati & Rusmiyanto, E., 2019. Deteksi dan Identifikasi Genera Bakteri
Coliform Hasil Isolasi dari Minuman Lidah Buaya. Jurnal Labora Medika, 3(1),
pp. 29-35.
Waluyo, L., 2011. Teknik Metode Dasar Mikrobiologi. Malang : UMM Press.
Yuliani, N. S. & Oematan, A. B., 2013. Identifikasi Mikrobiologi (Staphylococcus dan
Coliform) Pada Susu dan Daging Serta Olahannya di Kota Jogjakarta. Partner,
20(1), pp. 20-29.
Lampiran Cara Kerja
1. Isolasi Salmonella, Shigella, E. coli, dan S. aureus

1 ml
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Sampel makanan seabanyak 1

gram dihancurkan dengan
mortar dan pestle 10-3 10-4 10-5 10-6
10-1 10-2

EMBA EMBA
Inkubasi 2x24 jam pada
suhu 37oC
SSA SSA

MSA MSA

Hasil dua pengenceran terakhir diinokulasi secara

duplo ke media EMBA, SSA, dan MSA

2. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

EMBA EMBA

Inkubasi 2x24 jam

SSA SSA
pada suhu 37oC

MSA MSA
Diamati
Inokulasikan isolat bakteri
Isolat bakteri yang tumbuh
secara aseptis ke media TSIA
pada media diambil
dengan cara tusukan pada
menggunakan jarum ose steril
bagian tegak dan dengan cara
gores pada bagian miring
3. Pewarnaan Gram
Dicuci dengan air
mengalir
Crystal violet

60 detik

Lalu dikeringanginkan
Fiksasi

Dicuci dengan air

mengalir Lugol’s iodine
Ethanol 96%
Safranin

60 detik
45 detik
Tetesi hingga tidak ada lagi
Lalu dikeringanginkan warna menetes pada gelas
objek

Dicuci dengan air

mengalir

Mikroskop

Lalu dikeringanginkan Diamati pada perbesaran

400X