PCR

Oleh:
Nama : Iqbal Auni Rahman
NIM : B1A018105
Rombongan :I
Kelompok :2
Asisten : Bramassetyo Aji

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2020
A. Tujuan

Tujuan dari praktikum PCR adalah mengetahui cara teknik PCR gen beta
aktin dari sampel DNA yang diperoleh.

B. Materi

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum PCR adalah DNA sampel,

primer forward, primer reverse, akuabides, MyTaqTM DNA Polymerase PCR mix
(buffer PCR, dNTP, MgCl2, DNA Taq Polymerase).
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum dalam praktikum PCR adalah
mikropipet, mikrotip, microtube 1,5 ml, microtube PCR 0.2 ml, dan PCR
apparatus.

C. Prosedur Kerja

1. Pembuatan PCR Mix

Setiap sampel uji diambil 3,5 μl, dimasukan pada microtube PCR
ukuran 0,2 ml

PCR mix diambil sebanyak 6,5 μl untuk satu sampel,

dimasukan ke dalam microtube yang berisi akuabides

Primer forward diambil sebanyak 1μl, dimasukan ke

microtube yang berisi akuabides dan PCR mix

Primer reverse diambil sebanyak 1μl, dimasukan ke microtube

yang berisi akuabides, PCR mix , dan primer forward

Hasil campuran PCR mix diambil sebanyak 12 μl

Sampel DNA diambil sebanyak 1 μl, dipindahkan ke

dalam campuran reagen PCR mix
2. Konfigurasi Mesin PCR

Tekan tombol mode, pilih menu ‘program’ dengan

menekan tombol Run

Tekan tombol ‘Alpha’ untuk mengubah mode pengetikan

menjadi Alphabet, ketikan nama file

Tekan tombol ‘Del’ jika ingin dihapus huruf yang

terblok

Tekan tombol ‘Alpha’ kembali jika ingin menggunakan angka

dalam penamaan file

Sesuaikan dengan menu yang akan dilakukan, pada tahap pertama yaitu
denaturasi pilih ‘TEMP’ lalu atur suhu dan waktu

Pada tahapan no 3 di menu PCR , pilih ‘LOOP’

Tahapan selanjutnya diisi sesuai kondisi tahapan denaturasi,

annealing dan polimerisasi, set pada ‘LOOP’

Pilih menu ‘END’ , tekan tombol ‘RUN’

Sampel dimasukan ke dalam mesin, pilih menu Select + Run Prg,

pilih program yang sudah di set sebelumnya

Tekan tombol run sampai mesin PCR bekerja 

 Jika ingin langsung digunakan bisa dibatalkan dengan
memencet tombol ‘stop’

Buka penutup dan sampel diambil. Sampel siap digunakan 

Mesin dimatikan 
D. Hasil dan Pembaahasan

L
Langkah peertama yanng dilakukaan dalam praktikum
p Polymerasee Chain
Reactioon (PCR) adalah
a 3,5μ
μl diambil untuk
u tiap sampel
s sepeerti pada Gambar
G 1
lalu dim
masukan pada microtubbe PCR uku
uran 0,2 ml seperti padaa Gambar 2.
2

Gambbar 1. Pengaambilan sam

mpel uji

Gambbar 2. Proses penempattan sampel uji

u pada miccrotube
PCR mix
m yang suddah disiapkaan, diambil sebanyak 6,5
6 μl untukk satu sampeel seperti
pada Gambar
G 3 daan dimasukaan ke micro
otube yang telah
t berisi akuabides (ddH
( 2O)

seperti pada Gam

mbar 4. Fuungsi dari larutan dddH2O adalaah sebagai larutan
pengenncer atau pellarut (Nugrooho et al., 2019).
2

Gambbar 3. Pengaambilan PC
CR mix
 Gambar 4. Proses pennempatan kee dalam microtube berisi akuabides
Selanjuutnya primeer forwardd diambil sebanyak
s 1 mengguunakan miikropipet
1μl
seperti pada Gambbar 5 dan dimasukan
d ke
k microtubbe yang telah berisi ak
kuabides
dan PC
CR mix sepeerti pada Gaambar 6.

Gam
mbar 5. Penggambilan prrimer forwaard sebanyaak 1μl

Gambaar 6. Primerr reverse dim

masukkan ke
k dalam miicrotube
Kemuddian primer reverse diaambil seban
nyak 1μl meenggunakann mikropipeet seperti
pada Gambar
G 7 daan dimasukaan ke micro
otube yang berisi
b akuabbides, PCR mix dan
primer mix sepertii pada Gambbar 8.

Gam
mbar 7. Penngambilan primer
p reverrse sebanyakk 1μl
 Gambaar 8. Primerr reverse dim
masukkan ke
k dalam miicrotube
Langkaah berikutnnya mengam
mbil campu
uran PCR mix sebannyak 12 μll umtuk
masingg-masing sam
mpel sepertti pada Gam
mbar 9 kemuudian sampeel diambil sebanyak
s
1 μl seeperti pada Gambar 10
1 dan dipiindahkan ke campurann reagen PCR mix
seperti pada Gambbar 11.

Gam
mbar 9. Penggambilan caampuran mix sebanyakk 12 μl

G
Gambar 10.. Pengambillan sampel sebanyak
s 1μ
μl

Gam
mbar 11. Pem
mindahan kee campurann reagen PCR
R mix
 L
Langkah perrtama yang dilakukan dalam
d konfiigurasai messin PCR adaalah
menekaan tombol mode,
m kemuudian memillih menu ‘program’ denngan menek
kan
tomboll Run sepertti pada Gam
mbar 12.

Gam
mbar 12. Pilih menu pro
ogram dan tekan
t tombool run
Kemuddian tekan tombol ‘A
Alpha’ untu
uk mengubaah mode ppengetikan menjadi
Alphabbet seperti pada
p Gambaar 13 dan keetikan namaa file.

Gambaar 13. Tombbol ‘Alpha’ ditekan, daan nama filee diketik

Jika ingin menghaapus tekan tombol ‘Del’ pada huuruf yang teerblok sepeerti pada
Gambaar 14.

Gambaar 14. Tombbol Del diteekan untuk penghapusa

p an huruf
Selanjuutnya jika ingin
i mengggunakan an
ngka dalam
m penamaann file tekan
n tombol
‘Alpha’ kembali seeperti pada Gambar 15
5.
 Gaambar 15. Tombol
T ‘Alppha: ditekan
n kembali untuk
u mengggunakan angka

Menyesuaikan denngan menu yang

y akan dilakukan.
d T
Tahap pertaama denaturrasi pada
suhu 955 selama 5 menit
m satu siklus
s dan pilih
p ‘TEMP
P’ lalu atur ssuhu dan waaktu
seperti pada Gambbar 16.

Gambaar 16. TEM

MP dipilih un
ntuk mengattur suhu dann waktu
Pada taahapan no 3 dimenu PC
CR pilih ‘LOOP’ seperrti pada Gam
mbar 17.

Gambbar 17. Tahaap no 3 pilihh Loop

Tahapaan selanjutnnya diisi sesuai
s kondisi tahapaan denaturaasi, annealing dan
polimerrisasi dan seet pada ‘LO
OOP’ sepertti pada Gam
mbar 18.

Gambarr 18. Set pad

da Loop dann ditekan
Pilih menu
m ‘END’ dan tekan tombol
t ‘RU
UN’seperti pada
p Gambaar 19.
 Gambar 19.
1 Pilih menu End dann tekan Run
Sampell dimasukann ke dalam mesin seperti pada Gambar 20 daan pilih men
nu Select
+ Runn Prg seperrti pada Gambar
G 21 dan pilih program yyang sudah
h di set
sebelum
mnya. Tekaan tombol run
r hingga mesin PCR
R bekerja seeperti pada Gambar
22. Jikka ingin lanngsung diggunakan bissa dibatalkan dengan memencett tombol
‘stop’ seperti padda Gambar 23. Langkaah terkahir yaitu mem
mbuka penu
utup dan
sampell diambil seperti
s padaa Gambar 24 dan meesin nonakttifkan sepeerti pada
Gambaar 25.

G
Gambar 20. Sampel dim
masukkan kee dalam messin

Gambar 21. Pilih menu Select + Run Prg

Gam
mbar 22. Teekan tomboll run sampaa mesin mennyala

Gaambar 23. Teekan Stop jiika ingin seegera digunaakan

G
Gambar 24.. Pentup dib
buka dan sam
mpel diambbil

Gaambar 25. Mesin

M dimatiikan
 Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknologi yang mampu
melipat gandakan sebagian fragmen DNA yang terdapat dalam kompleks
makromolekul genom dari berbagai sumber (hewan, tumbuhan, bakteri, dan
virus). PCR melibatkan beberapa tahapan yaitu, denaturasi, penempelan primer
pada templat (annealing), dan pemanjangan primer (extension) (Aminah et al.,
2019). Metode konvensional perbanyakan DNA dengan PCR terdiri dari tiga
langkah yaitu denaturasi template DNA langkah ini memutuskan ikatan hidrogen
antar basa yang terdapat dalam pasangan untai DNA template. Untai
ganda DNA template dipisahkan pada suhu 94-95°C. Tahap selanjutnya adalah
annealing atau penempelan primer-primer pada segmen tertentu DNA
menggunakan suhu spesifik dimana fragmen DNA akan diperbanyak, dan proses
yang terakhir adalah pemanjangan primer atau polimerasi pada suhu 72°C yaitu
suhu optimal enzim untuk memanjangkan primer-primer yang sudah menempel
tadi. Waktu yang dibutuhkan untuk berpindah dari satu langkah ke langkah
selanjutnya dalam satu kali siklus PCR secara umum pada proses denaturasi
biasanya paling lama 30 detik, durasi annealing sangat bergantung pada
spesifikasi dan panjang primer yang dibuat tetapi untuk mudahnya durasi tidak
kurang dari 15 detik dan tidak lebih lama dari 1 menit, sedangkan durasi
polimerasi sangat ditentukan oleh panjang fragmen DNA yang dihasilkan. DNA
dengan ukuran 1 kb dibutuhkan durasi 1 menit tergantung pada jenis enzim
polimerase yang digunakan. Enzim DNA polimerase yang digunakan dalam tahap
ekstensi adalah Taq DNA polymerase (Feranisa, 2016).
Komponen yang digunakan dalam pembutan PCR mix antar lain adalah
DNA template, primer, dNTPs, ddH2O, buffer PCR, MgCl2 dan Taq polymerase.
Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk
pembentukan molekul DNA baru yang sama, sementara primer berfungsi untuk
inisiasi proses replikasi. Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs) berfungsi
sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTPs
akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru
yang komplementer dengan untai DNA template. Buffer PCR berfungsi
mengkondisikan reaksi agar optimum dengan menjamin pH larutan seimbang dan
stabilisasi enzim DNA polimerase, sementara ddH2O berfungsi sebagi pelarut dari
master mix PCR. MgCl2 Bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi
aktivitas DNA polimerase. Adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer
dengan template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP. Taq DNA
polymerase diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus (Taq). Enzim ini memiliki
kemampuan polimerisasi DNA yang sangat tinggi, namun tidak memiliki aktivitas
eksonuklease 3’ ke 5’. Taq DNA polimerase mampu tahan sampai suhu mendidih
100ºC, dan aktivitas optimalnya dapat berlangsung pada suhu 92-95ºC (Maulana
et al., 2016).
Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan
diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’
yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Dalam merancang suatu primer
perlu diperhatikan panjang primer yang akan dipilih. Umumnya panjang primer
berkisar antara 18-30 basa. Primer dengan panjang kurang dari 18 basa akan
menjadikan spesifisitas primer rendah. Selain itu perlu diperhatikan
komposisinya. Urutan nukleotida yang sama perlu dihindari, hal ini karena dapat
menurunkan spesifisitas primer. Kandungan (G+C) (% jumlah G dan C)
sebaiknya sama atau lebih besar dari kandungan (G+C) DNA target. Melting
temperature (Tm) adalah temperatur di mana 50 % untai ganda DNA terpisah.
SebaiknyaTm primer berkisar antara 50- 65°C. Menghindari penempelanprimer di
tempat lain yang tidak diinginkan karena keadaan ini dapat berpengaruh pada
efisiensi proses PCR (Anika et al., 2019).
 DAFTAR REFERENSI

Aminah, Ramadini, R. & Naid, T., 2019. Analisis Cemaran DNA Tikus pada Bakso
Daging Sapi yang Beredar di Makassar dengan Metode Polymerase Chain
Reaction (PCR). Jurnal Farmasi Galenika, 5(1), pp. 93-100.

Anika, M., Putri, D. H. & Wahyuni, 2019. Primer Design for Identification of Beta-
Carotene Encoding Genes in Cassava. Bio Sains, 4(1), pp. 39-47.

Feranisa, A., 2016. Komparasi antara Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Loop-
Mediated Isothermal Amplification (LAMP) dalam Diagnosis Molekuler.
Odonto Dental Journal, 3(2), pp. 145-151.

Maulana, K. A., Christiana, S. & Susilowati, A., 2016. Perbedaan Kekuatan Tekan
Bahan Fissure Sealant Berbasis Resin Filler dan Unfiller. Odonto Dental
Journal, 3(2), pp. 1-8.

Nugroho, K., Terryana, R. T., Reflinur & Lestari, P., 2019. Metode Ekstraksi DNA
Tanaman Tanpa Presipitasi Etanol untuk Kegiatan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Jurnal Bioteknologi & Biosains Indonesia, 6(1), pp. 29-38.