Pembuatan Primer- PCR

Syahdu Ayu Ekowati, M.Si.,Apt

 PCR
• is a revolutionary method developed by Kary Mullis in the 1980s
• PCR is based on using the ability of DNA polymerase to synthesize new strand of DNA complementary to the offered template strand.
Because DNA polymerase can add a nucleotide only onto a preexisting 3'-OH group, it needs a primer to which it can add the first
nucleotide.
• Umumnya jumlah siklus yang digunakan pada proses PCR adalah 30
siklus. Penggunaan jumlah siklus lebih dari 30 siklus tidak akan
meningkatkan jumlah amplicon secara bermakna dan memungkinkan
peningkatan jumlah produk yang non-target.
• Perlu diingat bahwa di dalam proses PCR effisiensi amplifikasi tidak
terjadi 100 %, hal ini disebabkan oleh target template terlampau
banyak, jumlah polimerase DNA terbatas dan kemungkinan terjadinya
reannealing untai target.
• Template DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid
ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA template tersebut
mengandung fragmen DNA target yang dituju
• Penyiapan DNA template dapat dilakukan dengan menggunakan
metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA
kromosom atau DNA plasmid.
• DNA polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan
interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut
dengan dNTP (senyawa antara).
• Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas
dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah mengandung
senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan sebaiknya antara
MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah
dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.
Hairpin

1. Hairpin pada ujung 3' dengan ΔG(energy

yang dipelukan untuk memecah struktur
hairpin) = -2 kcal/mol
2. Hairpin internal dengan ΔG = -3 kcal/mol
masih dapat ditoleransi.
Self dimer

1. Self-dimer pada ujung 3’ dengan ΔG = -5 kcal/mol

2. Selfdimer internal dengan ΔG= -6 kcal/mol masih
dapat ditoleransi.
Cross dimer/ pair dimer/ hetero dimer

1. Cross-dimer pada ujung 3’ dengan ΔG= -5 kcal/mol

2. Cross-dimer bagian internal dengan ΔG= -6 kcal/mol
masih dapat ditoleransi
Repeats & Runs
1. Perulangan yang cukup panjang dengan basa sama (lebih dari tiga
basa berurutan sama, misal memiliki 5 basa berurutan G)
basa AGCGGGGGATG
dapat menyebabkan proses penempelan primer menjadi sulit.
2. Primer sebaiknya juga tidak memiliki urutan pengulangan dari 2 basa
dan maksimum basa sebanyak 4 kali masih dapat di toleransi.
ATATATAT
Hal ini juga menyebabkan terbentuknya struktur hairpin.
• selisih suhu leleh sepasang primer tidak boleh lebih dari 5°C. Pasangan
primer sebaiknya tidak memiliki selisih suhu leleh yang tinggi.
• GC Content adalah menggunakan persen basa G dan C antara 40% hingga
60%

𝐺𝐶 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑡 = (𝑛𝐺 +𝑛𝐶 )/ Panjang primer 𝑥 100 %

• GC Clamp. GC Clamp yang dimaksud adalah ujung C, G, CG atau GC, yang

diyakini membuat hibridisasi lebih stabil.Namun perlu dihindari lebih dari 3
basa G atau C pada 5 basa terakhir ujung 3′ karena ujung 3′-nya bisa
melipat membentuk struktur dimer yang mengakibatkan ujung 3′ primer
tidak terikat pada template.