UJI SIFAT BIOKIMIA ISOLAT

1. Uji fermentasi karbohidrat

Langkah-langkah yang digunakan dalam uji fermentasi karbohidrat adalah menyiapkan

kaldu karbohidrat yaitu glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, dan manitol masing-masing 1%. Kaldu

karbohidrat yang mengandung BTB (bromtimol biru) sebagai indikator pH dan ditambahkan pepton

sebagai sumber nitrogen, vitamin dan mineral dimasukkan dalam tabung reaksi yang dilengkapi

tabung Durham. Kemudian diinokulasi dengan biakan bakteri. Setelah itudiinkubasi dalam

inkubator pada suhu 30oC selama 24 jam. Selanjutnya fermentasi karbohidrat diperiksa dengan

melihat pembentukan asam (warna kuning) dan pembentukan gas dalam tabung Durham (Lay,

1994). 

2. Uji methyl red 

Langkah-langkah yang digunakan dalam uji methyl red adalah disiapkankaldu MR-VP, lalu

dimasukkan 5 mL kaldu MR-VP dalam tabung reaksi dandiinokulasikan biakan bakteri ke dalam

kaldu MR-VP, diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam atau pada suhu 30oC selama 72 jam. Hari

berikutnya ditambahkanreagen metil merah 5 tetes, jika kaldu berwarna merah setelah

penambahan reagenmetil merah maka menunjukan hasil uji positif, dan jika warna kaldu

berwarnakuning maka hasil uji negatif (Lay, 1994).

3. Uji Voges Proskauer

Kaldu MR-VP sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi,diinokulasi bakteri pada

kaldu MR-VP, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Setelah itu ditambahkan 10

tetes larutan KOH 40% dan 15 teteslarutan α-naftol, dikocok dan dibiarkan 30 menit. Uji positif jika

kaldu berwarnamerah dan uji negatif jika kaldu tidak mengalami perubahan warna setelah

penambahan reagen (Lay, 1994).

4. Uji oksidase
 Biakan ditumbuhkan pada media nutrien agar (NA), diinkubasi selamapada suhu 30oC

selama 24 jam, kemudian ditambahkan reagen uji oksidase(campuran 1:1 larutan (naftol 1% dan

1% larutan dimetil-p-fenilendiaminoksalat) pada koloni bakteri dan didiamkan selama 30 menit. Uji

positif jikawarna koloni berubah menjadi hitam (Lay, 1994).

5. Uji katalase

Biakan ditumbuhkan pada media NA dengan cara ditotolkan dandiinkubasi selama 24 jam

pada suhu 30oC kemudian ditambahkan reagen H2O2 3 %. Uji positif ditandai dengan

pembentukan gelembung udara pada biakan dandisekitarnya (Lay, 1994).

6. Uji indol

Medium tripton cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL,diinkubasi selama

24 jam pada suhu 35oC, kemudian ditambahkanbeberapa tetes reagen Kovacs. Jika terbentuk

warna merah dipermukaan mediummenunjukkan hasil uji positif (Waluyo, 2008).

7. Uji sitrat

Biakan diinokulasi pada media Simmon sitrat agar dengan inokulumyang tipis, kemudian

diinkubasi pada suhu 35 0C selama 48 jam. Jika terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru

menunjukan uji positif (Lay, 1994).

8. Uji pencairan gelatin

Biakan diinokulasi pada media dengan cara menusukkan mikroba yangakan diujikan

sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan, kemudian diinkubasipada suhu 350C selama 24 jam. Jika

media gelatin mencair, maka langkahselanjutnya dimasukkan dalam lemari es selama 30 menit.

Diamati pencairan gelatin, jika terdapat gelatin yang mencair menunjukkan uji positif. Namun

jikatidak mencair maka di inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 35 0C. Ujinegatif jika

setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).

9. Uji hidrogen sulfida ( H2S) ?

 Inokulasi biakan pada tabung reaksi yang telah berisi media TSIA 7 Ml dengan cara

menusukkan jarum ose ke dalam media kemudian baru diinokulasi pada bagian slant TSIA.

Inkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Diamati pertumbuhannya pada bagian  Butt  dan Slant (Lay,

1994). H2S diproduksi oleh beberapa jenis mikroorganisme melalui pemecahan asam amino yang mengandung

unsur belerang (S) seperti lisin dan metionin. H2S dapat juga diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa belerang

anorganik, misalnya : tiosulfat, sulfit atau sulfat. Adanya H2S dapat diamati dengan menambahkan garam-garam

logam berat ke dalam medium. Dikatakan positif apabila H2S bereaksi dengan senyawa-senyawa ini ditandai dengan

terbentuknya logam sulfit yang berwarna hitam. Dan dikatakan negatif apabila tidak terbentuk logam sulfit yang

berwarna hitam karena bakteri yang berada dalam medium tersebut tidak dapat menghidrolisis logam-logam berat

yang terkandung dalam medium.

10. Uji urease

Inokulasi biakan pada media urea agar miring dengan mikroorganisme,kemudian

diinkubasi pad suhu 350C selama 24 jam. Jika terjadi perubahan warnadari kuning menjadi merah

keunguan maka menunjukkan uji positif (Hadioetomo, 1985).

11. Uji selulase

Inokulasi biakan pada media Luria agar (LA) yang mengandung CMC (karboksi metal selulase) pada

cawan Petri dengan melubangi agar pada cawandengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai

5 lubang kemudian diinokulasi dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian dimasukkandalam

1 mL aquades steril lalu dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikrosebelum dipipet lalu

diinokulasi pada lubang yang terdapat pada agar sebanyak 100 L . Kemudian diinkubasi selama

24 jam pada inkubator dengan posisi tidak terbalik pada suhu 37oC. Uji positif ditunjukkan dengan

terbentukknya zonabening di sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih, 2007).

12. Uji protease

 Inokulasi biakan pada media LA yang mengandung susu skim padacawan Petri dengan membagi

media menjadi 4 bagian dengan menggunakanspidol pada bagian luar cawan petri, kemudian

digoreskan inokulum pada 4bagian media tersebut (Gambar 19.b). Kemudian diinkubasi selama 24

jam padainkubator dengan suhu 37 oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zonabening di

sekitar daerah goresan (Akhdiya, 2003).

13. Uji hidrolisis pati

Biakan diinokulasi pada media NA yang mengandung pati, dengan caramelubangi agar pada cawan

dengan menggunakan cut borer sebanyak 4 sampai 5lubang (Gambar 19.a), kemudian diinokulasi

dengan cara mengambil 1 ose biakan kemudian diencerkan dalam 1 mL aquades steril lalu

dihomogenkan dengan menggunakan pipet mikro sebelum dipipet dan diinokulasi pada lubang

yangterdapat pada agar sebanyak 100L . Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada inkubator dengan

posisi tidak terbalik pada suhu 37 oC. Uji positif ditunjukkan dengan terbentukknya zona bening di

sekitar daerah inokulasi (Yulianingsih,2007).

14. Uji reduksi nitrat

Uji nitrat dilakukan dengan menumbuhkan mikroorganisme pada kaldunitrat dalam tabung

reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung Durham,kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24

jam. Setelah masa inkubasi,diperhatikan adanya gas dalam tabung Durham dan nitrit dalam media

biakan. Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam sulfanilat dan α-naftilamin

yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan dengan perubahanwarna media menjadi merah

atau merah muda. Pada tabung yang tidak menunjukkan perubahan warna, ditambahkan bubuk

Zn untuk melihat reduksinitrat menjadi nitrit. Bila didapatkan nitrat dalam medium, maka kaldu

berubahwarna menjadi merah muda atau merah karena Zn mereduksi nitrat menjadi nitritdan nitrit

ini bereaksi dengan reagen uji dan terbentuk warna merah (Lay, 2004).
METODE UJI BIOKIMIA

Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:

1. Reaksi Fermentasi Karbohidrat (Gula-gula)

Fermentasi merupakan salah satu aktivitas biokimia yang dilakukan olehmikroba.

Fermentasi adalah proses pengubahan senyawa makromolekul organik menjadi senyawa yang

lebih sederhana oleh aktivitas mikrobia pada kondisi anaerob. Fermentasi dapat menghasilkan

berbagai senyawa akhir, contohnya fermentasikarbohidrat yang dapat menghasilkan berbagai

senyawa asam seperti asam laktat danpropionet, ester-ester, keton dan gas (Pelczar, 2008).

Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupakarbohidrat yang

selanjutnya difermentasi menghasilkan asam-asam organic (sepertiasam laktat, format, asetat),

dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Oragnisme-organisme yang berbeda akan

menggunakan karbohidrat / gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang

dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakana untuk melihat adanya pembentukan asam yaitud

engan adanya perubahan warna indicator (merah fenol atau biru bromtimol) yang terdapat dalam

perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indicator merah fenol) atau

berwarna biru (indicator biru bromtimol) serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan terlihatnya

udara di dalam tabung peragian / fermentasi (tabung Durham). Degradasi fermentasi dalam

kondisi anaerob dilakukan dalam kaldu fermentasi yang mengandung tabung durham, sebuah
 botol batin terbalik untuk mendeteksiproduksi gas sebagai ilustrated. media fermentasi karbohidrat

yang khas mengandung:

a. Nutrisi bahan kaldu untuk mendukung pertumbuhan semua organisme.

b. Karbohidrat tertentu yang berfungsi sebagai substrat untuk menentukankemampuan fermentasi

organisme.

c. Indikator ph merah fenol, yang berwarna merah pada ph netral (7) danperubahan kuning pada

ph sedikit asam dari 6,8 menunjukkan bahwa jumlah sedikit asam akan menyebabkan perubahan

warna..

Jenis karbohidrat yang digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antaralain , sukrosa,

laktosa, maltosa dan manitol. Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap

pertama sedangkan sukrosa, laktosa, manitol dan maltosa akandihidrolisis terlebih dahulu menjadi

monosakarida penyusunnya. Laktosa dihidrolisismenjadi galaktosa dan glukosa. Sukrosa

dihidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa. Manitol diubah menjadi manosa atau galaktosa.

Sedangkan maltosa akan dihidrolisismenjadi dua molekul glukosa.Monosakarida jenis manosa dan

galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadiglukosa melalui reaksi epimerisasi . Sedangkan

fruktosa akan diubah terlebih dahulumenjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian fruktosa 6-fosfat

diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi galaktosa dan

manosa akanmasuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam piruvat,

asamasetat dan CO2 dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asamasetat

direduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama,membentuk asam

laktat dan etanol.

2. Uji Imvic (Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer, Simmon’s Citrate)

Identifikasi basil enterik adalah sangat penting dalam mengendalikan infeksi ususdengan

mencegah kontaminasi pasokan makanan dan air. kelompok bakteri yangdapat ditemukan di
saluran usus manusia dan mamalia yang lebih rendahdiklasifikasikan sebagai anggota

family Enterobacteriaeae. Mereka pendek, gramnegatif, non-spora membentuk basil. Yang termasuk

dalam keluarga ini adalah:

a. Patogen seperti anggota genera Salmonella dan Shigella

b. Sesekali patogen seperti anggota genera Proteus dan Klabsiella

c. Yang normal flora usus seperti  Escherichia anggota marga dan Enterobacter 

yangmerupakan penduduk saprophytic dari saluran usus.

Diferensiasi kelompok utama Enterobacteriaceae dapat dicapai atas dasar sifatbiokimia

dan reaksi enzimatik di hadapan substrat tertentu. Seri tes IMViC, indol,metil-merah, Voges-

Preskauer, dan pemanfaatan sitrat dapat digunakan untuk identifikasi ini.

- Indol Tryptophan merupakan asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi dengan

cara kegiatan enzimatik beberapa bakteri. Konversi triptofan menjadiproduk metabolik

dimediasi oleh enzim tryptophanase. Media ini biasanya digunakan dalam idetifikasi yang

cepat. Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan bakteri mendegradasi asam

amino triptofan secara enzimatik. Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk

lapisan (cincin)berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini

tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahuidengan

menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang

lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh

mikroorganisme akibat penguraian protein.

- MR-VP 

1. Uji MR

Perbenihan ini digunakan untuk mendeteksi bakteri yang memilikikemampuan untuk

mengoksidasi glukosa menghasilkan produk asam berkonsentrasi tinggi yang stabil sehingga
 menyebabkan pH media turun hingga dibawah 4,4 yang ditandai dengan hasil positif,

terjadi perubahan warnamenjadi merah setelah ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri

ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang

terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran padamedia akan menurunkan pH

sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila metabolis ditambahkan pada biakan tersebut

dengan pH serendah itu maka metabolis tersebut menjadi merah. Hal ini menandakan

bahwa bakteri ini peragi asam campuran. 

2. Uji VP

Voges-Proskauer menentukan kemampuan beberapa organisme untuk menghasilkan

produk akhir non asam atau netral seperti acetyl methyl carbinol,dari metabol-asam yang

dihasilkan pada metabolism glukosa pada Ferermentas iglukosa, yang merupakan

karakteristik dari Enterobacter. aerogenes. Uji VP dengan hasil negatif, karena tidak

terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya

hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil karbinol (asetolin) (Anonim2, 2008).

- Perbenihan agar Simmon’s Citrate 

Perbenihan ini digunakan untuk melihat kemampuan organisme enteric berdasarkan

kemampuan memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon. Perbenihan Simmon’s Citrate ini

mengandung indicator biru bromtimol yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif dan

tetap hijau jika reaksi negative. 

3. Uji katalase

Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui

apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Dan

digunakan unrtuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hydrogen

peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen manghasilkan
 hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat

tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase

yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen dengan reaksi sebagai berikut :

2H2O 2H2O + O2 (Volk dan Wheeler, 1993).

Enzim merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengannyata

kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangatlambat. Enzim tidak

dapat mengubah titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya,enzim juga tidak akan habis dipakai

atau diubah secara permanen oleh reaksi-reaksiini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi

untuk membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu

reaksi. Suatu enzim adalahsuatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim.

Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau

industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian

laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelaskatalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh

bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur

enzim tersebut.

Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor nonprotein, yang dapat berupasenyawa

organik maupun anorganik (Lehninger, 1995). Hidrolisis Gelatin terdapatEnzim-enzim yang

menguraikan golongan potein disebut protenase/protease, keduanama ini dianggap sinonim.

Contoh pada hidrolisis gelatin dimana protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada

jaringan penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis

enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila

berada di dalam refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan tetap

bersifat cair (Hadioetomo, 1993).

4. Uji oksidase
 Uji oksidase ditujukan untuk membedakan bakteri nerdasarkan aktivitas sitokromoksidase.

Enzim-enzim oksidase memainkan peran yang vital dalam pelaksanaansystem transport electron

pada respirasi aerob. Sotokrom oksidase mengkatalisisoksidase dari sitokrom yang tereduksi oleh

oksigen molecular (O2), menghasilkanpembentukan H2O atau H2O2. Bakteri-bakteri aerob,

sebagaimana juga beberapabakteri anaerob fakultatif dan mikroaerofil, memiliki aktivitas oksidase.

Uji oksidase merupakan alat untuk membedakan antara anggota-anggota dalam genus Neisseria

dan Pseudomonas, yang merupakan oksidase positif, dan Enterobacteriaceae yang merupakan

oksidase negative.

Kemampuan bakteri untuk menghasilkan sitokrom oksidase dapat ditunjukkan dengan

penambahan pereaksi uji, p-aminodimetilanilin oksalat, terhadap koloni-koloniyang ditumbuhkan

pada suatu media agar lempeng. Pereaksi merah muda cerah ini berperan sebagai substrat

buatan, memberikan electron dan karenanya akan teroksidasi menjadi senyawa berwarna kehitaman dan

oksigen bebas. Setelah penambahan pereaksi uji, terjadinya warna merah muda, kemudian merah

marun, dan pada akhirnya warna kehitaman pada permukaan koloni menandakan dihasilkannya

sitokrom oksidase dan menunjukkan hasil positif. Tidak terjadinya perubahan warna,atau warna

merah muda cerah pada koloni, menandakan tidak adanya aktivitas oksidase, menunjukkan hasil

uji yang negative.

5. Perbenihan TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

Perbenihan TSIA digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalammemfermentasi

gula-gula membentuk asam saja,basa saja, asm dan basa, dengandisertai/tidak gula-gula

pembentukan gas. Uji ini dapat membedakan lebih jauh kelompok-kelompok atau genus-genus

dalam Enterobacteriaceae di mana seluruhnya merupakan basil gram negatif yang dapat

memfermentasi glukosa dengan memproduksi asam. Pembedaan ini didasarkan pada pola

fermentasi karbohidrat dan produksi gas H2S yang berbeda untuk setiap organisme. Perbenihan
 TSIA mengandung tiga macam gula-gula (Triple Sugar) yaitu laktosa 1%,sukrosa 1% danglukosa

0,1%,indikator asam-basa merah fenol,dan natrium tiosulfat serta fero sulfat. Adanya pembentukan

asam akan merubah warna perbenihan yang semula berwarna jingga kemerahan menjadi kuning,

sedangkan jika basa yang terbentuk maka perbenihan akan berubah menjadi merah. Adanya

pembentukan gas ditandai dengan adanya gelembung/pecahnya agar di daerah tususkan,dan jika gas yang

dihasilkana dalah H2S,maka akan terbentuk endapan hitam fero sulfida (FeS) di daerah tusukan.

6. Perbenihan LIA (Lysine Iron Agar)

Perbenihan LIA digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme dalam

mendekarboksilasi lisin membentuk amin kadaverin yang bersifat basa sehingga merubah warna

perbenihan yang mengandung indikator bromkresol ungu dari coklat menjadi ungu (reaksi positif).

Reaksi ini dapat disertai atau tidak disertai dengan pembentukan gas (adanya gelembung / pecahnya agar

di daerah tusukan atau adanya endapan hitam FeS).