KRIOPRESERVASI

(SLOW FREEZING)
NURCHOLIDAH SOLIHATI
TAHAPAN KRIOPRESERVASI LAMBAT PADA SEMEN
TERNAK
• PENAMPUNGAN SEMEN
• EVALUASI MAKROSKOPIS DAN MIKROSKOPIS
• PENGENCERAN
• FILLING (PENGISIAN KE STRAW) AND SEALING
• EQUILIBRASI
• FRE FREEZING
• FREEZING
• THAWING (APABILA AKAN DIINSEMINASIKAN)
PENGENCERAN

• HAL-HAL YANG HARUS DIPERHATIKAN DALAM PENGENCERAN SEMEN :

• 1. PENGENCER HARUS SESUAI DENGAN KONDISI FISIOLOGIS SPERMA, TIDAK TOKSIK
• 2. MUDAH DIDAPAT DAN MURAH
• 3. DILAKUKAN PENAMBAHAN KUNING TELUR SEBANYAK 20% DARI VOLUME TOTAL
• 4.VOLUME PENGENCER HARUS SESUAI DENGAN PERHITUNGAN KONSENTRASI
TOTAT SPERMA, MOTILITAS DAN KANDUNGAN SPERMA MOTIL YANG DIBUTUHKAN.
• 5. PENAMBAHAN GLISEROL (GLISEROLISASI) DILAKUKAN PADA PENGENCER HARUS
SESUAI KADAR YANG DIBUTUHKAN. SETIAP JENIS SEMEN TERNAK MUNGKIN BISA
BERBEDA, CONTOH PADA SAPI 7%, DOMBA 5%.
KRIOPROTEKTAN

• KRIOPROTEKTAN MERUPAKAN SUATU ZAT YANG DAPAT MELINDUNGI SPERMA DARI

CEKAMAN DINGIN (COLD SHOCK)
• JENIS KRIOPROTEKTAN BERMACAM-MACAM, NAMUN YANG PALING UMUM
DIGUNAKAN ADALAH GLISEROL.
• PENAMBAHAN GLISEROL DAPAT DILAKUKAN SECARA BERTAHAP (GLISEROL
DITAMBAHKAN KEPADA SETENGAH BAGIAN PENGENCER, KEMUDIAN LARUTAN
PENGENCER+GLISEROL TERSEBUT DITAMBAHKAN KEPADA LARUTAN SEMEN
SECARA BERTAHAP)
• ATAU DILAKUKAN SECARA LANGSUNG DITAMBAHKAN KEPADA PENGENCER
SECARA KESELURUHAN
EQUILIBRASI

• EQUILIBRASI ADALAH SUATU PROSES UNTUK MENGADAPTASIKAN SPERMA

DENGAN PENGENCER YANG DIGUNAKAN.
• EQUILIBRASI DILAKUKAN SEKITAR 2 – 4 JAM PADA SUHU 5 DERAJAT CELCIUS.
PERBEDAAN SUHU PADA KRIOPRESERVASI LAMBAT

• KRIOPRESERVASI LAMBAT MENGHARUSKAN SPERMA TERPAPAR PADA SUHU

YANG BERBEDA-BEDA.
• PADA SAAT PENGENCERAN DAPAT DILAKUKAN PADA SUHU RUANG.
• PADA SAAT FILLING AND SEALING DAN EQUILIBRASI DILAKUKAN DI COOL TOP
PADA SUHU 5 DERAJAT CELCIUS
• PADA SAAT FRE FREEZING DILAKUKAN PADA SUHU – 80 DERAJAT CELCIUS.
PADA TAHAP INI MERUPAKAN TAHAP KRITIS BAGI SPERMA DAN BANYAK
MENYEBABKAN KEMATIAN.
• PADA TAHAP FREEZING, DILAKUKAN PADA SUHU -196 DERAJAT CELCIUS.
 SEXING SPERMA pada
HEWAN TERNAK

• Dr. Nurcholidah Solihati, M.Si.

Laboratorium Reproduksi dan Inseminasi

Buatan
Fakultas Peternakan Universitas Padjadjaran
 PENDAHULUAN

 Betina : Produksi susu

 Jantan ; Produksi daging

 Stok Breeding
Tujuan Sexing Sperma pada
Ternak
Meningkatkan peluang kelahiran
anak dengan jenis kelamin yang
sesuai dengan harapan dan
tujuan pemeliharaan ternak.
Meningkatkan efisiensi usaha
PRINSIP DASAR
Kromosom –X : Keturunan Betina
Kromosom –Y : Keturunan jantan

Sperma dengan kromosom X mengandung DNA 4% lebih

banyak daripada sperma yang mengandung kromosom Y
Pada berbagai macam spesies, jumlah sperma X lebih
banyak 3-4,5 % dibanding sperma Y (Johnson et al., 1987).

Sperma yang mengandung Kromosom X (sperma X) lebih

besar dibanding sperma yang mengandung kromosom Y
(sperma Y), namun sperma X memiliki pergerakan lebih
lambat dibanding sperma Y.
Perbandingan kandungan DNA
antara sperma X dan sperma Y
 Metode Sexing Sperma

 Berdasarkan perbedan Fisik

 HY antigen

 Albumin Gradient dan Percoll gradient

 Pemisahan secara elektroforesis

 Flow cytometri
1. Perbedaan Fisik

 Menggunakan gradient Albumin untuk memisahkan

sperma X dan Sperma Y
 Sperma-Y mempunyai ukuran yang lebih kecil dan
lebih mudah untuk berenang menuju lapisan bawah
dari gradient.
 Perbedaan Volume pada kepala sperma
 pada lapisan bottom dari kolom mengandung
banyak sperma-Y
Morphometri Kepala
Sperma
 2. Perbedaan Permukaan
Antigen
Menggunakan H-Y antigen
sebagai marker
Sex-spesific protein (SSPs)
Sperma non-SSPs akan ditolak
Antibodi terhadap SSPs
digunakan untuk mengidentifikasi
sperma yang diinginkan
 Elektroforesis

Berdasarkan perbedaan potensial listrik pada permukaan sperma

Sperma-X berbeda dengan sperma-Y berdasarkan pada
permukaan
 Flow cytometri
Johnson et al, 1989 : Laporan pertama bahwa kelinci lahir dari sperma hasil
sexing

Sekarang : Ribuan keturunan telah dihasilkan dari sperma hasil sexing :

kelinci, babi, domba, kuda, keledaisapi, kambing, kucing, anjing, manusia
 Aplikasi Sexing
Sperma

 Breeding dara untuk memperoleh indukan

betina.
 Untuk memanfaatkan pejantan yang paling
unggul dari suatu populasi -- memperoleh
pejantan yang unggul secara genetik
 Sperma hasil sexing dapat dibekukan untuk
digunakan pada IVF dan produksi embrio
Konservasi hewan langka yang hampir punah
Kendala Sexing Sperma

 Biaya yang dibutuhkan cukup tinggi

 Peralatan mahal
 Biaya maintenance tinggi
 Skill yang terlatih
 Hampir setengah dari sampel sperms : unsexable
 Efesiensi sorting cukup rendah
 Pregnancy rate rendah
Strategi Sexing Sperma

Menggunakan pejantan yang mempunyai fertilitas

tinggi
Menggunakan sperma hasil sexing pada kondisi
manajemen yang baik (nutrisi, kontrol penyakit,
deteksi estrus, penanganan semen dan inseminasi)
INTRODUKSI BIOTEKNOLOGI REPRODUKSI
TERNAK
2021
 KRIOPRESERVASI

Kriopreservasi adalah suatu cara untuk

menyimpan sampel yang berasal dari hewan,
tanaman dan sumber genetik lain dalam bentuk
beku untuk dimanfaatkan di masa yang akan
datang.
Kerusakan pada sampel disebabkan oleh
 perubahan temperature,
 pembentukan kristal es
 perubahan osmotik
 toksisitas bahan kimia
SAMPEL YANG TELAH BERHASIL DI
KRIOPRESERVASI
Bagaimana
Metode Kriopreservasi

slow cooling

vitrifikasi
 Prinsip Slow Cooling
1. Konsentrasi Krioprotektan rendah
2. Menggunakan kecepatan pembekuan yang lambat
3. Proses dehidrasi lambat

• In 1937, Luyet wrote that “crystallization is incompatible

with living systems and should be avoided whenever
possible”

Luyet. Biodynamica 1937; 1: 1–14

“Vitrifikasi adalah proses pemadatan larutan yang
terjadi karena meningkatnya viskositas selama
pembekuan sehingga larutan tersebut seolah-olah
menjadi kaca”

Fahy, 1984

Fahy et al. Cryobiology 1984; 21: 407–426

Prinsip Vitrifikasi
1. Konsentrasi Krioprotektan Tinggi
2. Kecepatan pembekuan yang digunakan tinggi
3. Langsung dipaparkan ke dalam N2 cair
4. Memerlukan carrier
 Vitrifikasi vs slow cooling
37°C V I T R I F I KASI SLOW
COOLING
H2O (equilbrasi)
Dehidrasi total
-5 Suhu ruang H2O
Derajat C

-35
dehidrasi
dehidrasi
-80

-196
Simpan Simpan Simpan

10 20 30 Derajat C(min)
Slow cooling Vitrification
(Whittingham et al., Science
1972,
(Rall and Fahy 1985)
Willmut et al., Life Science
1972)

2 sec.

- 0.3°C/min

- 50.000°C/min
 Vitreous, glassy state

Ice crystallization

EG+DMSO+0.4M sucrose
DPBS
 Peralatan Slow cooling vs Vitrifikasi

Slow cooling

Vitrifikasi
TERIMAKASIH
 Menghasilkan salinan identik dari organisme, sel,
atau mereplikasi urutan asam nukleat dari
organisme

Kloning reproduktif menggunakan prosedur kloning

untuk menghasilkan embrio klon yang ditanamkan di
uterus induk dengan maksud untuk menciptakan anak
hidup yang sepenuhnya terbentuk - klon.

Kloning terapeutik menggunakan prosedur kloning

untuk menghasilkan embrio klon, tetapi alih-alih
ditanamkan di dalam rahim dan dibawa ke istilah itu
digunakan untuk menghasilkan sel induk.
1. Kloning untuk tujuan medis
• Mengkloning model penyakit hewan
• Mengkloning sel induk untuk penelitian

2. Menghidupkan kembali Spesies Langka atau Punah

Nuclear replacement
Materi genetik (inti dari sel embrionik, janin, atau
dewasa) dikeluarkan dan ditempatkan ke dalam telur
atau embrio yang tidak dibuahi, yang intinya telah
dihilangkan. Dalam hal ini gen inti tetap sama tetapi
DNA mitokondria akan berbeda. Ini memiliki potensi
untuk membuat klon organisme dewasa serta banyak
klon sekaligus.
Embryo splitting-
Pembelahan embrio tunggal secara artifisial pada tahap
perkembangan yang sangat awal. Dalam proses alami ini akan
menciptakan anak kembar. Namun, karena ini dilakukan pada
tahap awal dan biasanya ada kurang dari delapan sel, Anda hanya
dapat membuat beberapa klon. Baik gen nuklir maupun gen
mitokondria akan identik.
1. Nuclear replacement-

Dolly
---the world's most famous
sheep
Gender: Female
Breed: Mammal
Birthday: 1996 7/5/
Homeplace: Scotland
Father: No father
Mother: Three mothers
Family: 5 Kids
Death: 2003/2/14
The challenge
---how was dolly created?

Saat Anda melukai diri sendiri, kulit baru tumbuh di

atas luka karena sel-sel kulit 'diprogram' untuk
menghasilkan kulit baru. Ini sangat penting saat Anda
sedang menyembuhkan atau tumbuh dan bahkan
berarti kita dapat menumbuhkan beberapa sel -
seperti kulit manusia - di laboratorium.
Berbeda dengan ini, sel telur yang baru dibuahi
mengandung sel 'induk', yang mampu menjadi salah
satu dari ratusan jenis sel yang berbeda dalam tubuh -
kulit, otot, sel otak dll.
Tantangan yang dihadapi oleh pencipta Dolly adalah
untuk mengambil sel dewasa yang diprogram
sepenuhnya dan mengembalikannya ke keadaan ini -
de-program itu.
from Time Magazine, March 10, 1997
 Problems with Cloning
• Klon bukan salinan persis
• Proses kloning tidak aman·
• Keturunan hasil kloning sering kali
menderita cacat lahir
• Klon yang bertahan hingga dewasa
tampaknya menua lebih cepat dari
biasanya
Penelitian dapat memberikan wawasan tentang
asal mula kanker dan proses seluler lainnya
seperti penuaan.
Teknik dapat digunakan dengan sel saraf yang
tidak bereproduksi secara teratur. Mungkin bisa
membantu penderita Alzheimer atau Parkinson.
Nuclear replacement dapat membantu mereka
yang memiliki penyakit yang diturunkan dari
mitokondria. Nukleus dikeluarkan dari sel yang
sakit dan ditempatkan menjadi satu dengan
mitokondria yang sehat.
Chimera
 Introduction

Kata Chimera yang berarti dalam bahasa Yunani adalah hewan

fiksi berbentuk kepala singa dan tubuhnya kambing dan ekor
monster, tetapi pada saat ini merupakan percampuran sel dari
lebih dari satu embrio pada tahap awal perkembangan embrio.
Suatu metode yang digunakan untuk menghasilkan embrio atau
organisme yang terdiri dari lebih dari orang tua dan disebut
istilah dalam genetika:-Hewan genetik atau hewan Tetra Parental
atau Allophonic.

A sculpture of a chimera on the Piazetta in

Venice
Chimera production methods

Aggregation of embryos

Blastocyst injection
 Aggregation of embryos

Merupakan integrasi atau pencampuran dua embrio

pada tahap pembelahan tertentu dalam fase yang sama dan
pertama kali digunakan oleh Tarkowski pada tahun 1961 dan
Mintz pada tahun 1962 dimana ia mencampurkan dua embrio
pada tahap 8 sel, kemudian dikultur dalam medium selama 24
jam. , kemudian terbentuk satu Blastuola dari dua embrio
dengan satu jaringan massa sel dalam (ICM), kemudian
blastuola dipindahkan ke rahim wanita lain, dan menghasilkan
keturunan campuran yang terbentuk dari strain yang berbeda
Gambar (78).
Blastula injection

Digunakan oleh Gardner pada tahun 1968 hingga 1978.

Di mana sel-sel embrio disuntikkan pada embrio lain dalam
tahap blastula. Setelah penggabungan sel-sel disuntikkan
dengan massa sel bagian dalam blastuola penerima dan
kemudian dipindahkan ke rahim wanita lain.
 Diferensiasi seksual pada embrio chimeric

Untuk menjawab pertanyaan ini, beberapa peneliti harus

menjelaskan fenomena ini selama integrasi embrio, diharapkan
Anda mendapatkan setengah dari embrio yang telah dimasukkan
membawa gen xx / xy, atau menjadi steril tetapi sangat
mengejutkan bahwa sebagian besar integrasi pada embrio tikus
yang menghasilkan keturunan tidak steril dan tidak melibatkan
hermaprodit mereka jantan atau betina (meskipun membawa xx /
xy dalam sel)
 Ada dua kemungkinan untuk menjelaskan fenomena
ini, yaitu sel kelamin yang terbentuk pada organ kelamin yang
berjenis kelamin xx/xy, nantinya akan mati dan tidak
menghasilkan sel telur xx tetapi menghasilkan sperma xy
karena sel xx ini akan memasuki meiosis dan kemudian
menghilang, oleh karena itu diharapkan dalam integrasi jenis
ini embrio memiliki proporsi jantan yang lebih besar daripada
betina. Krystof Tarkowski telah memeriksa jantan non-steril
hasil penggabungan dan benar-benar menemukan bahwa sel-
sel sumsum tulang yang mengandung kromosom xx / xy,
Tetapi Beatrice Mintz menemukan proporsi jantan dan betina
yang sama dalam embrio yang telah digabungkan.
 Integrasi embryo yang berbeda

Integrasi dua embrio dari jenis kelamin tertentu dengan

embrio dari jenis kelamin lain, seperti domba dengan kambing
atau tikus liar dengan tikus rumah.Itu pasti jaringan plasenta
yang terbentuk dari sel-sel embrio yang terdiri dari sel-sel
penerima ibu yang sama.
Terima kasih
Introducing stem cells

LAB. REPRODUKSI TERNAK & IB

FAK. PETERNAKAN UNPAD
2021
Dasar-dasar biologi stem cell
[sel induk]
A life story…
 Stem cell
Potensi SC Ukuran berapa banyak jenis sel khusus yang dapat dibuat oleh
sel induk

Pluripotent Dapat membuat semua jenis sel khusus dalam tubuh Sel
induk embrionik bersifat pluripoten

Multipotent Dapat membuat beberapa jenis sel khusus, tetapi tidak semua
jenis Sel punca jaringan bersifat multipoten
 What is a stem cell?
Stem cell Stem cell

SELF-RENEWAL DIFFERENTIATION
(copying) (specializing)

Identical stem cells Specialized cells

 Why self-renew AND differentiate?
1 stem cell

1 stem cell 4 specialized cells

Self renewal - memelihara Differentiation – menngganti sel2 rusak atau
kumpulan sel induk mati sepanjang hidup
 Where are stem cells found?

embryonic stem cells tissue stem cells

blastocyst - a very early fetus, baby and throughout life
embryo
 Types of stem cell:
1) Embryonic stem cells
 Embryonic stem (ES) cells:
Where we find them
blastocyst
cells inside
= ‘inner cell mass’ fluid with nutrients

culture in the lab

embryonic stem cells taken from to grow more cells
the inner cell mass
outer layer of cells
= ‘trophectoderm’
 Embryonic stem (ES) cells:
What they can do

differentiation
embryonic stem cells

PLURIPOTENT

all possible types of specialized cells

 Embryonic stem (ES) cells:
Challenges
skin

neurons
embryonic stem cells

blood

? liver
Types of stem cell:
2) Tissue stem cells
 Tissue stem cells:
Where we find them
surface of the eye brain

skin breast

testicles intestines (gut)

bone marrow
muscles
 Tissue stem cells:
What they can do

blood stem cell

differentiation

found in
bone marrow only specialized types of blood cell:
red blood cells, white blood cells,
MULTIPOTENT platelets
 Types of stem cell:
3)Induced pluripotent (iPS)
stem cells
 Induced pluripotent stem cells (iPS cells)
‘genetic reprogramming’
= add certain genes to the cell

cell from the body induced pluripotent stem (iPS) cell

behaves like an embryonic stem cell

differentiation

culture iPS cells in the lab

all possible types of

Advantage: no need for embryos! specialized cells
 Induced pluripotent stem cells (iPS cells)
genetic reprogramming
cell from the body (skin) pluripotent stem cell
(iPS)

differentiation
TERNAK TRANSGENIK

 INTRODUKSI BIOTEKNOLOGI
REPRODUKSI TERNAK
 2021
 TRANSGENIK HEWAN
Modifikasi Secara Disengaja Pada Genom, Sifat Genetik Dari
Organisme Tersebut Bertanggung Jawab Terhadap Karakter Yang
Diwariskan Pada Keturnannya

Inti Sel Setiap Mahluk Hidup Mengandung Gen Yang Terdiri Dari
Dna. Gen Ini Menyimpan Informasi Tentang Tubuh Dan
Fungsinya. Gen Dapat Berubah Secara Buatan, Yang Berakibat
Beberapa Karakter Hewan Berubah

CONTOH : EMBRYO DAPAT MEMPEROLEH GEN EXTRA DARI

SUMBER LAIN YANG DIINTRODUKSIKAN KE DALAM EMBRYO
TERSEBUT. TERNAK DIMANA MENGALAMI MANIPULASI DI
TINGKAT DNA DINAMAKAN TERNAK TRANSGENIK
PRODUKSI TERNAK TRANSGENIK :
1. Beberapa Tt Diproduksi Untuk Kepentingan
Ekonomi [Tt Sapi Dengan Produksi Susu
Mengandung Protein Manusia Guna Treatment
Emphysema Pada Manusia]

2. Tt Diproduksi Sebagai Model Penyakit [Hewan

Dimanipulasi Secara Genetik Untuk Menimbulkan
Gejala/Simptom Suatu Penyakit Sehingga Efek
Treatment Dapat Dipelajari .
PRODUKSI TERNAK TRANSGENIK
 METODE DASAR PRODUKSI TERNAK
TRANSGENIK :
1. DNA MICROINJECTION
2. RETROVIRUS MEDIATOR GEN TRANSFER
3. EMBRYONIC STEM CELL MEDIATOR GEN TRANSFER
Making Recombinant DNA (rDNA)
 TUJUAN PRODUKSI TERNAK TRANSGENIK

1. Meningkatkan produktivitas ternak

Gen yang mempunyai potensi untuk pembentukan ternak

transgenik :
a.Growth Hormon (GH)
b.Growth Hormon Releasing Factor (GRF).
c.Insulin like Growth Factor I (IGF I)
d.Stimulation of muscle development
2. Meningkatkan kesehatan ternak
• Meningkatkan resistensi ternak terhadap suatu penyakit
dan pembentukan antibodi.
3. Bioreaktor untuk produk-produk biomedis
1. insulin [pengobatan penyakit diabetes]
2. oksitoksin untuk merangsang kelahiran.
3. Human alpha 1 anti tripsin (haAT) susu domba tinggi konsentrasinya
4. Human Lactoferin (hLF)
5. produksi temak transgenic dengan komposis promotor αSI casein dan
sekuens hLF
6. Human Protein C [babi transgenic ]
7. Tissue Plasminogen Activator (TPA)
 DETEKSI TERNAK TRANSGENIK

Deteksi melalui 3 tahapan :

1. Deteksi konstruksi gem dengan Southern blot Analysis
2. Northtem Blot Analysis
3. Tranlation Analysis