REVIEW BAHAN AJAR KRIOPRESERVASI

INTRODUKSI BIOTEKNOLOGI REPRODUKSI TERNAK

“Vitrifikasi”

Oleh :
Kelompok 2
Sisin Dwi Shintya 200110180052
Anisah 200110180054
Dede Lusi 200110180057
Rifa Nurul Sofa 200110180071
Arya Gumilang 200110180072
Azzahra Febriana 200110180080
Dzaky Fatih Harsa 200110180085
Muhammad Farhan K. 200110180090
Thania Winandita Apsari 200110180098
Dadan Muhammad R. 200110180125
Renata Desay Bogia 200110180136
Adibah Zata Dini 200110180139

FAKULTAS PETERNAKAN
UNIVERSITAS PADJADJARAN
SUMEDANG
2021
 PEMANFAATAN METODE VITRIFIKASI UNTUK
KRIOPRESERVASI OOSIT MAMALIA

Kriopreservasi merupakan salah satu cara untuk meningkatkan nilai

tambah oosit sehingga dapat dipergunakan tanpa dibatasi oleh kendala waktu dan

jarak. Teknik kriopreservasi merupakan suatu cara untuk menyimpan oosit dalam

bentuk beku yang bertujuan untuk menyimpan, pemiliharaan, menjamin dan

mempertahankan kelangsungan hidup sel. Aplikasi kriopreservasi dalam

peternakan termasuk pelestarian strain dengan nilai genetika tinggi, rekayasa

genetik/spesies yang terancam punah hingga mengurangi biaya peternakan,

menghindari masalah genetik dan wabah penyakit (Day dan Satcey, 2007).

Kemajuan dalam bidang reproduksi sebagai teknik perbantuan meliputi teknik in

vitro, intracytoplasmic sperm injection (ICSI), cloning, dan produksi ternak

transgenic yang telah membuat peranan kriopreservasi oosit sangat penting.

Proses kriopreservasi oosit pada mamalia saat ini dilakukan du acara yang

berbeda yaitu pembekuan lambat (slow rate freezing) dan vitrifikasi (rapid

freezing). Pembekuan lambat adalah cara penyimpanan oosit dalam keaadan beku

pada suhu rendah dengan meminimalkan pembentukan kristal es intraselular,

sedangkan vitrifikasi adalah pembentukan kristal es sebagai penyebab utama

kerusakan intraselular saat pembekuan sehingga dijadikan untuk pelestarian oosit.

Vitrifikasi merupakan metode kriopreservasi yang semakin populer dalam

bidang reproduksi dan masih sulit dilakukan karena ukuran, bentuk, dan jumlah

sel oosit selain itu osmotik dan fraktur. Proses vitrifikasi secara umum diantaranya

:
 a) Dehidrasi, proses terjadinya pengeluaran cairan sitoplasma yang

digantikan oleh larutan krioprotektan (melalui difusi ke dalam sel).

b) Cooling, tahap oosit dan larutan berbeda dalam nitrogen cair membentuk

solid glass.

c) Warming, tahap terjadi perubahan kembali bentuk larutan ke cair.

d) Rehidrasi, proses masuknya kembali krioprotektan.

Kekurangan dan Manfaat Metode Vitrifikasi :

- Proses pendinginan, terjadi pada suhu di bawah -5 ̊C, mengakibatkan

perubahan struktur membrane dan mikrotubuli dari spindle mitosis/meiosis

dan kerusakan sitoplasma.

- Pembentukan kristal es, kemungkinan terjadi pada suhu -5 dan -80 ̊C

yang merupakan sumebr utama kerusakan oosit. Startegi yang baik yaitu

dengan menggunakan media krioprotektan dan pengontrolan laju

perubahan suhu yang bisa meminimalkan efek tersebut.

- Kerusakan fraktur, pada objek biologi yang relative besar contoh oosit

dapat terjadi pada suhu -50 dan -150 ̊C disebabkan adanya pengaruh

mekanik dari oosit dan medium vitrifikasi. Jenis kerusakan lebih sering

dikenal (warming).

- Pengurangan pembentukan kristal es, pengurangan dari sumber utama

kerusakan pada kriopreservasi berupa pembentukan kristal es melalui

peningkatan secara radikal baik laju pendinginan & konsentrasi

krioprotektan pada medium vitrifikasi.

- Penurunan kejutan dingin, berbeda dengan pembekuan lambat (slow

rate freezing) vitrifikasi melalui zona temperature/suhu yang berbahaya

dengan sangat cepat dan wkatu yang pendek (15-5 ̊C).

Kendala Kriopreservasi Oosit Menggunakan Vitrifikasi:

Dalam bidang kriobiologi, ukuran/massa merupakan faktor yang

menentukan. Ukuran, bentuk oosit memperlambat pembentukan distribusi setiap

substansi, temasuk permeabilitas krioprotektan yang berasal dari luar dari oosit.

Faktor lain diantaranya temperature yang relatif tinggi mendorong kerusakan

sitoplasma, membrane sel dan mikrotubul. Oosit yang belum matang (immature)

biasanya lebih sensitif terhadap kriopreservasi disbanding dengan oosit yang telah

matang (mature). Kejutan osmotic saat equilibrasi mengakibatkan penyusutan

oosit sehingga diduga merusak sitosskeleton, pecahnya membrane, terjadi lisis

dan kematian oost. Pengerasan pada zona pellucida diakibatkan pelepasan granula

kortikal yang premature dapat menyebabkan penurunan tingkat fertilisasi.

Usaha Mengurangi Kendala Dalam Kriopreservasi Oosit :

- Strategi waktu equilibrasi sebelum pendinginan.

- Pendekatan lain dalam meminimalkan efek toksik osmotik dari

krioprotektan yaitu mempertahankan pola saat terbentuknya kristal es.

- Penerapan ICSI setelah kriopreservasi.

Bebarapa Prosedur dalam Vitrifikasi Oosit :

• Reduksi konsentrasi & toksisitas larutan vitrifikasi, bahan dasar

larutan vitrifikasi etilen glikol (EG) untuk tahapan in vivo. Larutan

vitrifikasi terdiri dari 15% (v/v) EG, 15% (v/v) dimethylsufoxide (DMSO)

dan 0,5 mol/L sukrosa. EG merupakan komponen penting dalam larutan

vitrifikasi karena mempunyai karakteristik toksisitas rendah dan permease

cepat terhadap sel.

• Equilibrasi dan Vitrifikasi, larutan equilibrasi pretreatment mengandung

20-50% konsentrasi krioprotektan. Konsentrasi yang rendah dari

 krioprotektan pada larutan equilibrasi dapat mengurangi efek toksik dari

larutan vitrifikasi. Untuk vitrifikasi dari beberapa peneliti lain melakukan

pada temperature 35-37 ̊C. Temperatur/suhu lebih tinggi meningkatkan

penyerapan krioprotektan dalam membrane sel tetapi dapat meningkatkan

toksisitas. Pada suhu 37 ̊C untuk pretreatment dilakukan selama 2-3 menit

dan 20-30 detik pemaparan ke larutan vitrifikasi. Sedangkan pada suhu

kamar pretreatment dilakukan selama 5-15 menit dan 30-60 detik untuk

vitrifikasi.

• Pencairan Kembali (warming), pada cara konvensional pencairan

dilakukan dengan perendaman langsung straw ke dalam air. Penempatan

straw di udara selama 5 detik sebelum perendaman. Proses warming

dilakukan pada suhu 37 ̊C.

• Pemulihan meiotic spindle dan waktu fertilisasi, kriopreservasi oosit

pada pembekuan lambat yang diinseminasi segera setelah warming

menunjukkan penurunan rotasi, pembentukan polar body II, migrasi

pronucleus dan pembentukan meiotic spindle, inseminasi dilakukan setelah

inkubasi selama 1 jam untuk fertilisasi normal. Setelah di fertilisasi waktu

optimal untuk ICSI pada oosit manusia dari 37 - 41 jam setela pemberian

human chorionic gonadotropin (hCG).

Upaya perbaikan metode dan teknik vitrifikasi mencaukup konsep

pengurangan kosentrasi krioprotektan, peningkatan pendinginan (cooling),

warming, pemulihan meiotic spindle, dan wkatu fertilisasi. Larutan vitrifikasi

terdiri dari 15% (v/v) EG, 15% (v/v) DMSO / 1,2-prpanediol (PROH) dan 0,5

mol/L sukrosa mempunyai toksik rendah dan dapat untuk vitrifikasi dengan
volume minimum. Temperature lebih tinggi meningkatakan penyerapan

krioprotektan dalam membrane sel, tetapi dapat meningkatkan toksisitas.

 PEMBEKUAN VITRIFIKASI SEMEN KAMBING BOER DENGAN

TINGKAT GLISEROL BERBEDA

Semen segar yang telah ditampung segera dilakukan pengenceran dengan

bahan pengencer untuk mempertahankan dengan bahan pengencer untuk

mempertahankan kualitas semen selama penyimpanan. Pengenceran juga

dapat memberi perlindungan terhadap cold shock yang terjadi pada saat

pembekuan dan sebagai penyanggah untuk menjaga kestabilan pH (Mumu,

2009). Dalam proses pembekuan, semen perlu ditambahkan krioprotektan

untuk melindungi dari efek negatif pembekuan. Gliserol merupakan

krioprotektan intraseluler yang dapat berdifusi ke dalam sel-sel spermatozoa

(Susilawati, 2011). Penggunaan gliserol harus memperhatikan konsentrasi

yang tepat, agar dapat berfungsi dengan baik. Apabila konsentrasi kurang,

daya protektif gliserol tidak akan optimal, sebaliknya apabila berlebih akan

menjadi toksik bagi spermatozoa (Rizal, 2010).

Pembekuan semen adalah suatu proses penghentian sementara kegiatan

hidup dari sel tanpa mematikan fungsi sel (Mumu, 2009). Salah satu teknik

yang bisa digunakan yaitu vitrifikasi. Prinsip dari metode vitrifikasi adalah

terjadi peningkatan viskositas larutan dan membutuhkan cooling dan warming

rate yang cepat tetapi dalam batas-batas tertentu, ataupun menggunakan

medium krioprotektan yang mana akan menekan pembentukan viskositas pada

temperatur rendah (Anonimous, 2011).

Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berperan dalam

mengurangi pengaruh mematikan selama pembekuan baik berupa pengaruh

larutan maupun adanya pembentukan kristal es sehingga viabilitas sel dapat

dipertahankan. Berdasarkan sifat-sifat fisikokimia dan daya permeabilitas

membran maka krioprotektan dibagi atas dua kelompok, yaitu (i)

krioprotektan intraseluler, dapat keluar masuk membran karena memiliki berat

molekul kecil sehingga bersifat permeabel (contoh: gliserol, etilen glikol,

propanadiol), dan (ii) krioprotektan ekstraseluler, tidak dapat keluar masuk

membran karena memiliki berat molekul besar sehingga bersifat non

permeabel (contoh: protein, sukrosa, manosa, rafinosa, kuning telur, susu).

Krioprotektan yang paling banyak digunakan dalam pembekuan semen hewan

mamalia yaitu gliserol (Gazali dan Tambing, 2001).

Materi Penelitiaan

Metode penelitian yang digunakan dalam penelitian adalah dengan

menggunakan metode percobaan yang dirancang dengan Rancangan Acak

Lengkap(RAL) dan Materi penelitian yang digunakan adalah semen segar

kambing Boer dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis. Pengenceran

dilakukan dengan menambahkan gliserol 0% (P0), 7% (P1), 14% (P2), 21%

(P3). Pengamatan dilakukan setelah pengenceran, kemudian dilakukan pre-

freezing di atas nitrogen cair selama 5 menit dan dicelupkan ke dalam nitrogen

cair. Thawing dilakukan dengan menggunakan air suhu 37-380C selama 1

menit, dan diamati kualitas semen setelah thawing.

Hasil dan Pembahasan

Pemeriksaan Kualitas Semen Segar

Pemeriksaan kualitas semen segar dilakukan dengan cara melakukan

pengamatan secara makroskopis dan mikroskopis. Pengamatan makroskopis

yang dilakukan meliputi volume, warna, konsistensi, dan pH, sedangkan

pengamatan secara mikroskopis meliputi motilitas massa, motilitas individu,

konsentrasi, spermatozoa hidup, spermatozoa abnormal.

Pemeriksaan Kualitas Semen Kambing Motilitas Individu Spermatozoa

Berdasarkan hasil analisis ragam menunjukkan pada penambahan gliserol

0% (P0), 7% (P1), 14% (p2), dan 21% (P3) memberikan pengaruh yang

berbeda sangat nyata (P<0,01) terhadap motilitas individu spermatozoa setelah

pengenceran dan setelah pembekuan. Motilitas individu tertinggi terjadi pada

spermatozoa dengan penambahan 0 dan 7% gliserol dalam pengencer

Andromed. Hal ini memberikan informasi bahwa Andromed mampu menjaga

kelangsungan hidup spermatozoa selama prosessing semen beku, sebab di

dalam pengencer Andromed telah terkandung bahan-bahan yang dibutuhkan

spermatozoa selama prosessing semen beku. Andromed mengandung fruktosa,

asam sitrat, buffer, antibiotik dan gliserol, dimana semua bahan ini dibutuhkan

untuk menunjang kehidupan spermatozoa selama prosessing semen beku.

Mumu (2009) menjelaskan dengan adanya gliserol dalam pengencer, maka

efek dari kejutan dingin dapat meminimalisir kematian spermatozoa, gliserol

dapatmencegah terjadinya dehidrasi karena memiliki daya pengikat air yang

kuat. Sifat demikian mempengaruhi tekanan uap sehingga titik beku medium

akan menurun

Berdasarkan hasil penelitan maka dapat disimpulkan tidak perlu dilakukan

penambahan gliserol lagi ke dalam pengencerAndromed. Karena pengencer

Andromed sudah mengandung gliserol dan bahan lainnya (fruktosa, asam

sitrat, buffer, fosfolipid, dan antibiotik) yang mampu menjaga kelangsungan

hidup spermatozoa kambing Boer selama proses pengenceran dan pembekuan

secara vitrifikasi.
 TEKNIK DAN PROSPEK KRIOPRESERVASI PADA KONSERVASI

PLASMA NUTFAH

Plasama nutfah adalah jaringan hidup berupa biji atau bagian lainnya

seperti batang, daun, serbuk sari, atau hanya beberapa jaringan yang dapat

dikembangkan menjadi suatu tanaman. Konservasi plasma nutfah adalah hal yang

penting karena dapat meningkatkan populasi dan menekan ancaman kepunahan

terhadap keanekaragaman hayati ini. Konservasi plasma nutfah juga menjaga agar

keaslian suatu hal tetap ada, terutama pada spesies yang terancam punah dan

langka.

Konservasi plasma nutfah terbagi menjadi dua, yaitu in vivo dan in vitro.

in vivo terbagi lagi menjadi dua, yaitu in situ (pada habitat asli dan penangkaran,

seperti taman nasional) dan ex situ (seperti pada arborea, kebun raya). Sedangkan

in vitro adalah materi kriokonservasi batang, daun, serbuk sari, atau hanya

beberapa jaringan lain. Bahan yang dapat dilestarikan terbagi dalam dua cara,

yaitu:

a. Short atau medium conservation

Menggunakan metode in vitro, dengan slow growth storage. Metode ini

dapat berguna pada berbagai spesies seperti tanaman kayu, tanaman buah,

hortikultura dan tanaman tropis. Disimpan pada suhu yang tidak

membekukan.

b. Long term conservation

Stop growth conservation untuk kriopreservasi. Dapat digunakan dimana

tidak mungkin lagi untuk mempertahankan bank benih, seperti

 perbanyakan vegetative (umbi-umbian), dan benih yang tidak layak karena

rusak oleh penyakit. Disimpan pada nitrogen cair suhu -194 derajat celius.

Kriopreservasi menggunakan nitrogen cair suhu -194 derajat celcius

karena secara kimiawi tidak berdampak apa-apa pada materi biologi yang

disimpan, murah, tidak beracun, tidak mudah terbakar, dan tersedia dibanyak

tempat. Pada suhu -194 derajat celcius, semua aktivitas metabolism terhentikan,

sehingga dapat disimpan pada waktu yang tidak terbatas. Materi biologi disimpan

dalam wadah kecil, terlindung dari kontaminasi, dan tidak membutuhkan banyak

perawatan. Teknik kriopreservasi terbagi menjadi dua, yaitu:

a. Classic technique

- Freeze induced dehydration: pendinginan lambat diikuti dengan

perendaman cepat dalam nitrogen cair. Pembekuan pada suhu dibawah

titik beku air hingga -40 derajat celcius.

- Terdapat dua pertimbangan, yaitu derajat toleransi beku dan pembentukan

kristal es di dalam sel.

b. New technique

- Vitrivikasi: transisi dari air langsung dari fase cairan menjadi fase amorf

atau seperti gelas, sambil menghindari pembentukan kristal es. Lebih

cocok untuk organ kompleks yang mengandung berbagai jenis sel.

Pembekuan terbagi menjadi dua, yaitu slow dan rapid freezing. Slow

freezing mengurangi 0.1-10 C/min dari 0-100 C kemudian mentransfer ke

nitrogen cair. Lambat pendinginan memungkinkan aliran air dari jaringan ke luar.

Pembentukan es ekstraseluler bukannya pembekuan intraseluler. Rapid freezing -

300 C – 1000 C/min atau lebih. Semakin cepat pembekuan, semakin kecil kristal

es intraselularnya.
Tujuh macam teknik kriopreservasi baru:

1. Vitrifikasi: bahan tanaman diperlakukan dengan senyawa krioprotektif dan

dehidrasi dengan larutan vitrifikasi, lalu diikuti dengan pembekuan cepat,

pelelehan, dan pembuangan krioprotektan serta pemulihan kultur.

2. Enkapsulasi – dehidrasi: bahan tanaman dienkapsulasi pada kapsul alginat,

lalu ditumbuhkan pada medium yang diperkaya dengan sukrosa dan

dikeringkan secara parsial dalam laminar air flow cabinet atau gel silika

hingga kandungan air sekitar 20% dan diikuti oleh pembekuan cepat.

3. Enkapsulasi – vitrifikasi: kombinasi antara teknik vitrifikasi dan

enkapsulasidehidrasi, yaitu bahan tanaman dienkapsulasi dengan kapsul

alginat, lalu dibekukan dengan teknik vitrifikasi.

4. Desikasi: teknik yang paling sederhana, yaitu mengeringkan bahan

tanaman dalam laminar air flow cabinet, gel silika atau flash drying hingga

kandungan air 10-20%, kemudian diikuti oleh pembekuan cepat.

5. Pratumbuh: penanaman bahan tanaman ke dalam media yang mengandung

krioprotektan, lalu diikuti oleh pembekuan cepat.

6. Pratumbuh – desikasi: Menanam bahan tanaman ke dalam media yang

mengandung krioprotektan, lalu mengeringkannya dalam laminar air flow

cabinet atau gel silika dan diikuti oleh pembekuan cepat.

7. Droplet – freezing: Diawali dengan praperlakuan bahan tanaman ke dalam

media cair yang mengandung krioprotektan, lalu meletakkan pada Al-foil

yang disertai dengan droplet krioprotektan dan diikuti oleh pembekuan

cepat.

Kelebihan dan kekurangan dari kriopreservasi lama adalah peralatan

terprogram namun mahal, Teknik pembekuan pada kultur sel sulit diaplikasikan
pada unit sel yang lebih besar, berhasil pada system kultur yang tidak

terdiferensiasi dan spesies toleran suhu tinggi, dan tidak/kurang berhasil

diterapkan pada spesies tropis. Sedangkan, kelebihan dan kekurangan

kripreservatif baru adalah tidak perlu alat canggih dan prosedur lebih sederhana,

memungkinkan untuk unit sel yang besar, dan berhasil diterapkan pada spesies

dengan skala yang lebih luas dan system kultur yang lebih kompleks.

Hal yang dapat merusak sel tanaman selama pembekuan dan pelelehan

adalah eksposur pada suhu rendah, formasi kristal es, sel terdehidrasi, formasi

radikal bebas, dan saat pelelehan karena membrane tidak mampu memfasilitasi

deplasmosis.

Konservasi in vitro adalah Teknik kultur jaringan yang digunakan untuk

mengumpulkan, memelihara, dan menyimpan jaringan tanaman yang berbeda

seperti tunas apeks, stek batang, kuncup, embrio, dan lain sebagainya tergantung

jenis tanaman. Keunggulan dari konservasi in vitro adalah keanekaragaman hayati

yang mengalami kepunahan dapat dilestarikan kembali.

Factor yang mempengaruhi keberhasilan kriopreservasi adalah kecepatan

pembekuan, jenis dan konsentrasi krioprotektan, suhu akhir pembekuan, tipe dan

keadaan fisiologis bahan yang disimpan. Teknik pelestarian atau penyimpanan

secara in vitro meliputi penyimpanan jangka pendek, jangka menengah, dan

jangka panjang.