Kromatografi

Oleh: Monik Krisnawati, M.Sc., Apt.

PENDAHULUAN
 Analisis komponen penyusun bahan pangan penting, tidak
hanya mencakup makronutrien
 Analisis konvensional: lama, tenaga besar, sering tidak
akurat, tidak dapat mendeteksi pada kadar rendah seperti
ppm
 Teknik kromatografi: terus berkembang dengan akurasi
tinggi
SEJARAH

 Pertama kali digunakan untuk memisahkan zat warna

(chroma) tanaman
DEFINISI

 Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran

didasarkan atas perbedaan distribusi dari
komponen-komponen campuran tersebut diantara
dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase
gerak (cair).
 Teknik pemisahan yang dilakukan dengan
memanipulasi sifat fisik dari zat-zat penyusun
suatu campuran
 Tidak ada dua zat yang mempunyai sifat fisik yang
sama sehingga pemisahan untuk zat yang serupa
masih mungkin untuk dilakukan
SIFAT FISIK YANG
DIMANIPULASI

1. Kecenderungan zat untuk larut dalam suatu cairan

(partisi/kelarutan)
2. Kecenderungan zat untuk teradsorpsi pada butir zat
padat yang halus dengan permukaan luas (adsorben)
(adsorpsi)
3. Kecenderungan zat untuk menguap (volatilitas)
Contoh Partisi

Carrot juice
Contoh adsorpsi
Contoh pemisahan berdasarkan
volatilitas
Contoh pemisahan adsorpsi
FASE STASIONER DAN
MOBIL

 Fase dalam kromatografi

 Fase stasioner: fase diam. Dapat berupa adsorben,
cairan tipis yang dilapiskan pada penyangga padat, gel,
penukar ion seperti resin
 Fase mobil: merupakan fase bergerak. Merupakan
cairan pengelusi, gas
 Proses partisi solut dalam solven pengelusi disebut
proses elusi
 Kromatografi

Padat Pertukaran Ion Fasa Diam Gel

Gas Cair Cair Fasa Gerak Cair

Anion Kation GPC

Plat Kolom
Jenis-Jenis Kromatografi
 Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatografi
dibedakan menjadi dua golongan besar yaitu gas
chromatography dan liquid chromatography. Masing-
masing golongan dapat dibagi lagi seperti yang telah
disebutkan pada definisi di atas.
Kromatografi di dalam bentuk tempat

 Komatografi Kolom : Kromatografi kolom merupakan

teknik pemisahan di mana tempat stasioner dalam
tabung.

 Kromatografi Planar
 Kromatografi Kertas
 Kromatografi Lapisan Tipis
 Contoh Chromatography
Liquid Chromatography
digunakan untuk identifikasi pigmen
tumbuhan atau komponen lain

Thin-Layer Chromatography
Menggunakan lapisan tipis atau gelas
kaca untuk memisahkan komponen
kimia dan bahan lainnya

Gas Chromatography
Digunakan untuk menentukan komposisi kimia Paper Chromatography
zat-zat yang tidak diketahui, seperti senyawa Dapat digunakan untuk memisahkan
berbeda dalam bensin yang ditunjukkan oleh tiap- komponen-komponen tinta,
tiap puncak dalam grafik di bawah ini. pewarna, senyawa tumbuhan
(klorofil), make-up, dan banyak zat
lain
Kromatografi Kertas
fase diam → kertas serap

Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang

sesuai.

Jarak relative pada pelarut disebut sebagai nilai Rf.

Untuk setiap senyawa berlaku rumus sebagai berikut:
Rf=jarak yang ditempuh oleh senyawa
jarak yang ditempuh oleh pelarut
Kromatografi Kertas (lanjutan)
Kromatografi Kertas Dua Arah
 Digunakan dalam menyelesaikan masalah pemisahan
substansi yang memiliki nilai Rf yang sangat serupa.

 Menggunakan dua pelarut yang berbeda

Kromatografi Lapis Tipis
 Menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam
atau plastik yang keras.

 Fase diam → Jel silika (atau alumina) atau substansi

yang dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet.
 Fase gerak → pelarut atau campuran pelarut yang
sesuai.
Keuntungan KLT dibanding
Kromatografi kertas
a. Waktu lbh cepat
b. Hasil pemisahan lbh baik
c. Pemisahan kualitatif dg plat kecil (10cm) ckp dg waktu
20’-30’ .Plat < 10 cm waktu yg dibutuhkan sktr 5’.
d. Kapasitas penyerapan dari penyerap lbh baik (besar) drpd
kertas
e. Dapat memisahkan senyawa hidrofob (lipida, H.Karbon)
dimana hal tsbt sukar dikerjakan dg kr. kertas.
f. Banyak digunakan dalam bidang k.Org& an.Organik
g. Dapat digunakan reagen pendeteksi yg sifatnya reaktif
(as.Sulfat) dimana reagen tsbt kalau kena kertas akan
merusak.
Kromatografi Lapis
Tipis (lanjutan)
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian
bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran
pewarna ditempatkan pada garis itu.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan

ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi
pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu
diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis
dimana posisi bercak berada.

Menutup gelas kimia untuk meyakinkan bawah kondisi

dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut.
Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang
terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia
dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Perhitungan nilai Rf
pada Kromatografi
Perhitungan nilai Rf
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung
dengan rumus sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen

berwarna merah bergerak dari 1.7 cm
dari garis awal, sementara pelarut
berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf
untuk komponen berwarna merah
menjadi:
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
1.Menggunakan pendarflour

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis

seringkali memiliki substansi yang ditambahkan
kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran
flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV).

Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak

pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat
dengan mata. Ketika sinar UV diberikan pada
lempengan, akan timbul pendaran dari posisi
yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Analisis Sampel yang
Tidak Berwarna
2. Penunjukkan bercak secara kimia

Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak

menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia
sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang
baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino.

Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan

ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan
senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian

ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan
gelas arloji) bersama dengan kristal iodium.

Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada

kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada
lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak
kecoklatan.
SEKIAN DAN
TERIMAKASIH