MODUL 1 METODE ASEPTIS DAN STERILISASI pengujian yang sedang dilakukan, atau akan Prosedur umum yang harus

sedur umum yang harus diikuti setiap
A. TUJUAN Memahami prinsip sterilisasi dan
aplikasi metode aseptis
B. DASAR TEORI
1. Metode Aseptik
Kultur disebut murni apabila kultur ini hanya
terdiri dari satu spesies mikroba saja. Pekerjaan
di laboratorium mikrobiologi pada umumnya
melibatkan berbagai kultur murni. Jika spesies
mikroba yang lain masuk secara tidak sengaja
ke dalam kultur murni, kultur tersebut
dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi
dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur
campuran. Kemungkinan terjadinya kontaminasi
ini merupakan hal yang harus diperhatikan
karena kontaminan ini akan mempengaruhi hasil
untuk memindahkan kultur harus ditempatkan
terjadi kesalahan hasil. Oleh karena itu, untuk
mempertahankan kultur tetap murni, medium
pertumbuhan yang digunakan harus steril dan
kontaminasi harus dicegah.
Pada saat telah diperoleh kultur yang murni,
maka hal-hal yang harus diperhatikan:
1. Seluruh material yang akan berhubungan
langsung dengan mikroba harus steril.
2. Seluruh media yang digunakan untuk
menumbuhkan sel juga harus steril.
Metode yang digunakan untuk memelihara
kultur murni atau bekerja dengan kultur murni
disebut metode aseptis.
pemanasan kedua ditujukan untuk membakar
bekerja dengan kultur murni adalah:
1. Medium pertumbuhan dan tempatnya harus
steril.
2. Tempat pertumbuhan harus selalu ditutup
untuk mencegah masuknya debu yang
membawa mikroba dan aerosol. Apabila
penutup harus dibuka, harus dalam waktu yang
sesingkat mungkin, dilarang meletakkan
penutup pada sembarang tempat.
3. Peralatan (ose dan pipet) dan larutan yang
digunakan untuk pekerjaan harus steril. Apabila
tidak steril, ose atau pipet ini akan mentransfer
kontaminan pada kultur murni.
4. Ose yang telah selesai digunakan harus
disterilkan dan pipet yang telah digunakan
pada larutan disinfektan sesegera mungkin. sel-sel yang jatuh atau menempel pada mulut
tabung saat ose dimasukkan atau ditarik.
5. Area tempat bekerja juga harus dijaga agar
tidak terkontaminasi dengan kultur yang 3. Diusahakan tabung dalam kondisi terbuka
digunakan. Sebelum memulai praktikum dalam waktu yang sesingkat-singkatnya.
mikrobiologi, terlebih dahulu harus diketahui
cara memindahkan sel secara aseptis. 4. Dihindari menempatkan tutup tabung pada
permukaan area pekerjaan atau menyentuhnya.
Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah: Diusahakan agar tutup tabung tidak
bersinggungan dengan sumber kontaminan.
1. Jangan digunakan ose yang belum steril
untuk menyentuh kultur. Hal ini bertujuan untuk 5. Ose yang telah digunakan harus disterilkan
mencegah terjadinya kontaminasi. untuk mencegah kontaminasi
2. Mulut tabung harus dipanasi baik pada saat
ose dimasukkan atau saat dikeluarkan dari
tabung. Pemanasan pertama ditujukan untuk
mencegah masuknya udara luar yang membawa
partikel debu masuk ke dalam tabung, sedang

2. Sterilisasi
Sterilisasi merupakan proses destruksi atau
penghilangan mikroba yang hidup. Obyek yeng
terbebas dari kehidupan mikroba disebut steril.
Sterilisasi merupakan salah satu cara untuk
mengontrol mikroba, sedang cara yang lain
adalah dengan menghambat pertumbuhan
mikroba. Namun sterilisasi berbeda dengan cara
yang kedua, dalam hal, bahwa pada sterilisasi
seluruh mikroba yang ada dimatikan atau
dihilangkan dan obyek menjadi steril. Sterilisasi
adalah hal yang penting dalam melakukan
aktivitas laboratorium terutama yang
melibatkan mikroba. Karena pada umumnya
percobaan dilakukan menggunakan kultur
murni. Bekerja dengan kultur murni memerlukan
beberapa persyaratan, yaitu media nutrien
serta tempat untuk pertumbuhan harus steril,
demikian pula segala peralatan yang terkait.
Seandainya sterilisasi tidak dikerjakan, mikroba
kontaminan akan tumbuh dan hasil yang
seharusnya diperoleh dari percobaan
menggunakan kultur murni akan menyimpang.
Metode yang umum digunakan untuk
mengontrol pertumbuhan mikroorganisme yang
tidak diinginkan adalah dengan melibatkan
agen kimia dan fisika. Kedua agen tersebut
dapat mempengaruhi struktur dan fungsi
mikroba. Bagian sel dari mikroba yang dapat
rusak dan mengakibatkan malfungsi
diantaranya adalah dinding sel, membrane sel,
sitoplasma, enzim, dan asam nukleat. Kondisi
dimana mikroba dapat mati secara langsung
akibat perlakuan tersebut disebut efek
mikrobisidal. Sedangkan efek mikrobisatik
adalah kondisi dimana kapasitas reproduktif sel
dihambat dan jumlah populasi mikroba diijaga
konstan.
Metode sterilisasi dipilih berdasarkan bahan
atau material yang akan digunakan, jenis
mikroba yang terlibat, dan tujuan dari
sterilisasi itu sendiri.
Berikut adalah beberapa jenis metode sterilisasi
yang biasa 6 digunakan untuk mengontrol
pertumubuhan mikroba yang tidak diinginkan.
Sterilisasi dengan panas
Api langsung (direct flame). Cara yang paling
sederhana untuk sterilisasi panas adalah
dengan api langsung, yaitu dengan membakar
obyek yang akan disterilkan pada nyala api.
Cara ini dapat mencegah adanya kontaminasi
mikroba dari udara pada saat pemindahan
kultur karena panas dan gas yang ditimbulkan
oleh api Bunsen dapat membunuh mikroba pada
permukaan alat sehingga tidak bisa masuk ke
dalam alat dan mencegah kontaminasi. Nyala
api dengan suhu tinggi ini akan membunuh
seluruh mikroba yang ada pada obyek. Metode
api langsung ini biasanya digunakan untuk
sterilisasi ose, forceps, mulut tabung reaksi saat
memindahkan kultur secara aseptis. Metode api
langsung biasanya dikombinasikan dengan
penggunaan cairan alkohol 70% sebagai larutan
pembilas.
Panas kering (oven udara kering). Panas kering
ini biasanya digunakan untuk sterilisasi pipet,
tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas piala dan
instrumen kedokteran (untuk operasi). Suhu
yang digunakan untuk sterilisasi panas kering
adalah 160 OC selama 90 menit sampai 3 jam.
Obyek yang akan disterilkan ditempatkan pada
oven udara panas dan dibakar sampai seluruh
mikroba terbunuh. Panas kering dapat
membunuh mikroba karena terjadi oksidasi
struktur sel dan makromolekul. Panas kering
tidak dapat digunakan untuk sterilisasi cairan
(seperti media cair) karena kebanyakan cairan
akan mendidih pada suhu 100 o C, dan selama
mendidih temperaturnya tidak akan naik.
Pendidihan belum tentu dapat mensterilkan
obyek, karena bebrapa spora bakteri tetap
bertahan dengan pendidihan selama berjam-
jam pada suhu 100o C.
Autoklaf (uap panas). Proses sterilisasi ini
menggunakan uap panas dan tekanan sehingga
obyek yang disterilkan dapat mencapai suhu
121 o C, selama 15 menit. Sterilisasi cara ini
sering digunakan karena dapat membunuh
beberapa spora mikroba. Berbagai jenis media
yang digunakan untuk kegiatan di laboratorium
mikrobiologi disterilkan dengan cara ini.

Sterilisasi tanpa panas
Filtrasi. Untuk liquid yang sensitif dengan
panas, misalnya vitamin, antibiotik, metoda
sterilisasi yang digunakan adalah filtrasi. Pada
cara ini mikroba tidak dimatikan tetapi
dihilangkan. Liquid yang akan disterilkan
dilewatkan pada filter yang pori-porinya
sangat kecil sehingga tidak bisa lewat. Filter
yang digunakan untuk sterilisasi ada beberapa
macam, tetapi yang paling sering digunakan
adalah filter membran. Filter membran adalah
material yang sangat tipis terbuat dari selulosa
asetat atau polikarbonat dengan ukuran
pori pori yang bervariasi. Sebelum sterilisasi,
filter membran dan peralatannya disterilkan
terlebih dahulu (biasanya menggunakan
autoklaf). Ukuran pori-pori filter yang biasanya
digunakan adalah 0,4 µm.
b. Sterilisasi Kimia. Sterilisasi kimia adalah
metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi
objek padat yang sensitif terhadap panas. Pada
metode ini, mikroba dibunuh menggunakan
bahan kimia yang toksik. Sedang mekanisme
kematiannya sangat tergantung dari bahan
kimia yang digunakan. Bahan kimia yang
digunakan untuk sterilisasi harus dapat
membunuh seluruh mikroba, oleh karena itu
harus dibedakan dengan disinfektan ataupun
antiseptik, yang biasanya digunakan untuk
mengontrol mikroba tetapi tidak mensterilkan.
Bahan kimia yang sering digunakan adalah
etilen oksida (EtO). Etilen oksida biasanya
digunakan untuk sterilisasi 8 berbagai material
yang sensitif terhadap panas, misalnya cawan
Petri, pipet, alat suntik yang terbiuat dari
plastik. Bahan kimia lain yang umum digunakan
adalah senyawa fenolik, cresol, heksakloropen,
rekorsinol, senyawa klorin, senyawa iodin, dan
sebagainya. Efisiensi dari bahan kimia ini
didasarkan pada konsentrasi bahan, lama
paparan, tipe mikroba yang akan dimatikan,
dan kondisi lingkungan dari bahan kimia
tersebut.
Sterilisasi dengan sinar radiasi. Radiasi pengion
merupakan alternatif lain untuk sterilisasi,
khususnya untuk bahan yang peka terhadap
panas. Hal ini disebabkan karena kenaikan suhu
yang terjadi akibat perlakuan iradiasi hanya 4
o C. Selain itu radiasi pengion memiliki daya
tembus yang besar. Radiasi pengion ini mampu
mengionkan molekul yang diterpanya. Molekul
air bila kena radiasi pengion ini akan
mengalami radiolisis, dan dihasilkan
radikal radikal bebas, diantaranya radikal
bebas hidrogen dan radikal bebas hidroksil.
Senyawa radikal bebas ini sifatnya sangat
reaktif dan sangat mudah bereaksi satu sama
lainnya dan juga dapat mempengaruhi dan
merusak molekul di dalam sel, termasuk enzim
dan asam nukleat. Yang perlu diperhatikan
dalam menggunakan sinar radiasi untuk tujuan
sterilisasi ini adalah dosis yang digunakan
harus tepat. Jika tidak, akibatnya sangat
berbahaya, karena akan menyebabkan
terjadinya mutasi atau resistensi terhadap
radiasi. Kelemahan sterilisasi dengan radiasi ini
adalah biaya mahal, dan butuh kehati-hatian
untuk mengoperasikannya. Yang termasuk
radiasi pengion adalah sinar gamma, sinar
elektron, dan x-ray. Sinar ultraviolet (uv)
merupakan radiasi non-pengion dan hanya
efektif untuk sterilisasi permukaan dan objek
transparan, seperti gelas. 9
C. ALAT DAN BAHAN
Alat : Autoklaf manual dan listrik, glass ware
Bahan : Aquades, Kapas, Kertas payung, karet,
plastik PE, spirtus

D. PROSEDUR KERJA
1. Persiapan Glassware yang Akan Disterilisasi
a. Siapkan alat gelas (tabung reaksi, pipet,
erlenmeyer, cawan petri) yang sudah dicuci
bersih dan dikeringkan.
b. Buatlah penutup dari kapas steril untuk
tabung reaksi dan erlenmeyer. Pastikan kapas
penutup tergulung sempurna dan tidak mudah
rusak saat penutup dibuka. Kapas penutup
harus bisa menutup alat gelas hingga tidak ada
udara yang bisa masuk. Bungkus kapas penutup
dengan kertas kedap air.
c. Bungkus pipet volume dengan plastik PE dan
ikat kedua ujungnya dengan karet.
d. Bungkus cawan petri dengan kertas kedap air
dan pastikan posisinya dibalik agar tidak ada
uap air yang masuk selama sterilisasi.
e. Bungkus semua alat dengan plastik PE dan
pastikan tidak ada udara yang ada dalam
platik kemudian ikatlah platik dengan karet dan
masukkan ke dalam keranjang autokalf.
2. Cara Penggunaan Autoklaf Listrik
a. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu
banyaknya aquades dalam autoklaf. Jika air
kurang dari batas yang ditentukan, maka
dapatditambah air sampai batas tersebut.
Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari
terbentuknya kerak dan karat.
b. Masukkan peralatan yang tidak terbuat dari
plastik, dan bahan. Jika mensterilisasi botol
bertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.
c. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan
baut pengaman dengan mengencangkan baut
bersebrangan, agar tidak ada uap yang keluar
dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan
ditutup terlebih dahulu supaya udara dalam
autoklaf keluar, karena yang digunakan adalah
uap air.
d. Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan
waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC.
e. Tunggu sampai air mendidih sehingga uapnya
memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak
keluar dari klep pengaman. Kemudian klep
pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu
sampai skala menunjukkan suhu angka 121,
buka tutup klep sehingga jarum skala berada
didaerah angka 121 selama 15 menit.
f. Matikan jika alarm tanda selesai berbunyi,
maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di
lingkungan (jarum pada presure gauge
menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep
pengaman dibuka agar sisa uap air keluar.
Setelah itu sekrup dibuka dengan bersebrangan,
lalu tutup dibuka perlahan dari belakang. Dan
keluarkan alatnya

MODUL 2 MEDIA PERTUMBUHAN MIKROBA pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroba yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% C. BAHAN DAN ALAT b. Tuang 1000 mL aquades ke gelas Beaker
menjadi kultur murni. Media harus mengandung sehingga menjadi sedikit kenyal, media cair yaitu selanjutnya masukkan irisan kentang dan rebus
A. TUJUAN Mahasiswa mampu membuat media unsur-unsur yang diperlukan untuk metabolisme media yang tidak mengandung agar, contohnya Alat : Kentang (potato), dekstrosa, agar-agar, sampai lunak.
pertumbuhan mikroba dengan membuat media sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P; adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). nutrient agar, aquades
Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dekstrosa, unsur mikro seperti Fe, Mg, juga mengandung Media tumbuh mikroba juga dibedakan menjadi c. Saring ekstrak menggunakan kertas
Nutrient Agar (NA). sumber karbon, protein dan vitamin. Sumber media sintesis yaitu media yang komposisinya Bahan : Gelas kimia, labu erlenmeyer, timbangan saring/saringan dan tampung menggunakan
karbon dan energi yang diperoleh antara lain diketahui jenis dan takarannya secara pasti, analitik, autoklaf gelas Beaker.
B. PENDAHULUAN dari karbohidrat, lemak, protein dan asam misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. Media
organik. Sumber nitrogen mencakup asam amino, semi sintesis yaitu media yang sebagian D. PROSEDUR KERJA d. Tambahkan aquades sampai volume mencapai
Media pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan protein atau senyawa bernitrogen lain, vitamin. komposisinya diketahui secara pasti, misanya 1000 mL kembali.
yang mengandung komponen atau nutrisi yang Selain itu, media tumbuh mikroba juga dibedakan PDA. Media 13 non sintesis yaitu media 1. Media Potato Dekstrosa Agar (PDA)
diperlukan mikroba untuk pertumbuhannya. berdasar sifat fisik yaitu media padat, setengah komposisinya tidak dapat diketahui secara pasti
Mikroba memanfaatkan nutrisi media berupa padat dan cair. Media padat yaitu media yang dan biasanya langsung diekstrak dari bahan a. Kupas kentang dan iris menjadi bentuk dadu
molekul-molekul kecil yang dirakit untuk mengandung agar 15% sehingga setelah dingin dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar. kecil-kecil dan timbang sebanyak 250 g.
menyusun komponen sel. Dengan media media menjadi padat, media setengah padat

e. Masukkan 15 g agar-agar, aduk dan larutkan
sampai homogen.
f. Tambahkan 20 g dekstrosa, aduk dan larutkan
sampai homogen lagi.
g. Atur pHnya menjadi 6-7 dengan
menambahkan larutan HCl 1 N atau NaOH 1 N
dan ukur dengan pH indikator universal.
h. Tuang media ke Erlenmeyer dan sterilkan
menggunakan autoclave dengan cara kerja
seperti diuraikan pada materi I.
2. Media Nutrient Agar (NA)
a. Timbang 23 g NA, larutkan dalam 1000 ml
aquades dan aduk sampai homogen.
b. Tuang ke Erlenmeyer dan atur pHnya menjadi
6–7 dengan menambahkan larutan HCl 1 N atau
NaOH 1 N dan ukur dengan pH indikator b. Tuang 1000 ml aquades selanjutnya masukkan f. Atur pHnya menjadi 6–7 dengan menambahkan
universal. irisan kentang dan rebus sampai lunak. larutan HCl 1 N atau NaOH 1 N dan ukur dengan
pH indikator universal.
c. Sterilkan media menggunakan autoclave c. Saring ekstrak menggunakan kertas
dengan cara kerja seperti diuraikan pada materi saring/saringan dan tampung menggunakan g. Tuang media ke Erlenmeyer dan sterilkan
I. gelas Beaker. menggunakan autoclave dengan cara kerja
seperti diuraikan pada materi I.
3. Media Potato Dekstrosa d. Tambahkan aquades sampai volume mencapai
1000 ml kembali. e. Tambahkan dekstrosa 20 g,
a. Kupas kentang iris menjadi bentuk dadu kecil- aduk dan homogenkan lagi.
kecil dan timbang sebanyak 250 g.
MODUL 3 ISOLASI MIKROBA dilakukan menggunakan beberapa teknik berikut: perbandingan 1:9 untuk sampel dari tabung pengenceran terakhir dengan cara yang untuk memperoleh biakan murni. Adapun cara
1. Teknik Pengenceran Bertingkat Tujuan dari pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga sama, hal yang perlu diingat bahwa tip kerjanya sebagai berikut: ambil 0,1 ml suspensi
A. TUJUAN Mahasiswa dapat memisahkan mikroba pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikropipet yang digunakan harus selalu diganti. menggunakan mikropipet kemudian teteskan di
dari biakan campuran sehingga diperoleh biakan mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi mikroba dari pengenceran sebelumnya. Cara atas permukaan media yang telah memadat.
murni dalam cairan kerjanya sebagai berikut: Sampel yang 2. Teknik Penanaman Batang L diambil 17 kemudian disemprot alkohol
mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung dan dibakar diatas bunsen beberapa saat,
B. DASAR TEORI pengenceran pertama (1/10 atau 10-1 ) secara a. Teknik penanaman dari suspensi Teknik kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa
aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan penanaman ini merupakan lajutan dari detik. Suspensi diratakan menggunakan batang L
Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri berat sampel dengan volume tabung pertama pengenceran bertingkat dan umumnya pada permukaan media supaya tetesan suspensi
menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran adalah 1:9. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan digunakan untuk isolasi bakteri. Pengambilan merata, penyebaran akan lebih efektif bila
berbagai jenis. Di dalam laboratorium, populasi dengan mengocoknya sampai homogen. suspensi dapat diambil dari pengenceran mana cawan ikut diputar (b). a. (b) Hal yang perlu
mikroba dapat diisolasi dari sumber/habitat Pengocokan dilakukan dengan cara saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi diingat bahwa batang L yang terlalu panas
seperti udara, tanah, air, makanan dan lainnya. membenturkan tabung ke telapak tangan sampai (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa menyebabkan sel mikroba mati karena panas.
Hasil isolasi umumnya merupakan biakan mikroba homogen. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan tabung pengenceran terakhir.
campuran dan perlu dimurnikan untuk mikropipet kemudian dipindahkan ke tabung 10-
memperoleh biakan murni yang terdiri dari satu Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat 2 secara aseptis kemudian dikocok dengan • Spread Plate (agar tabur ulas) Teknik ini
jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat pengenceran tergantung kepada perkiraan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai adalah teknik menanam dengan menyebarkan
fisiologi dan biokimiawinya. Isolasi dapat jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga suspensi (terutama bakteri) di permukaan media

• Pour Plate (agar tuang) Teknik ini memerlukan
agar yang belum padat (±45oC) untuk dituang
bersama suspensi (terutama bakteri) ke dalam
cawan petri kemudian dihomogenkan dan
dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan
pertumbuhan bakteri di permukaan dan di dalam
agar media sehingga terdapat sel yang tumbuh.
Adapun prosedur kerja yang dilakukan sebagai
berikut: siapkan cawan steril, suspensi yang akan
ditanam dan media padat yang masih cair
(±45oC).Teteskan 1 ml secara aseptis suspensi sel
ke dalam cawan kosong (a). (a) (b) 18 Tuangkan
media yang masih cair ke cawan kemudian putar
cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri
dan media (b), kemudian diinkubasi.
B.Teknik penanaman dengan goresan/streak streak zig-zag pada daerah 2. Cawan diputar 1. Sampel dari udara Buka cawan Petri yang pada air yang tenang, botol dapat dicelupkan
Teknik goresan ini mempunyai banyak variasi untuk memperoleh goresan yang sempurna. telah berisi media PDA dan letakkan di kebun menggunakan tali (b), jika ingin mengambil
dan tujuannya untuk memperoleh biakan murni Lakukan hal yang sama pada daerah 3. selama 5 menit. Tutup dan bungkus serta berli sampel dari air keran maka kran diaseptiskan
dari biakan campuran dan memperoleh koloni label. Inkubasikan pada suhu kamar/ruang. menggunakan api 20 bunsen beberapa saat, air
tunggal (terutama bakteri). Adapun beberapa • Goresan Kuadran (streak quadran) Cara kerja: dialirkan beberapa saat kemudian ditampung
tehnik goresan ini sebagai berikut: hampir sama dengan goresan T, namun berpola 2. Sampel dari tanah Jika mikroorganisme yang dalam botol (c). a b c
goresan yang berbeda yaitu dibagi empat. diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah,
• Goresan Sinambung Cara kerja: sentuhkan Daerah 1 merupakan goresan awal sehingga maka cara pengambilannya bisa di sekitar C. BAHAN DAN ALAT Alat : LAF, Jarum ose, Lampu
inokulum loop pada koloni dan gores secara masih mengandung banyak sel mikroba. Goresan rhizosfer (perakaran) yaitu dekat permukaan bunsen Bahan : Mikroba hasil penangkapan
kontinyu sampai setengah permukaan agar. selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari sampai ujung perakaran tanaman dengan mikroba dari udara, sampel dari tanah, sampel
Jangan pijarkan loop, lalu putar cawan 180oC goresan pertama sehingga jumlah semakin kedalaman ± 10 cm. dari air kolam; media PDA (dalam cawan petri);
lanjutkan goresan sampai habis. sedikit dan akhirnya terpisah pisah menjadi spiritus
koloni tunggal. 3. Sampel air kolam Pengambilan sampel air
• Goresan T Cara kerja: bagi cawan menjadi 3 bergantung kepada keadaan air. Jika berasal
bagian menggunakan spidol marker. Inokulasi Isolasi Mikroba Sebelum melakukan isolasi dari air sungai yang mengalir maka botol
daerah 1 dengan streak zig-zag. Panaskan jarum dilakukan pengambilan sampel dengan cara dicelupkan miring dengan bibir botol melawan
inokulan dan tunggu dingin, kemudian lanjutkan berikut: arus air (a). Bila pengambilan sampel dilakukan

D. PROSEDUR KERJA inkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar b. Timbang 1 g tanah dan ambil 1 ml air homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga g. Ratakan suspensi menggunakan batang L pada
(28oC). Pada teknik goresan, pengambilan koloni kemudian lakukan pengenceran bertingkat tabung pengenceran terakhir (10-5 ) dengan permukaan media supaya tetesan suspensi
1. Hasil Penangkapan dari Udara dilakukan 1 kali dan selanjutnya setiap akan sebagai berikut: cara yang sama. merata, penyebaran akan lebih efektif bila
menggores jarum Ose diaseptiskan hingga pijar cawan ikut diputar.
a. Siapkan media PDA dalam cawan Petri dengan pada lampu Bunsen, didinginkan sejenak dengan c. Masukkan sampel tanah ke dalam tabung e. Ambil 1 ml suspensi dari tabung 10-3 , 10-4 ,
menuang/plating 10 ml media ke cawan petri, tujuan mikroba yang menempel pada jarum Ose pengenceran pertama (1/10 atau 10-1 ) secara 10-5 , inokulasikan pada media PDA h. Inkubasikan pada suhu kamar (28oC). Amati
diamkan media memadat dan ulang dua (2) kali. tidak mati. 21 aseptis. Perbandingan berat sampel dengan menggunakan teknik spread plate (agar tabur jenis mikroba yang tumbuh dengan memberi
volume tabung pertama adalah 1:9. ulas) yaitu ambil 0,1 ml suspensi menggunakan tanda (+) pada jenis mikroba yang tumbuh dan
b. Pisahkan koloni jamur dan bakteri 2. Sampel dari Tanah dan Air Kolam mikropipet kemudian teteskan di atas permukaan isi Tabel 3.
menggunakan teknik aseptik di dalam LAF. Untuk d. Larutkan dengan mengocoknya sampai media yang telah memadat.
koloni jamur, ambil 1 loop koloni menggunakan a. Siapkan media PDA dalam cawan Petri dengan homogen. Pengocokan dilakukan dengan cara
jarum Ose, inokulasikan pada media PDA baru, menuang / plating 10 ml media ke cawan petri, membenturkan tabung ke telapak tangan sampai f. Ambil batang L kemudian disemprot alkohol
inkubasikan selama 3-5 hari pada suhu kamar diamkan media memadat dan ulang masing- homogen. Ambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan dan dibakar di atas bunsen beberapa saat,
(28oC). Untuk koloni bakteri, ambil 1 loop koloni masing dua (2) kali untuk isolasi mikroba dari mikropipet kemudian dipindahkan ke tabung 10- kemudian didinginkan dan ditunggu beberapa
menggunakan jarum Ose, inokulasikan pada tanah dan dua (2) kali untuk isolasi mikroba dari 2 secara aseptis kemudian dikocok dengan detik.
media NA menggunakan teknik goresan/streak, air. membenturkan tabung ke telapak tangan sampai

MODUL 4 PEWARNAAN GRAM Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan C. BAHAN DAN ALAT Alat : Kaca obyek, jarum 5. Teteskan 2–3 tetes iodium ke atas preparat,
jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol inokulasi, lampu spiritus, mikroskop Bahan : Kertas kemudian diamkan selama 60 detik. Cuci dengan
A. TUJUAN Mahasiswa mampu membedakan berdasarkan pewarnaan ini, yakni bakteri Gram (underdecolorization) yang tidak akan melarutkanisap, aquades steril aquades mengalir dan keringkan.
kelompok bakteri berdasarkan reaksi terhadap positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan ini CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram
warna yang sekaligus menunjukkan sifat bakteri berdasarkan warna yang dapat dipertahankan negatif seperti gram positif. D. PROSEDUR KERJA 6. Teteskan 2–3 tetes alkohol 96% ke atas
tersebut. bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, preparat, kemudian diamkan selama 30 detik. Cuci
berupa pewarna basa,jadi pewarna ini akan • Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah 1. Buat suspensi bakteri dari biakan murni bakteri dengan aquades mengalir dan keringkan.
B. DASAR TEORI mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama umur 24 jam.
bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci dari 24 jam. Umur kultur akan 25 berpengaruh 7. Teteskan 2–3 tetes larutan safranin, kemudian
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan tidaknya warna dasar bergantung pada komposisi pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), 2. Siapkan kaca objektif, cuci dengan alkohol 70%. diamkan selama 60 menit. Cuci dengan aquades
hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak dinding sel, bila komponen dinding sel kuat khususnya pada gram positif. Mungkin akan mengalir dan keringkan.
berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, 3. Ambil 1 loop jarum Ose suspensi bakteri dan
mengatasi hal tersebutmaka dikembangkan suatu maka warna pembanding tidak akan terlihat, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah ratakan pada gelas benda, kemudian fiksasi di 8. Keringkan preparat dengan kertas tissue yang
teknik pewarnaan sel bakteri sehingga sel dapat yang terlihat pada akhir hasil tetap warna dasar. karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa atas lampu Bunsen selama 5 detik. ditempelkan di sisi ulasan (jangan sampai
terlihat lebih jelas dan mudah diamati. Oleh species yang memang bersifat gram variabel merusan ulasan), lalu biarkan mengering.
karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini • Fase yang paling kritis dari prosedur di atas seperti pada genus Acinetobacter dan 4. Teteskan 2–3 tetes larutan kristal violet pada
merupakan salah satu cara yang paling utama adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan Arthrobacter. preparat, usahakan semua ulasan terwarnai. 9. Amati dengan menggunakan mikroskop
dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol Diamkan selama 60 detik. Cuci dengan aquades perbesaran 1000x.
jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan mengalir dan keringkan.
overdecolorization sehingga sel gram positif
MODUL 5 UJI CEMARAN MIKROBA: ANGKA duplo. Setelah inkubasi, dipilih cawan petri dari C. ALAT DAN BAHAN a. Penyiapan Sampel Uji Kemasan jamu yang pengenceran 10-2 (homogenisasi dengan vortex).
LEMPENG TOTAL (ALT) DAN ANGKA KAPANG satu pengenceran yang menunjukkan jumlah akan dibuka dibersihkan dengan kapas Selanjutnya dibuat pengenceran hingga 10-5 .
KHAMIR (AKK) koloni antara 30-300 koloni. Jumlah koloni rata- 1. Uji Angka Lempeng Total a. Alat: Pipet volume, beralkohol 70% kemudian dibuka secara aseptis
rata dari kedua cawan dihitung lalu dikalikan Colony Counter (alat hitung koloni) di dekat nyala api spiritus. e. Uji Angka Lempeng Total (ALT) Dari tiap
A. TUJUAN 1. Menghitung jumlah mikroba aerob dengan faktor pengencerannya. Hasil dinyatakan pengenceran dipipet 1 ml suspensi ke dalam
mesofil yang terdapat dalam sampel sebagai Angka Lempeng Total (ALT) dalam tiap b. Bahan: Media Plate Count Agar (PCA), Buffered b. Persiapan dan Homogenasi Sampel Secara cawan petri steril secara duplo. Dalam setiap
gram contoh bahan (Anonim, 1992; Anonim, Pepton Water (BPW), Sampel uji (jamu gendong) aseptis diambil sebanyak 10 ml sampel ke dalam cawan petri dituangkan sebanyak 15 ml media
2. Menguji bahwa sampel yang diuji tidak boleh 2000). labu ukur 100 ml, lalu ditambahkan 90 ml BPW PCA. Cawan petri digoyang dengan hati hati
mengandung mikroba melebihi batas yang 2. Uji Angka Kapang Khamir (AKK) a. Alat: Pipet dan dihomogenkan hingga diperoleh agar sampel tersebar merata. Dilakukan pula uji
ditetapkan karena berbahaya bagi kesehatan Angka kapang/khamir adalah jumlah koloni volume, Colony counter (alat hitung koloni) pengenceran 10-1 kontrol untuk mengetahui sterilitas media dan
manusia kapang dan khamir yang ditumbuhkan dalam pengencer. Uji sterilitas media dilakukan dengan
media yang sesuai selama 5 hari pada suhu 20- b. Bahan: Media Potato Dextrrose Agar (PDA), c. Pembuatan media PCA (Plate Count Agar) cara menuangkan media PCA dalam cawanpetri
B. DASAR TEORI 25oC dan dinyatakan dalam satuan koloni /mL Larutan pengencer Pepton Dilution Fluid (PDF), (hitung dan lihat cara pembuatan media pada dan biarkan memadat. Uji sterilitas pengencer
(Soekarto, 2008). Uji AKK (Angka Kapang Khamir) Sampel uji (jamu gendong), Kloramfenikol 100 kemasan) dilakukan dengan cara menuangkan media PCA
Angka Lempeng Total (ALT) adalah pertumbuhan mengandung prinsip yaitu pertumbuhan kapang mg/liter media, Pembuatan larutan kloramfenikol: dan 1 ml pengencer BPW lalu dibiarkan memadat.
bakteri mesofil aerob setelah sampel diinkubasi dan khamir setelah cuplikan diinokulasikan pada 1 gram kloramfenikol dalam 100 ml air suling d. Pengenceran sampel untuk uji ALT Sebanyak 5 Seluruh cawan petri diinkubasi terbalik pada
dalam perbenihan yang cocok selama 24-48 jam media yang sesuai dan diinkubasikan pada suhu steril. buah labu ukur 10 ml disiapkan, masing-masing suhu 350C selama 24-48 jam. Jumlah koloni yang
pada suhu 37°C (SNI, 1992). Uji ALT (Angka 20-25oC. Setelah inkubasi, dipilih cawan petri telah diisi dengan 9 ml pengencer BPW. Sebanyak tumbuh diamati dan dihitung. Perhitungan Angka
Lempeng Total) mengandung prinsip yaitu dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah D. PROSEDUR KERJA 1 ml 29 pengenceran 10-1 dari hasil Lempeng total dalam 1 ml contoh dengan
pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil koloni antara 10-15o 28 koloni. Jumlah koloni homogenisasi pada penyiapan sampel diambil mengkalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan
setelah cuplikan diinokulasikan pada lempeng rata-rata dari kedua cawan dihitung lalu 1. Uji Angka Lempeng Total (ALT) dan dimasukkan ke dalam tabung pertama yang dengan faktor pengenceran yang digunakan.
agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada dikalikan dengan faktor pengencerannya. telah diisi 9 ml BPW hingga diperoleh
suhu yang sesuai. Pengujian dilakukan secara (Anonim, 1992; Anonim, 2002).

2. Uji Angka Kapang Khamir (AKK) c. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel yang sama dengan penentuan Angka Lempeng • Larutan pengencer yang digunakan adalah
sebelumnya telah ditambah dengan 1 ml larutan
Total (ALT). Pepton Dilution Fluid (PDF) kloramfenikol dan digoyangkan sehingga
a. Penyiapan Sampel Uji (sama dengan uji ALT) • Perhitungan Angka Kapang Khamir (AKK) campuran tersebut merata. Setelah agar
bertujuan untuk menghitung jumlah koloni kapang • Media pertumbuhan yang digunakan adalah PDAd. Uji AKK Dari masing-masing pengenceran membeku, cawan petri dibalik dan diinkubasikan
b. Pembuatan media PDA (Potato Dextrose Agar) dan khamir yang terdapat dalam bahan. Pada (Potato Dextrose Agar) dipipet 1 ml ke dalam cawan petri steril secara pada suhu 250C atau pada suhu kamar selama 5
(hitung dan lihat cara pembuatan media pada prinsipnya pengujian ini menggunakan 30 metode duplo. Media PDA yang telah dicairkan sebanyak hari. Pengamatan dilakukan setiap hari sampai
kemasan) 20 ml dituangkan ke dalam cawan petri yang hari ke-5. Koloni kapang dan khamir dihitung
setelah 5 hari. Uji sterilitas media dilakukan
dengan menuangkan media PDA dalam cawan
petri dan dibiarkan memadat. Uji sterilitas
pengencer dilakukan dengan cara menuangkan
media PDA dan 1 ml pengencer (PDF) lalu
dibiarkan memadat.
MODUL 6 PENETAPAN KONSENTRASI HAMBAT
MINIMUM
A. TUJUAN Tujuan penentuan kadar hambat mempunyai efek daya hambat pertumbuhan sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan C. ALAT DAN BAHAN Alat • 11 buah tabung reaksi •
minimum antibiotika adalah untuk mengetahui mikroorganisme. atau kekeruhan pada tabung inkubasi 8 buah cawan petri • 1 labu ukur 100 ml • 1 buah
kadar minimal suatu antibiotika yang dapat gelas ukur • 1 buah rak tabung reaksi • Inkubator
menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Dalam Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara 2. Cara padat Pada cara ini digunakan media • 2 buah kawat ose • 1 buah spatel • 1 buah kaca
praktikum ini dicari kadar minimal antibiotika yaitu: padat yang telah dicampur dengan larutan uji arloji • 1 buah Volume pipet • 1 buah
Tetrasiklin terhadap Staphylococus aureus dan dengan berbagai konsetrsi. Dengan cara ini satu mortir+stamper • Batang pengaduk • 1 buah
Escherichia coli. 1. Cara cair Pada cara ini digunakan media cair cawan petri bisa ditanami beberapa jenis mikroba volume pipet 5ml Bahan • 60 ml media Nutrient
yang telah ditambahkan zat yang dapat seningga nilai KHM zat tersebut terhadap Broth (NB) dan 136 Nutrient Agar (NA) • Suspensi
B. DASAR TEORI Konsentrsi hambat minumun (KHM) menghambat pertumbuhan bakteri dengan mikroba-mikroba yang digunakan dapat staphylococus aureus, E.coli yang berumur 18-22
adalah konsentrasi minimum dari suatu zat yang pengenceran pengenceran tertentu. Kemudian diketahui. jam • 250 mg Tetrasiklin • HCl pekat • Aquadest
ditanamkan biakan bakteri dalam jumlah yang steril secukupnya

D. PROSEDUR KERJA

1. Cara Cair

a. Timbang tepat 250 mg Tetrasiklin larutan

dalam HCl pekat dan encerkan sampai 100ml
dalam labu takar (konsentrasi 2,5mg/ml atau
2500mg/ml)

b. Siapkan 10 tabung reaksi, tabung 1 berisi

media dengan kekuatan 2x (double strenght
media) dan tabung berikutnya berisi media
dengan kekuatan biasa masing-masing 2

c. Dengan menggunakan volume pipet, ambil 1 ml

zat uji dan masukkan ke tabung I kemudian ambil
1 ml, masukkan ke dalam tabung II, kocok, ambil
1 ml dan msukkan ke tabung III dan lakukan
pengerjaan sampai tabung ke 10 dan terakhir
ambil 1 ml dari tabung 10 untuk dibuang (volume
tiap tabung harus tetap 2ml)

d. Kedalam tiap-tiap tabung tadi masukkan 0.3

ml suspensi Staphylococus aureus

e. Siapkan 1 tabung reaksi sebagai blangko yang

berisi 2 ml media dan biakan bakteri

f. Inkubasi semua tabung pada 370C g. Pada

akhir periode inkubasi amati perubahan yang
terjadi. Tabung terakhir yang jernih sebelum
terjadi kekeruhan merupakan perkiraan nilai
KHM dari tetrasiklin.

2. Cara Padat

a. Sediakan 8 cawan petri yang sudah ditandai

berdasarkan luas area tertentu (digambar pada
bagian cawan petri)

b. Kedalam cawan petri tersebut isikan larutan

Tetrasiklin dan media dengan volume yang sesuai
dengan table

cawan Vol NA Vol TS Vol tot

1 17 0 17
2 16 1 17
3 15 2 17
4 14 3 17
5 13 4 17
6 12 5 17
7 11 6 17
8 10 7 17
c. Media dan larutan Tetrasiklin dihomogenkan
kemudain biarkan memadat

d. Tanam biakan bakteri ke dalam campuran

tersebut dengan cara menggoreskan biakan
pada area media yang telah padat

e. Inkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam

f. Amati pertumbuhan bakteri pada ke 8 cawan

tersebut. Cawan terakhir yang tidak menunjukan
pertumbuhan merupakan nilai KHM dari
Tetrasiklin untuk mikroba tersebut

g. Tentukan KHM dari Tetrasiklin terhdap kedua

bakteri dengan cara ini