MODUL 1-4 pada waktu menuang media, dapat digunakan

TEKNIK STERILISASI DAN TEKNIK KERJA penyaring udara berisikan partikel (High
ASEPTIS Efficiency Particulate Air Filter atau HEPA) yang
memungkinkan dialirkannya udara bersih ke
A. TEKNIK STERILISASI dalam ruang tertutup dengan sistem aliran
Sterilisasi adalah suatu tindakan untuk udara laminar (Laminar Air Flow).
membebaskan alat atau media dari semua
bentuk kehidupan terutama mikroba. Hal ini
diperlukan agar mikroba yang ingin
ditumbuhkan, diamati dan diisolasi terbebas
dari mikroba lain (mikroba kontaminan). Suatu
alat atau bahan dikatakan steril bila alat atau
bahan tersebut bebas dari mikrobia, baik dalam
bentuk sel vegetatif maupun spora.
Teknik sterilisasi terdiri dari berbagai cara atau
metode. Pemilihan cara atau metode sterilisasi
ditentukan berdasarkan sifat alat atau bahan
yang akan disterilisasi dan tujuan sterilisasi.
Secara umum sterilisasi dapat dilakukan dengan
cara mekanik (contohnya : filtrasi atau
penyaringan), cara fisik (contohnya :
pemanasan dan pemberian tekanan, radiasi)
dan cara kimia (contohnya pemberian
desinfektan).
Sterilisasi secara mekanik digunakan untuk
sterilisasi bahan yang tidak tahan terhadap
pemanasan atau tekanan tinggi. Teknik
sterilisasi bahan tersebut menggunakan
saringan (filter). Terdapat 2 jenis filter yaitu
filter bakteriologis dan filter udara. Filter
bakteriologis biasanya digunakan untuk
mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan
terhadap pemanasan, misalnya larutan gula,
serum, antibiotika, antitoksin, trace element,
enzim, vitamin, hormon atau media yang
mengandung bahan tersebut dll. Teknik filtrasi Sterilisasi secara Fisik. Cara ini digunakan untuk
prinsipnya menggunakan penyaringan, yang mensterilkan alat/bahan yang tahan panas,
tersaring hanyalah bakteri saja. Diantara jenis tekanan atau radiasi. Sterilisasi ini dapat
filter bakteri yang umum digunakan adalah : dilakukan dengan berberapa cara, antara lain :
Berkefeld (dari fosil diatomae), Chamberland a. Pemijaran (dengan api langsung). Teknik ini
(dari porselen), Seitz (dari asbes) dan seluosa. dilakukan dengan membakar alat pada api
Terdapat beberapa jenis membran filter (nilon, secara langsung menggunakan lampu
polyethersulfone (PES), cellulOse nitrate, spiritus atau api Bunsen. Red heating, yakni
cellulOse acetate dan campuran ester) dengan pemanasan langsung di atas api bunsen
berbagai ukuran pori. Untuk tujuan sterilisasi burner (pembakar spiritus) sampai berpijar
umumnya digunakan pori berukuran 0,2 m. merah. Biasanya digunakan untuk
Filter udara. Untuk menjaga sterilitas alat, mensterilkan alat yang sederhana seperti
bahan, media yang sudah steril atau menjaga jarum Ose pinset, ujung pipet, bibir tabung
kultur mikroba tidak tercemar oleh mikroba reaksi/erlenmeyer/cawan Petri, dll.
lainnya, maka dapat digunakan tutup kapas. Sedangkan teknik flaming yakni
Untuk mencegah mikroba pengkontaminan pembakaran langsung alat-alat
laboratorium diatas pembakar
 bunsen dengan alkohol atau spiritus tanpa
terjadinya pemijaran.
Gambar 1.4.1 Teknik pemijaran untuk
mensterilkan jarum Ose.
b. Pemanasan kering
Panas kering, biasanya digunakan untuk
mensterilisasi alat-alat laboratorium. Untuk
alat-alat seperti cawan Petri, botol atau
bahan seperti tepung, talk dan sebagainya.
Umumnya menggunakan alat oven. Suhu
efektifnya adalah 160oC selama 2 jam.,
sering juga peneliti menggunakan suhu
175oC selama 1,5 sampai 2 jam.
c. Pemanasan basah
Cara ini dapat dilakukan dengan
pasteurisasi, perebusan, penggunaan uap
air panas, penggunaan uap panas
bertekanan Panas basah/lembab dengan
uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk
sterilisasi karena menyediakan suhu jauh di
atas titik didih, cepat, daya tembus kuat
dan kelembaban sangat tinggi sehingga
mempermudah koagulasi protein sel-sel
mikroba yang menyebabkan sel hancur.
Suhu efektifnya adalah 121oC pada tekanan
5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit.
Alat yang digunakan : pressure cooker,
autoklaf (autoclave). Beberapa teknik yang
tergolong sterilisasi dengan suhu panas
antara lain: i) Pasteurisasi. Teknik ini
merupakan teknik pembunuhan mikroba
patogen dengan suhu terkendali
berdasarkan waktu kematian termal bagi
tipe patogen yang paling resisten untuk
dibasmi. Dalam pasteurisasi yang terbunuh
hanyalah bakteri patogen dan bakteri
penyebab kebusukan namun tidak pada
bakteri lainnya. Pasteurisasi biasanya
dilakukan untuk susu, rum, anggur dan
makanan asam lainnya. Suhu pemanasan
adalah 65oC selama 30 menit. ii) Tyndalisasi.
Teknik ini dilakukan dengan pemanasan,
biasanya untuk sterilisasi makanan dan
minuman kaleng. Tyndalisasi dapat
membunuh sel vegetatif sekaligus spora
mikroba tanpa merusak zat-zat yang
terkandung di dalam makanan dan
minuman yang di. Suhu pemanasan adalah
65oC selama 30 menit dalam waktu tiga hari
berturut-turut. iii) Pendidihan (boiling).
Teknik ini dilakukan dengan pemanasan
dengan cara merebus bahan yang akan
disterilkan pada suhu 100oC selama 10-15
menit. Teknik ini dapat membunuh sel
vegetatif bakteri yang patogen maupun non
patogen. Namun spora dan beberapa virus
masih dapat hidup. Biasanya
dilakukan pada alat-alat kedokteran gigi,
alat suntik, pipet, dan lain-lain.
d. Radiasi
Bakteri terutama bentuk sel vegetatifnya
dapat terbunuh dengan penyinaran sinar
ultraviolet (UV) dan sinar-sinar ionisasi.
Radiasi menggunakan sinar UV juga
digunakan untuk sterilisasi ruangan
laboratorium, enkas atau alat-alat gelas.
Jika menggunakan sinar UV, bakteri yang
berada di udara atau yang berada di lapisan
permukaan suatu benda yang terpapar
sinar UV akan mati. Penggunaan Sinar
Ionisasi (sinar X, sinar alfa, sinar beta dan
sinar gamma) memerlukan biaya yang
besar dan biasanya hanya digunakan pada
industri farmasi maupun industr
kedokteran. Daya penetrasi sinar X baik
namun perlu energi besar. Sinar alfa
memiliki sifat bakterisidal tetapi tidak
memiliki daya penetrasi. Sinar beta
mempunyai daya penetrasi sedikit lebih
besar daripada sinar X. Sedangkan sinar
gamma mempunyai kekuatan radiasi besar
dan efektif untuk sterilisasi bahan
makanan.
Sterilisasi secara Kimia. Sterilisasi
menggunakan bahan kimia yang mempunyai
potensi berpotensi untuk membunuh atau
menghambat mikroba. Bahan tersebut
biasanya menggunakan senyawa desinfektan
antara lain alkohol. Agen kimia yang baik
adalah yang memiliki kemampuan membunuh
mikroba secara cepat dengan dosis yang rendah
tanpa merusak bahan atau alat yang
didisinfeksi. Beberapa faktor yang
mempengaruhi efektivitas agen kimia dalam
mengendalikan mikroba antara lain:
a) Konsentrasi agen kimia yang digunakan.
Semakin tinggi konsentrasinya maka
efektivitasnya semakin meningkat.
b) Waktu kontak. Semakin lama bahan
tersebut kontak dengan bahan yang
disterilkan maka hasilnya akan semakin
baik.
c) Sifat dan jenis mikroba. Mikroba yang
berkapsul dan berspora lebih resisten
dibandingkan yang berkapsul dan
berspora.
d) Adanya bahan organik dan ekstra. Adanya
bahan-bahan organik dapat menurunkan
efektivitas agen kimia.
e) pH atau derajat keasaman. Efektivitas
bahan kimia dapat berubah seiring dengan
perubahan pH.
Agen-agen kimia dapat membunuh atau
menghambat mikroba dengan cara merusak
membran sel mikroba, merusak enzim mikroba
atau mendenaturasi protein Agen Kimia yang
merusak membran sel antara lain: golongan
surfaktan (Surface Active Agents) baik golongan
anionik, kationik dan nonionik. Demikian juga
.golongan fenol juga dapat merusak membran.
Sedangkan agen kimia yang dapat merusak
enzim mikroba antara lain: golongan logam
berat seperti arsen, perak, merkuri, dll.,
golongan oksidator seperti golongan halogen,
peroksida hidrogen & formaldehid. Beberapa
agen kimia juga dapat menyebabkan denaturasi
protein sehingga menyebabkan terjadinya
koagulasi dan presipitasi protoplasma, seperti
alkohol, gliserol dan bahan-bahan asam dan
alkalis.
B. TEKNIK ASEPTIS
Teknik aseptis sangat penting dalam
pengerjaan telaah mikrobiologi yang
memerlukan ketelitian dan keakuratan di
samping kesterilan yang harus selalu dijaga agar
terbebas dari kontaminan yang dapat
mencemari atau mengkontaminasi kultur.
Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan
teknik aseptis untuk mencegah ataupun
mengurangi kontaminasi yang tidak diinginkan,
karena setiap benda yang digunakan maupun
pekerja di laboratorium dapat menjadi sumber
kontaminasi. Ada beberapa cara untuk
mengendalikan atau mengurangi kontaminan,
diantaranya adalah sebagai berikut :
a. Kebersihan dan Sanitasi. Kedua hal ini
sangat penting dalam mengurangi jumLah
populasi mikroorganisme pada suatu
ruang/tempat. Prinsip kebersihan dan
sanitasi adalah menciptakan lingkungan
yang tidak dapat menyediakan sumber
nutrisi bagi pertumbuhan mikroba
sekaligus membunuh sebagian besar
populasi mikroba.
b. Desinfeksi. Cara ini merupakan
pengaplikasian bahan kimia (desinfektans)
terhadap ruang kerja, peralatan, lantai,
dinding atau lainnya untuk membunuh sel
vegetatif mikrobial. Desinfeksi diaplikasikan
pada benda dan hanya berguna untuk
membunuh sel vegetatif saja, tidak mampu
membunuh spora. Meja yang akan
digunakan terlebih dahulu diberi
disinfektan untuk membunuh
mikroorganisme yang ada. Meja disemprot
dengan alcohol 70%, kemudian dilap
dengan tissue. Selain itu, tangan juga
disemprot dengan etanol 70%, kemudian
barulah menyalakan Bunsen.
c. Antiseptis. Merupakan aplikasi senyawa
kimia yang bersifat antiseptis terhadap
tubuh untuk melawan infeksi atau
mencegah pertumbuhan mikroorganisme
dengan cara menghancurkan atau
menghambat aktivitas mikroba.
d. Sterilisasi. menghancurkan semua jenis
kehidupan sehingga menjadi steril
Beberapa aturan yang harus dipahami dan
dipenuhi dalam melakukan praktikum atau
penelitian mikrobiologi, yakni :
a. Pada saat sebelum pelaksanaan praktikum :
- Memakai pakaian atau jas laboratorium
yang bersih dan higinis sebelum masuk
ke dalam laboratorium
- Singkirkan semua barang yang tidak
diperlukan dari meja dan ruang kerja
- Dianjurkan untuk mengenakan masker
yang bersih dan higienis
- Kenakan penutup rambut yang bersih
dan higienis
 - Jangan sekali-kali meletakkan tabung
dan peralatan laboratorium lainnya di
luar laboratorium
b. Pada saat sebelum dan setelah pelaksanaan
praktikum :
- Cuci tangan anda dengan bersih dan
gunakan antiseptis
- Sanitasi dan desinfeksi ruang kerja
(laboratorium dan sekitarnya) dengan
desinfektan yang memadai, termasuk
Laminar Air Flow dan Inkubator
- Sterilisasi semua alat dan bahan
sebelum digunakan
c. Saat ketika pelaksanaan kultur :
- Jangan bicara
- Bekerjalah di dekat api (pembakar
bunsen) dan di dalam Laminar Air Flow
- Bukalah tabung atau cawan di atas api
dan jauhkan dari hidung dan mulut
anda
- Usahakan jangan meletakkan tutup
(kapas penutup) tabung reaksi di atas
lantai/alas meja atau laminar
- Miringkan tutup cawan Petri yang akan
dibuka sebagai penghalang antara
kultur dengan mulut dan hidung
saudara
- Jangan buka tutup cawan Petri terlalu
lebar dan terlalu lama
- Bekerjalah dengan cepat
d. Saat setelah pelaksanaan :
- Segera tutup semua tabung atau cawan
yang masih terbuka
- Singkirkan segera semua peralatan atau
bahan sisa yang sudah tidak digunakan
lagi
- Bersihkan dan keringkan segera
tumpahan-tumpahan media yang ada
- Sanitasi dan desinfeksi ulang ruang
kerja (laboratorium anda)
- Lepas pakaian kerja dan jas
laboratorium saudara sebelum
meninggalkan ruang kerja anda
Kompetensi yang diharapkan :
1. Mengetahui berbagai cara sterilisasi ruang
kerja/ laboratorium dan peralatan
laboratorium.
2. Mengetahui cara sterilisasi media kultur
untuk mikroba
Alat dan Bahan.
Alat filtrasi autoclavable, membran filter
ukuran pori-pori filter 0,22 µm, pompa vakum,
botol steril, pinset steril, larutan trace element
atau bahan lainnya (antibiotik atau vitamin).
Jarum Ose, lampu bunsen, korek api, media
padat dalam cawan Petri, media padat dalam
tabung. Cawan Petri, tabung reaksi, pipet ukur,
kapas, kertas bungkus, benang kasur, oven, air
steril, media Potato DextrOse Agar (PDA) atau
Nutrient Agar (NA) dalam tabung reaksi dan
Erlenmeyer, cawan Petri steril, inkubator,
kertas sampul coklat, kapas, benang kasur,
susu, penangas, panci dan kompor.
Cara Kerja :
Sterilisasi dengan filtrasi
1. Sterilkan alat filtrasi dan botol penampung
filtrat, kemudian rangkai alat tersebut
beserta pompa vakum.
2. Membran filter steril diletakkan secara
aseptis dengan menggunakan pinset steril
pada dasar penopang filter.
3. Bahan yang difiltrasi dituang, kemudian
pompa vakum dihidupkan.
4. Filtrat yang telah tertampung di dalam
botol penampung telah steril dan siap
digunakan untuk perlakuan selanjutnya.
Sterilisasi dengan pembakaran
1. Nyalakan lampu bunsen dan atur nyala
apinya secara maksimal
2. Ambil jarum Ose kemudian lakukan
pembakaran dengan api bunsen mulai dari
bagian pangkal kawat Ose secara perlahan
menuju ke ujung kawat jarum Ose.
Pembakaran jarum Ose dilakukan sampai
kawatnya merah membara.
3. Jarum Ose yang dibakar dibiarkan dingin,
selanjutnya siap digunakan untuk
mengambil/menginokulasi mikrobia.
4. Perhatikan teknik transfer aseptis seperti
yang di jelaskan di atas.
Sterilisasi dengan panas kering
1. Tangkupkan cawan Petri bagian bawah dan
tutupnya, kemudian bungkus dengan
kertas bungkus dan susun cawan Petri (5 -
10 buah) dan ditali dengan benang kasur.
2. Ambil tabung reaksi yang masing-masing dituang, media didinginkan terlebih dahulu
ditutup dengan kapas, beberapa tabung (5- sampai suhu sekitar 45oC.
10 tabung) diikat jadi satu dan dibungkus
kertas kemudian ditali. Sterilisasi dengan teknik Pasteurisasi.
3. Pipet ukur ujung atas diberi sedikit sumbat 1. Siapkan kompor dan penangas. Isi air
kapas (agak longgar) kemudian dibungkus secukupnya. Masukkan susu ke dalam
dengan kertas payung dan diikat dengan wadah yang tahan panas. Masukkan wadah
benang kasur. tersebut ke dalam penangas.
4. Semua alat tersebut dimasukkan ke dalam 2. Pasteurisasi dilakukan pada suhu 70o – 80oC
oven. selama 15-20 menit.
5. Oven dinyalakan pada suhu 175oC Dan
setelah suhu tsb. Tercapai, sterilisasi
dilakukan selama 2 jam.
6. Setelah selesai pemanasan, semua
peralatan didinginkan dan pada hari
berikutnya siap dipakai.

Sterilisasi dengan panas basah bertekanan

tinggi (autoklaf)
1. Tutup tabung reaksi yang berisi media PDA
atau NA dengan kapas, beberapa tabung
diikat jadi satu dan bagian tutupnya
dibungkus dengan kertas payung. Sisakan
satu tabung berisi media tersebut, tetapi
tidak disterilkan.
2. Isi autoklaf dengan air sampai permukaan
air di bawah ansang/keranjang autoklaf
3. Sambungkan autoklaf dengan sumber listrik
dan nyalakan autoklaf.
4. Masukkan tabung reaksi berisi media ke
dalam ansang/keranjang autoklaf
5. Tutup autoklaf dan kecangkan penutupnya
dengan kuat.
6. Atur suhu, waktu dan tekanan yang
diperlukan untuk sterilisasi. Sterilisasi
umumnya dilakukan pada 121oC dan
tekanan 1 atm. selama 15 menit
7. Tanda digital pada autoklaf menunjukkan
selama sterilisasi berlangsung. Sterilisasi
berakhir secara otomatis bila tanda telah
menunjukkan complete.
8. Pada saat akan membuka tutup autoklaf,
pastikan (check) suhu sudah turun sekitar
60C dan tekanan sudah nol.
9. Buka tutup autoklaf dan ambil media yang
telah disterilkan. Untuk media agar miring,
siapkan serbet yang telah digulung
kemudian taruh tabung berisi agar
diatasnya dengan kemiringan sekitar 30.
Untuk media dalam erlenmeyer, sebelum