TUGAS

KIMIA ORANIK BAHAN ALAM

Oleh :
Yola Efrianti
NIM: 2010411026

Dosen:
Drs. Bustanul Arifin,MS

PROGRAM STUDI S1 ILMU KIMIA

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ANDALAS
PADANG
1
1. Title Labdane diterpenoids from Curcuma amada rhizomes collected in
Myanmar and their antiproliferative activities
Jurnal Fitoterapia 122 (2017) 34–39
Publisher Elsevier
Author Nwet Nwet Win, Takuya Ito, Hla Ngwe,YiYiWin, Prema, Yasuko Okamoto, Masami Tanaka, Yoshinori Asakawa, Ikuro Abe, Hiroyuki Morita
2 ABSTRACT
Four new labdane diterpenoids, 12β-hydroxy-15-norlabda-8(17),13(14)-dien-16-oic acid
(1), (E)-15-ethoxy-15methoxylabda-8(17),12-dien-16-al (2), (E)-15 α-ethoxy-14 α-
hydroxylabda-8(17),12-dien-16-olide (3), and 15ethoxy-12 β-hydroxylabda-8(17),13(14)-
dien-16,15-olide (4) were isolated from the methanol extract of Curcuma amada
rhizomes collected in Myanmar, together with 13 known analogs. Their structures were
elucidated by extensive spectroscopic techniques. All of the isolates were evaluated for
their antiproliferative activities against a small panel of five different human cancer cell
lines (A549, human lung cancer; HeLa, human cervical cancer; MCF7, human breast
cancer; PANC-1 and PSN-1, human pancreatic cancer). Among the isolates, compounds
2−4, 7, 8, 12, and 17 showed mild antiproliferative activities with IC50 values ranging
from 19.7 to 96.1 μM. (E)-14-Hydroxy-15-norlabda-8(17),12-dien-16-al (11) exhibited
strong antiproliferative activities selectively against HeLa, PANC-1, and PSN-1 cells, with
IC50 values of 5.88, 1.00, and 3.98 μM, respectively. These potencies were comparable
to those of the positive control, 5-fluorouracil.
3 INTRODUCTION
Medicinal herbs belonging to the Zingiberaceae family are being increasingly recognized
as useful complementary treatments for the prevention of cancer and HIV. One of the
richest and most diverse regions for Zingiberaceae is Myanmar, with 24 genera and
about 155 species. Among them, 24 species of Curcuma plants are widely distributed
throughout Myanmar, and are used as food, spices, medicines, and aesthetics. Curcuma
amada Roxb. is an important member of this genus and is commonly known as mango
ginger, due to the raw mangolike aroma of the rhizome. This herbaceous perennial plant
is locally known as Thayetkin [1], and has a long history of traditional uses ranging from
folk medicine to culinary preparations. The fresh rhizomes of C. amada are consumed as
a dipping vegetable. The rhizomes are also utilized in many herbal medicines and
Labdan Diterpenoid dari Rimpang Curcuma amada yang Dikumpulkan di Myanmar dan
Aktivitas Antiproliferatifnya
ABSTRAK
Empat diterpenoid labdan baru, yakni 12β-hydroxy-15-norlabda-8(17),13(14)-dien-16-oic acid
(1), (E)-15-ethoxy-15-methoxylabda-8(17),12-dien-16-al (2), (E)-15 α-ethoxy-14 α-
hydroxylabda-8(17),12-dien-16-olide (3), dan 15-ethoxy-12 β-hydroxylabda-8(17),13(14)-dien-
16,15-olide (4), diisolasi dari ekstrak metanol rimpang Curcuma amada yang dikumpulkan di
Myanmar, bersama dengan 13 analog yang sudah dikenal. Struktur-struktur mereka
dielaborasi melalui teknik spektroskopi yang ekstensif. Semua senyawa yang diisolasi dinilai
untuk aktivitas antiproliferatif mereka terhadap panel kecil dari lima jenis sel kanker manusia
yang berbeda (A549, kanker paru-paru manusia; HeLa, kanker serviks manusia; MCF7, kanker
payudara manusia; PANC-1 dan PSN-1, kanker pankreas manusia). Diantara senyawa-senyawa
yang diisolasi, senyawa 2-4, 7, 8, 12, dan 17 menunjukkan aktivitas antiproliferatif yang ringan
dengan nilai IC50 berkisar antara 19,7 hingga 96,1 μM. (E)-14-Hydroxy-15-norlabda-8(17),12-
dien-16-al (11) menunjukkan aktivitas antiproliferatif yang kuat secara selektif terhadap sel
HeLa, PANC-1, dan PSN-1, dengan nilai IC50 masing-masing 5,88, 1,00, dan 3,98 μM. Potensi ini
sebanding dengan kontrol positif, yaitu 5-fluorouracil.
PENDAHULUAN
Tanaman obat yang berasal dari keluarga Zingiberaceae semakin diakui sebagai perawatan
komplementer yang berguna untuk mencegah kanker dan HIV. Salah satu wilayah terkaya dan
paling beragam untuk Zingiberaceae adalah Myanmar, dengan 24 genus dan sekitar 155
spesies. Di antaranya, 24 spesies tanaman Curcuma banyak tersebar di seluruh Myanmar dan
digunakan sebagai makanan, rempah-rempah, obat-obatan, dan keperluan estetika. Curcuma
amada Roxb. adalah anggota penting dari genus ini dan umumnya dikenal sebagai jahe
mangga, karena aroma mentah yang mirip mangga dari rimpangnya. Tanaman tahunan herba
ini dikenal secara lokal sebagai Thayetkin [1], dan memiliki sejarah panjang penggunaan
tradisional mulai dari pengobatan rakyat hingga persiapan kuliner. Rimpang segar C. amada
dikonsumsi sebagai sayuran cocolan. Rimpangnya juga digunakan dalam berbagai obat herbal
2
 ethnomedicines for the treatment of skin diseases, stomach ailments, cough,
inflammation, and rheumatism. Previous phytochemical studies of C. amada revealed
the presence of labdane diterpenoids, β-sitosterol, and curcumin [2]. Most of the
phytochemicals of C. amada are found in the genera Curcuma [3–7], Alpinia [8–17],
Hedychium [18–22], Zingiber [23], and Aframomum [24–25]. The various
pharmacological actions, such as antioxidant, antibacterial, antifungal, anti-
inflammatory, antiallergic, biopesticide, hypoglyceredemic, and cytoxic activites of C.
amada have been reported [26]. In our ongoing research for the discovery of bioactive
compounds from Myanmar's natural resources [27–33],we performed biological and
phytochemical studies of C. amada. Herein, the isolation, structural elucidation, and
antiproliferative activities of the isolated compounds are described.
4 Experimental
General experimental procedures
Optical rotations were recorded on a Jasco P2100 polarimeter. UV spectra were
measured on a Shimadzu UV-160A spectrophotometer. Infrared spectra were recorded
as KBr pellets on a Jasco FT/IR-460 Plus spectrometer. NMR spectra were recorded at
600 MHz (H NMR) and 150 MHz ( 13C NMR) on a Varian UNITY 600 spectrometer.
Chemical shift values were expressed in δ (ppm) downfield from TMS as an internal
standard. The mass spectra, including high-resolution mass spectra, were recorded on a
JEOL MStation JMS-700 spectrometer. Open column chromatography was performed
with normal-phase silica gel (silica gel 60 N, spherical, neutral, 40−50 μm, Kanto
Chemical Co., Inc., Japan) and Cosmosil 75C18-OPN (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan).
TLC was performed on precoated silica gel 60F254 and RP18 F254 plates (Merck, 0.25 or
0.50 mm thickness). The cell lines, including A549, human lung cancer; HeLa, human
cervical cancer; MCF7, human breast cancer; and PANC-1 and PSN-1, human pancreatic
cancer, were available and maintained in our laboratory. Cell culture flasks and 96-well
plates were from Corning Inc. (Corning, NY, USA). An SH-1200 Microplate Reader®
(Corona, Hitachinaka, Japan) was used to measure the absorbance of the cells in the
antiproliferative activity assay.
Plant material
The fresh rhizomes of C. amada (2.5 kg) were collected from Kyaikmaraw Township,
Mon State, Myanmar, in September 2016 and identified by Dr. Tin Nwe Ni, a lecturer in
the Department of Botany, University of Yangon. The rhizomes were cut into small
dan etnomedisin untuk pengobatan penyakit kulit, gangguan lambung, batuk, peradangan, dan
rematik. Penelitian fitokimia sebelumnya tentang C. amada mengungkapkan keberadaan
labdan diterpenoid, β-sitosterol, dan kurkumin [2]. Sebagian besar senyawa fitokimia dari C.
amada ditemukan dalam genus Curcuma [3–7], Alpinia [8–17], Hedychium [18–22], Zingiber
[23], dan Aframomum [24–25]. Berbagai tindakan farmakologis, seperti antioksidan,
antibakteri, antijamur, antiinflamasi, antialergi, pestisida hayati, hipoglikemik, dan aktivitas
sitotoksik dari C. amada telah dilaporkan [26]. Dalam penelitian berkelanjutan kami untuk
menemukan senyawa bioaktif dari sumber daya alam Myanmar [27–33], kami melakukan
penelitian biologis dan fitokimia terhadap C. amada. Dalam tulisan ini, dijelaskan isolasi,
penyelidikan struktur, dan aktivitas antiproliferatif dari senyawa-senyawa yang diisolasi.
Eksperimen
Prosedur eksperimen umum
Rotasi optik diukur dengan menggunakan polarimeter Jasco P2100. Spektrum UV diukur
dengan spektrofotometer Shimadzu UV-160A. Spektrum inframerah diukur dalam bentuk
pellet KBr dengan spektrometer Jasco FT/IR-460 Plus. Spektrum NMR diukur pada 600 MHz (H
NMR) dan 150 MHz (13C NMR) dengan spektrometer Varian UNITY 600. Nilai pergeseran kimia
diekspresikan dalam δ (ppm) ke bawah dari TMS sebagai standar internal. Spektrum massa,
termasuk spektrum massa beresolusi tinggi, diukur dengan spektrometer JEOL MStation JMS-
700. Kromatografi kolom terbuka dilakukan dengan menggunakan gel silika fase normal (silika
gel 60 N, bentuk bulat, netral, 40−50 μm, Kanto Chemical Co., Inc., Jepang) dan Cosmosil
75C18-OPN (Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Jepang). KLT dilakukan pada pelat silika gel 60F254
dan RP18 F254 yang telah dilapisi sebelumnya (Merck, ketebalan 0,25 atau 0,50 mm). Garis sel,
termasuk A549, kanker paru-paru manusia; HeLa, kanker serviks manusia; MCF7, kanker
payudara manusia; dan PANC-1 dan PSN-1, kanker pankreas manusia, tersedia dan dipelihara
di laboratorium kami. Labu kultur sel dan piring 96 sumuran berasal dari Corning Inc. (Corning,
NY, Amerika Serikat). Alat pembaca mikroplat SH-1200® (Corona, Hitachinaka, Jepang)
digunakan untuk mengukur absorbansi sel dalam uji aktivitas antiproliferatif.
Bahan Tanaman
Rimpang segar dari C. amada seberat 2,5 kilogram dikumpulkan dari Kyaikmaraw Township,
Mon State, Myanmar, pada bulan September 2016 dan diidentifikasi oleh Dr. Tin Nwe Ni,
seorang dosen di Departemen Botani, Universitas Yangon. Rimpang tersebut dipotong menjadi
3
pieces and dried at room temperature (300 g). A voucher specimen (TMPW 27645) was
deposited at the Museum for Materia Medica, Analytical Research Center for
Ethnomedicines, Institute of Natural Medicine, University of Toyama, Japan.
Extraction and isolation
The dried rhizomes of C. amada (300 g) were sonicated in MeOH (2 L, 90 min, ×3) at 30
°C, and the solvent was evaporated under reduced pressure to give 35 g of extract. The
methanol extract (34 g) was chromatographed on silica gel with an EtOAc−n-hexane
solvent system to give six fractions [1: EtOAc−n-hexane (0:100) eluate, 1.00 g; 2:
EtOAc−n-hexane (10:90) eluate, 1.50 g; 3: EtOAc−n-hexane (20:80) eluate, 5.50 g; 4:
EtOAc−n-hexane (30:70) eluate, 5.34 g; 5: EtOAc−n-hexane (50:50) eluate, 10.6 g; 6:
EtOAc−n-hexane (100: 0) eluate, 3.13 g]. Fraction 1 was an oily substance. Fraction 2
(1.50 g) was rechromatographed on Cosmosil 75C18-OPN with
acetone−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1) to give three subfractions [21: 315 mg; 2-2: 77
mg; 2-3: 101 mg]. Compounds 5 (4.7 mg) and 6 (2.1 mg) were obtained from silica gel
column chromatography of subfraction 2-1 (315 mg) with n-hexane−EtOAc (9:1),
followed by normal-phase preparative TLC (pTLC) using benzene−CH2Cl2 (2:1) as the
mobile phase. Fraction 3 (5.50 g) was rechromatographed on Cosmosil 75C18-OPN with
acetone−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1) to afford four subfractions [3-1: 84.5 mg; 3-2: 2.87
g; 3–3: 284 mg; 3-4: 1.5 g]. Subfraction 3-2 (2.87 g) was separated by silica gel column
chromatography with CH2Cl2−EtOAc (9:1, 8:2, 7:3) to give three subfractions [3-2-1: 250
mg; 3-2-2: 64 mg; 3-2-3: 240 mg]. Purification of subfraction 3-2-1 (250 mg) by normal-
phase pTLC, using nhexane−EtOAc (9:1), gave 7 (15 mg) and 8 (15 mg). Compounds 9 (11
mg) and 10 (35 mg) were obtained from the purification of subfraction 3-2-2 (64 mg) by
normal-phase pTLC with n-hexane−EtOAc (9:1). Purification of subfraction 3–2-3 (240
mg) by normal-phase pTLC, using n-hexane−EtOAc (9:1), afforded 2 (9.7 mg), 11 (2.0
mg), and 12 (2.1 mg). Fraction 4 (5.34 g) was rechromatographed on Cosmosil 75C18-
OPN with acetone−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1)
to afford three subfractions [4-1: 94 mg; 4-2: 429 mg; 4-3: 1.15 g]. Rechromatographic
separation of subfraction 4-2 (429 mg) by silica gel column chromatography using n-
hexane−EtOAc (4:1), followed by reverse-phase pTLC using MeOH−H2O (9:1), afforded 1
(2.0 mg) and 13 (15 mg). Subfraction 4-3 (1.15 g) was rechromatographed on a silica
gel column, using n-hexane−acetone (9:1, 7:1, 4:1), to give three subfractions [4-3-1:
potongan kecil dan dikeringkan pada suhu ruangan (300 gram). Spesimen voucher (TMPW
27645) disimpan di Museum Materia Medica, Pusat Riset Analisis untuk Etnomedis, Institut
Kedokteran Alam, Universitas Toyama, Jepang.
Ekstraksi dan isolasi
Rimpang kering C. amada (300 g) direndam dalam MeOH (2 L, 90 menit, ×3) pada suhu 30 °C,
dan pelarutnya diuapkan di bawah tekanan rendah untuk menghasilkan 35 g ekstrak. Ekstrak
metanol (34 g) dikromatografi pada silika gel dengan sistem pelarut EtOAc−n-heksana untuk
memberikan enam fraksi [1: eluat EtOAc−n-heksana (0:100), 1,00 g; 2: eluat EtOAc−n-heksana
(10:90), 1,50 g; 3: eluat EtOAc−n-heksana (20:80), 5,50 g; 4: eluat EtOAc−n-heksana (30:70),
5,34 g; 5: eluat EtOAc−n-heksana (50:50), 10,6 g; 6: eluat EtOAc−n-heksana (100:0), 3,13 g].
Fraksi 1 berupa zat berminyak. Fraksi 2 (1,50 g) dikromatografi ulang pada Cosmosil 75C18-
OPN dengan pelarut aseton−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1) untuk memberikan tiga subfraksi
[21: 315 mg; 2-2: 77 mg; 2-3: 101 mg]. Senyawa 5 (4,7 mg) dan 6 (2,1 mg) diperoleh dari
kromatografi kolom silika dari subfraksi 2-1 (315 mg) dengan n-heksana−EtOAc (9:1), diikuti
dengan KLT preparatif fase normal (pTLC) menggunakan benzene−CH2Cl2 (2:1) sebagai fase
bergerak. Fraksi 3 (5,50 g) dikromatografi ulang pada Cosmosil 75C18-OPN dengan pelarut
aseton−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1) untuk memberikan empat subfraksi [3-1: 84,5 mg; 3-2:
2,87 g; 3-3: 284 mg; 3-4: 1,5 g]. Subfraksi 3-2 (2,87 g) dipisahkan dengan kromatografi kolom
silika menggunakan CH2Cl2−EtOAc (9:1, 8:2, 7:3) untuk memberikan tiga subfraksi [3-2-1: 250
mg; 3-2-2: 64 mg; 3-2-3: 240 mg]. Pemurnian subfraksi 3-2-1 (250 mg) dengan KLT fase normal,
menggunakan n-heksana−EtOAc (9:1), menghasilkan senyawa 7 (15 mg) dan 8 (15 mg).
Senyawa 9 (11 mg) dan 10 (35 mg) diperoleh dari pemurnian subfraksi 3-2-2 (64 mg) dengan
KLT fase normal menggunakan n-heksana−EtOAc (9:1). Pemurnian subfraksi 3–2-3 (240 mg)
dengan KLT fase normal, menggunakan n-heksana−EtOAc (9:1), menghasilkan senyawa 2 (9,7
mg), 11 (2,0 mg), dan 12 (2,1 mg). Fraksi 4 (5,34 g) dikromatografi ulang pada Cosmosil 75C18-
OPN dengan pelarut aseton−MeCN−MeOH−H2O (2:1:1:1) untuk memberikan tiga subfraksi [4-
1: 94 mg; 4-2: 429 mg; 4-3: 1,15 g]. Pemisahan subfraksi 4-2 (429 mg) dengan kromatografi
kolom silika menggunakan n-heksana−EtOAc (4:1), diikuti dengan KLT fase balik menggunakan
MeOH−H2O (9:1), menghasilkan senyawa 1 (2,0 mg) dan 13 (15 mg). Subfraksi 4-3 (1,15 g)
dikromatografi ulang pada kolom silika, menggunakan n-heksana−aseton (9:1, 7:1, 4:1), untuk
memberikan tiga subfraksi [4-3-1: 385 mg; 4-3-2: 282 mg; 4-3-3: 238 mg]. Pemurnian lanjutan
subfraksi 4-3-2 (282 mg) dengan KLT fase normal, menggunakan n-heksana−CH2Cl2-aseston
4
385 mg; 4-3-2: 282 mg; 4-3-3: 238 mg]. Further purification of subfraction 4-3-2 (282 g)
by normal-phase pTLC, using n-hexane−CH2Cl2-acetone (1:1:0.1), yielded 3 (2 mg), 14
(1.5 mg), 15 (2.0 mg), 4 (2.0 mg), 16 (6.0 mg), and 17 (6.3 mg).
12 β-Hydroxy-15-norlabda-8(17),13(14)-dien-16-oic acid (1): colorless oil; [α]25 D +14(c
0.1, CHCl3); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (3.77) nm; IR (KBr) νmax 3445, 2932, 1705,
1680 cm C NMR data, see Table 1; EIMS m/z 306 [M] – 11 13; H and + (4); HREIMS m/z
306.2186 [M] + (calcd. for C19H30O3: 306.2195). (E)-15-Ethoxy-15-methoxylabda-
8(17),12-dien-16-al (2): colorless oil; [ α] 25 D +11(c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log
ε) 227 (4.03) nm; IR (KBr) νmax 2930, 1745, 1677, 1461, 1364, 1255, 1120 cm – 1 1 ; H
and 13 (5); HREIMS m/z 362.2823 [M] C NMR data, see Table 2; EIMS m/z 362 [M] + +
(calcd. for C23H38O3: 362.2821). (E)-15 α-Ethoxy-14 α-hydroxylabda-8(17),12-dien-16-
olide (3): col- orless oil; [α] 25 D + 103 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (3.91)
nm; IR (KBr) νmax 3469, 2935, 2386, 1767, 1657, 1461, 1341, 1194 cm – 1 1 13 ; H and C
NMR data, see Table 2; EIMS m/z 362 [M] + (7); HREIMS m/z 362.2459 [M] + (calcd. for
C22H34O4: 362.2457). 15-Ethoxy-12 β-hydroxylabda-8(17),13(14)-dien-16,15-olide (4):
colorless oil; [α] 25 D +39(c 0.1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 225 (4.08) nm; IR (KBr)
νmax 3449, 2932, 1745, 1677, 1460, 1336, 1125, 1037 cm – 1 1 13 ; H and C NMR data,
see Table 3; EIMS m/z 362 [M] + (7); HREIMS m/z 362.2451 [M] + (calcd. for C22H34O4:
362.2457).
In vitro antiproliferative activity
The in vitro antiproliferative activities of the crude extracts and the isolated compounds
against the A549 (human lung cancer), HeLa (human cervix cancer), MCF7 (human
breast cancer), and PANC-1 and PSN-1 (human pancreatic cancer) cell lines were
evaluated by the procedure described previously [27]. Briefly, each cell line was seeded
in 96-well plates (2 × 10 3 per well) and cultured in either α-Minimum
Essential Medium ( α-MEM) or Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) at 37 °C,
under a 5% CO2 and 95% air atmosphere for 24 h. αMEM with L-glutamine and phenol
red (Wako) was used for the A549, HeLa, and MCF7 cell lines, and DMEM was used for
the PANC-1 and PSN-1 cell lines. All media were supplemented with 10% fetal bovine
serum (FBS, Sigma) and 1% antibiotic antimycotic solution (Sigma). The medium for the
A549 cells was supplemented with 1% 0.1 mM nonessential amino acids (NEAA, Gibco),
and that for the HeLa and MCF7 cells contained 1% 0.1 mM non-essential amino acids
(1:1:0.1), menghasilkan senyawa 3 (2 mg), 14 (1,5 mg), 15 (2,0 mg), 4 (2,0 mg), 16 (6,0 mg),
dan 17 (6,3 mg).
12 β-Hydroxy-15-norlabda-8(17),13(14)-dien-16-oic acid (1): cairan tak berwarna; [α]25 D
+14(c 0,1, CHCl3); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (3,77) nm; IR (KBr) νmax 3445, 2932, 1705,
1680 cm. Data NMR C, lihat Tabel 1; EIMS m/z 306 [M] – 11 13; H dan + (4); HREIMS m/z
306.2186 [M] + (dihitung untuk C19H30O3: 306.2195). (E)-15-Ethoxy-15-methoxylabda-
8(17),12-dien-16-al (2): cairan tak berwarna; [ α] 25 D +11(c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log
ε) 227 (4,03) nm; IR (KBr) νmax 2930, 1745, 1677, 1461, 1364, 1255, 1120 cm – 1 1 ; H dan 13
(5); HREIMS m/z 362.2823 [M] C, lihat Tabel 2; EIMS m/z 362 [M] + + (dihitung untuk
C23H38O3: 362.2821). (E)-15 α-Ethoxy-14 α-hydroxylabda-8(17),12-dien-16-olide (3): cair-
atau bau; [α] 25 D +103 (c 0,1, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (3,91) nm; IR (KBr) νmax
3469, 2935, 2386, 1767, 1657, 1461, 1341, 1194 cm – 1 1 13 ; H dan C, lihat Tabel 2; EIMS m/z
362 [M] + (7); HREIMS m/z 362.2459 [M] + (dihitung untuk C22H34O4: 362.2457). 15-Ethoxy-
12 β-hydroxylabda-8(17),13(14)-dien-16,15-olide (4): cairan tak berwarna; [α] 25 D +39(c 0,1,
MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 225 (4,08) nm; IR (KBr) νmax 3449, 2932, 1745, 1677, 1460,
1336, 1125, 1037 cm – 1 1 13 ; H dan C, lihat Tabel 3; EIMS m/z 362 [M] + (7); HREIMS m/z
362.2451 [M] + (dihitung untuk C22H34O4: 362.2457).
Aktivitas antiproliferatif in vitro
Kegiatan antiproliferasi in vitro dari ekstrak kasar dan senyawa yang diisolasi terhadap garis sel
A549 (kanker paru-paru manusia), HeLa (kanker leher rahim manusia), MCF7 (kanker payudara
manusia), serta garis sel kanker pankreas manusia PANC-1 dan PSN-1 dievaluasi dengan
prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya [27]. Singkatnya, setiap garis sel ditanam dalam
piring sumuran 96 lubang (2 × 10 3 per lubang) dan dibiakkan dalam Medium α-Minimum
Essential ( α-MEM) atau Medium Dulbecco's Modified Eagle (DMEM) pada suhu 37 °C, di
bawah atmosfer 5% CO2 dan 95% udara selama 24 jam. α-MEM dengan L-glutamin dan fenol
merah (Wako) digunakan untuk garis sel A549, HeLa, dan MCF7, sedangkan DMEM digunakan
untuk garis sel PANC-1 dan PSN-1. Semua media dilengkapi dengan 10% serum fetal bovin
(FBS, Sigma) dan 1% larutan antibiotik antijamur (Sigma). Media untuk sel A549 dilengkapi
dengan 1% asam amino nonesensial 0,1 mM (NEAA, Gibco), dan media untuk sel HeLa dan
MCF7 mengandung 1% asam amino nonesensial 0,1 mM (NEAA, Gibco) dan 1% piruvat
5
 (NEAA, Gibco) and 1% 1 mM sodium pyruvate (Gibco). After the cells were washed natrium 1 mM (Gibco). Setelah sel-sel dicuci dengan PBS (Nissui Pharmaceuticals), dilakukan
with PBS (Nissui Pharmaceuticals), serial dilutions of the samples to be tested were pengenceran berturut-turut dari sampel yang akan diuji. Setelah inkubasi selama 72 jam, sel-
added. After 72 h incubation, the cells were washed with PBS, and 100 μLof α-MEM or sel dicuci dengan PBS, dan 100 μL α-MEM atau DMEM yang mengandung 10% larutan kit
DMEM containing 10% WST-8 cell counting kit solution (Dojindo; Kumamoto, Japan) was penghitungan sel WST-8 (Dojindo; Kumamoto, Jepang) ditambahkan ke dalam lubang. Setelah
added to the wells. After 2 h incubation, the absorbance at 450 nm was measured. The inkubasi selama 2 jam, absorbansi pada 450 nm diukur. Konsentrasi pengenceran berturut-
concentrations of the serial dilutions of the tested samples were 100−10 μg/mL for the turut dari sampel yang diuji adalah 100-10 μg/mL untuk ekstrak kasar, 100-1 μM untuk
crude extract, 100−1 μM for the isolated compounds, and 20−1 μM for the positive senyawa yang diisolasi, dan 20-1 μM untuk kontrol positif, masing-masing.
control, respectively.
4 BAGAN ALIR ISOLASI

PPt

6
1. Title Phytochemical and pharmacological evaluation of methanolic extracts
of Etlingera fimbriobracteata (Zingerberaceae)
Jurnal South African Journal of Botany 121 (2019) 45–53
Publisher Elsevier
Author A.F.M. Shahid-Ud-Daula,M.A.A.Kuyah, A.S. Kamariah, L.B.L.Lim, N.Ahmad
2 ABSTRACT
Etlingera species are widely used traditionally as cooking herbs for their medicinal
properties and also used as cosmetics by different ethnic communities in Borneo. This
study investigated the bioactive potential of methanolic extracts of leaves, stems and
rhizomes of Etlingera fimbriobracteata. Standard methods were applied to detect the
presence of phytochemicals and to determine the phenolic content in methanolic
extracts of leaves, stems and rhizomes of E. fimbriobracteata. Plant extracts were
subjected to antioxidant (DPPH, ABTS, reducing power assay, ferric-reducing antioxidant
power and total antioxidant capacity) and antimicrobial (disc diffusion) evaluations.
Antidiabetic (for 4 weeks using Wistar rats) and anticancer (MTT assay) activities were
also determined for leaves extract of E. fimbriobracteata. Phytochemicals screening
revealed the presence of steroids, cardiac glycosides and saponins. Leaves extract
showed the highest amount of polyphenolic compounds and antioxidant activity than
those of stems and rhizomes. A significant correlation (p b 0.01) was observed between
the phenolic compounds (TPC, TFC, and TFlC) and antioxidant activity. The plant extracts
showed weak inhibition against Gram-positive bacteria but resistance against Gram-
negative bacteria and selected fungi. Leaves extract did not show any significant
reduction in the blood sugar level of treated rats. However, it showed moderate activity
against the human cervical cancer cell line (CasKi) with IC50 value of 106.21 μg/mL. The
antioxidant and anticancer activities of leaves extract of E. fimbriobracteata indicate its
potential usage in the treatment of free radical induced diseases and cancer.
3 INTRODUCTION
The genus Etlingera consists of terrestrial and perennial herbs in the ginger family,
Zingiberaceae. More than 100 different species are found predominantly close to the
equator and at least 40 species are known in the rain forests of Borneo (Poulsen, 2006).
Eighty-five percent of the 40 species are endemics to Borneo and 33% are found in
Evaluasi fitokimia dan farmakologi ekstrak metanol Etlingera fimbriobracteata
(Zingerberaceae)
ABSTRAK
Etlingera species digunakan secara luas sebagai bahan masakan tradisional karena sifat-sifat
obatnya dan juga digunakan sebagai kosmetik oleh berbagai komunitas etnis di Borneo. Studi
ini meneliti potensi bioaktif dari ekstrak metanol daun, batang, dan rimpang Etlingera
fimbriobracteata. Metode standar diterapkan untuk mendeteksi keberadaan fitokimia dan
menentukan kandungan fenolik dalam ekstrak metanol daun, batang, dan rimpang E.
fimbriobracteata. Ekstrak tanaman dikenakan evaluasi antioksidan (DPPH, ABTS, uji daya
reduksi, daya antioksidan reduktor besi dan kapasitas antioksidan total) dan antimikroba
(difusi cakram). Aktivitas antidiabetes (selama 4 minggu menggunakan tikus Wistar) dan
antikanker (uji MTT) juga ditentukan untuk ekstrak daun E. fimbriobracteata. Skrining fitokimia
mengungkapkan keberadaan steroid, glikosida jantung, dan saponin. Ekstrak daun
menunjukkan jumlah senyawa polifenolik dan aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan
dengan batang dan rimpang. Korelasi yang signifikan (p b 0,01) diamati antara senyawa fenolik
(TPC, TFC, dan TFlC) dan aktivitas antioksidan. Ekstrak tanaman menunjukkan penghambatan
yang lemah terhadap bakteri Gram-positif tetapi resisten terhadap bakteri Gram-negatif dan
jamur terpilih. Ekstrak daun tidak menunjukkan penurunan yang signifikan dalam kadar gula
darah tikus yang diobati. Namun, ekstrak daun menunjukkan aktivitas sedang terhadap garis
sel kanker serviks manusia (CasKi) dengan nilai IC50 sebesar 106,21 μg/mL. Aktivitas
antioksidan dan antikanker ekstrak daun E. fimbriobracteata menunjukkan potensi
penggunaannya dalam pengobatan penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas dan kanker.
PENDAHULUAN
Genus Etlingera terdiri dari tanaman herbal daratan dan abadi dalam keluarga jahe,
Zingiberaceae. Lebih dari 100 spesies yang berbeda ditemukan terutama dekat garis
khatulistiwa, dan setidaknya 40 spesies dikenal di hutan hujan Borneo (Poulsen, 2006).
Delapan puluh lima persen dari 40 spesies tersebut endemik di Borneo dan 33% ditemukan di
7
Brunei Darussalam. Etlingera species are widely used by different communities in
Borneo for various purposes such as food, condiments, medicines, cosmetics and
ornaments (Lachumy et al., 2010). The inner sheaths of leafy shoots of E. coccinea, E.
elatior, E. littoralis, E. sessilanthera, E. velutina and E. rubromarginata, fruits of E.
littoralis and flowers of E. elatior and E. maingayi, are consumed as condiments, eaten
raw or cooked in Malaysia, Brunei and Thailand (Poulsen, 2006). More specialized uses
include the rhizomes of E. baramensis as perfume, fruits of E.elatior and E.
pyramidosphaera as shampoo, and rhizomes of E. punica as spice. Leaves of E.
brevilabrum and E. elatior are used as medicine in children against long-lasting fever and
cleaning wounds, respectively (Poulsen, 2006). The people of Borneo also use E.
brevilabrum externally in the treatment of skin problems and itchiness (sheaths are
rubbed on to the affected area) and sore eyes (juice of young shoots made into eye
drops). Several other species of Etlingera (E. foetens, E. belalongensis, E. elatior, E.
brevilabrum, E. pyramidosphaera, E. sessilanthera and E. pyramidosphaera) have also
been used as medicine in the treatment of a variety of health problems such as
rheumatism, jaundice, urinary ailments, headache, stomach-ache, snake bite and
diarrhea (Poulsen, 2006).
Despite many traditional uses and medicinal claims of different species of Etlingera, very
few scientific studies have been carried out to validate these claims. Our study here
focused on E. fimbriobracteata (K. Schum.) R.M. Sm. Until now, there had not been any
published reports concerning the phytochemical characterization and biological
activities of this species. Etlingera fimbriobracteata is a proto-terrestrial giant ginger
confined to river banks of Sg. Temburong and Sg. Belalong, Brunei Darussalam. This
species is locally known as ‘tukung or layun’ (by Ibans and Kelabits) and reported as an
endemic plant in Sarawak and Brunei (Poulsen, 2006). Their inflorescences arise from
the rhizomes near the base, embedded in the soil, with numerous yellow flowers.
According to Pederson (2004), this species is pollinated by the little spider hunter
(Arachnothera longirostra). Both the leaves which are strongly scented and stems
constitute very important ingredients in local cooking. Young shoots and young
inflorescences are eaten as vegetables by indigenous communities in Borneo. Ripe fruits
can be eaten raw and has a sweet-sour taste. Their leaves are used to wrap rice, while
Brunei Darussalam. Spesies Etlingera secara luas digunakan oleh berbagai komunitas di Borneo
untuk berbagai tujuan seperti makanan, bumbu, obat-obatan, kosmetik, dan hiasan (Lachumy
et al., 2010). Selubung dalam tunas daun E. coccinea, E. elatior, E. littoralis, E. sessilanthera, E.
velutina, dan E. rubromarginata, buah E. littoralis, serta bunga E. elatior dan E. maingayi,
dikonsumsi sebagai bumbu, dimakan mentah atau dimasak di Malaysia, Brunei, dan Thailand
(Poulsen, 2006). Penggunaan khusus lainnya termasuk rimpang E. baramensis sebagai parfum,
buah E. elatior dan E. pyramidosphaera sebagai sampo, dan rimpang E. punica sebagai
rempah. Daun E. brevilabrum dan E. elatior digunakan sebagai obat pada anak-anak untuk
mengatasi demam yang berkepanjangan dan membersihkan luka, secara berurutan (Poulsen,
2006). Orang-orang di Borneo juga menggunakan E. brevilabrum secara eksternal untuk
mengobati masalah kulit dan gatal-gatal (selubungnya digosokkan ke daerah yang terkena) dan
mata yang bengkak (jus tunas muda dibuat tetes mata). Beberapa spesies Etlingera lainnya (E.
foetens, E. belalongensis, E. elatior, E. brevilabrum, E. pyramidosphaera, E. sessilanthera, dan
E. pyramidosphaera) juga telah digunakan sebagai obat dalam pengobatan berbagai masalah
kesehatan seperti rematik, penyakit kuning, gangguan saluran kemih, sakit kepala, sakit perut,
sengatan ular, dan diare (Poulsen, 2006).
Meskipun banyak penggunaan tradisional dan klaim pengobatan dari berbagai spesies
Etlingera, sangat sedikit penelitian ilmiah yang telah dilakukan untuk memvalidasi klaim-klaim
ini. Studi kami di sini difokuskan pada E. fimbriobracteata (K. Schum.) R.M. Sm. Hingga saat ini,
belum ada laporan yang diterbitkan mengenai karakterisasi fitokimia dan aktivitas biologis
spesies ini. Etlingera fimbriobracteata adalah jahe raksasa proto-terestrial yang terbatas pada
tepian sungai Sg. Temburong dan Sg. Belalong, Brunei Darussalam. Spesies ini dikenal secara
lokal sebagai 'tukung atau layun' (oleh suku Iban dan Kelabit) dan dilaporkan sebagai tanaman
endemik di Sarawak dan Brunei (Poulsen, 2006). Bunga-bunganya muncul dari rimpang dekat
pangkal, tertanam di dalam tanah, dengan banyak bunga kuning. Menurut Pederson (2004),
spesies ini dibuahi oleh burung madu kecil (Arachnothera longirostra). Baik daun yang berbau
kuat maupun batangnya merupakan bahan penting dalam masakan lokal. Tunas muda dan
bunga muda dimakan sebagai sayuran oleh komunitas pribumi di Borneo. Buah yang masak
dapat dimakan mentah dan memiliki rasa manis-asam. Daun mereka digunakan untuk
membungkus nasi, sedangkan selubung daun digunakan secara luas untuk membuat tikar.
8
 the leaf sheaths are widely used for making mats.
The present study was carried out to determine the phytoconstituents and evaluate the
antioxidant, antimicrobial, antidiabetic and anticancer activities of methanolic extracts
of leaves, stems and rhizomes of E. fimbriobracteata.
4 METHODS
Plant material
The leaves, stems and rhizomes of E. fimbriobracteata were collected from the riverine
forest of Sg. Temburong, Temburong District, Brunei Darussalam in April 2013. The plant
specimen was identified by Dr.Kamariah Abu Salim (of Universiti Brunei Darussalam) and
authenticated by Dr. Axel Poulsen (of the University of Oslo). A voucher specimen (No.
SUD 02) and spirit collection of the flowers (No. SUD 02) were deposited in the Universiti
Brunei Darussalam Herbarium (UBDH) and the National Herbarium of Brunei Darussalam
(BRUN).
Determination of moisture content
Different parts of E. fimbriobracteata were subjected to two different drying methods,
i.e., oven drying and freeze drying method. For each drying method, 20 g of each sample
(leaves, stems and rhizomes) were spread out evenly in a sample boat. Drying was
carried out separately in an oven at 60 °C and a freeze dryer under vacuum until
constant weight was obtained. The moisture content in percentage was then
determined and recorded.
Preparation of the methanol extracts
After freeze drying, the dried materials were ground to a fine powder using a laboratory
mill. The plant samples (30 g) were extracted with 250 mL methanol using soxhlet
apparatus for 6–8 h. The extracts were evaporated to dryness under reduced pressure
at 40 °C using a rotary evaporator. The crude extracts were then dried in a freeze dryer
and stored in desiccators at 4 °C until use. The extract recovery was expressed as
milligram of extract per gram of freeze dried plant material.
Phytochemical screening
The plant extracts were subjected to different chemical tests to determine the
phytoconstituent contents such as alkaloids, cardiac glycosides, steroids, saponins and
Studi ini dilakukan untuk menentukan fitokonstituen dan mengevaluasi aktivitas antioksidan,
antimikroba, antidiabetes, dan antikanker dari ekstrak metanol daun, batang, dan rimpang E.
fimbriobracteata.
METODE
Bahan tanaman
Daun, batang, dan rimpang E. fimbriobracteata dikumpulkan dari hutan tepi sungai di Sg.
Temburong, Distrik Temburong, Brunei Darussalam pada bulan April 2013. Spesimen tanaman
diidentifikasi oleh Dr. Kamariah Abu Salim (dari Universiti Brunei Darussalam) dan diautentikasi
oleh Dr. Axel Poulsen (dari Universitas Oslo). Spesimen voucher (No. SUD 02) dan koleksi
bunga (No. SUD 02) disimpan di Herbarium Universiti Brunei Darussalam (UBDH) dan
Herbarium Nasional Brunei Darussalam (BRUN).
Penentuan kadar air
Berbagai bagian dari E. fimbriobracteata diuji dengan dua metode pengeringan yang berbeda,
yaitu pengeringan oven dan metode pengeringan beku. Untuk setiap metode pengeringan, 20
g dari masing-masing sampel (daun, batang, dan rimpang) disebar merata dalam sebuah
wadah sampel. Pengeringan dilakukan secara terpisah dalam oven pada suhu 60 °C dan
pengering beku di bawah tekanan hingga diperoleh berat yang konstan. Kemudian, kandungan
kelembaban dalam persentase ditentukan dan dicatat.
Persiapan ekstrak metanol
Setelah pengeringan beku, bahan-bahan yang telah dikeringkan dihaluskan menjadi bubuk
halus menggunakan mesin laboratorium. Sampel tanaman (30 g) diekstraksi dengan 250 mL
metanol menggunakan alat soxhlet selama 6-8 jam. Ekstrak kemudian diuapkan hingga kering
di bawah tekanan rendah pada suhu 40 °C menggunakan evaporator rotari. Ekstrak mentah
kemudian dikeringkan lagi dengan pengering beku dan disimpan dalam desikator pada suhu 4
°C hingga digunakan. Pemulihan ekstrak diungkapkan sebagai miligram ekstrak per gram
material tanaman yang dikeringkan beku.
Skrining fitokimia
Ekstrak tanaman telah menjalani berbagai tes kimia yang berbeda untuk menentukan
kandungan fitokonstituen seperti alkaloid, glikosida jantung, steroid, saponin, dan antrakuinon
9
anthraquinones according to the method described by Sofowora (1996) and Evans
(2009).
Determination of the amount of phenolic compounds
A. Total phenolic content (TPC)
The TPC was determined spectrophotometrically, using Folin–Ciocalteu reagent
according to the method described by Shahid-Ud-Daula et al. (2015).
B. Total flavonoid content (TFC)
The TFC was determined using the method described by Lin and Tang (2007) with some
modifications. An aliquot of 0.5 mL of the extract was mixed with 1.5 mL of methanol
(95%), 0.1 mL of aluminum chloride hexahydrate (10%), 0.1 mL of potassium acetate (1
M) and 2.8 mL of distilled water. The solution was thoroughly mixed and the absorbance
was measured at 415 nm using a UV-spectrophotometer. Results were expressed as mg
of quercetin equivalent per gram of dry extract (mg QE/g) and calculated from a
calibration curve of quercetin in the concentration range of 0–50 μg/mL.
C. Determination of total flavonol content (TFlC)
The TFlC was determined according to the method described by Kumaran and Joel
Karunakaran (2007). The results were expressed as mg of quercetin equivalent per gram
of dry extract (mg QE/g), determined by extrapolating the standard calibration curve of
Quercetin (0–50 μg/mL).
Antioxidant assays
A. DPPH radical scavenging activity
The scavenging activity of DPPH radical was measured according to the method
described by Cavar et al. (2012) with some modifications. An aliquot of 3 mL DPPH (0.1
mM) solution prepared in methanol was added to 300 μL of various concentrations (5–
500 μg/mL) of methanolic extracts of leaves, stems and rhizomes. The reaction mixtures
were left to react in the dark for 30 min at room temperature and the absorbance was
measured at 517 nm. Ascorbic acid and BHT (same concentration as plant extracts) were
used as standards and were subjected to the same procedure for comparison. The DPPH
radical scavenging activity or inhibitory concentration (IC) was calculated using the
following equation: IC (%) = [(A0 − As)/A0]×100,where,A0 is the absorbance value of
control and As is the absorbance of test sample. The % inhibition of both standards and
test samples were calculated for each concentration and graphs of % inhibition against
sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Sofowora (1996) dan Evans (2009).
Penentuan jumlah senyawa fenolik
A. Kandungan fenolik total (TPC)
TPC ditentukan secara spektrofotometri, menggunakan reagen Folin-Ciocalteu sesuai dengan
metode yang dijelaskan oleh Shahid-Ud-Daula dkk. (2015).
B. Kandungan flavonoid total (TFC)
TFC ditentukan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lin dan Tang (2007) dengan
beberapa modifikasi. Aliquot sebanyak 0,5 mL dari ekstrak dicampur dengan 1,5 mL metanol
(95%), 0,1 mL aluminium klorida heksahidrat (10%), 0,1 mL kalium asetat (1 M), dan 2,8 mL air
destilasi. Larutan tersebut dicampur dengan baik dan absorbansinya diukur pada panjang
gelombang 415 nm menggunakan spektrofotometer UV. Hasilnya diungkapkan sebagai mg
setara quercetin per gram ekstrak kering (mg QE/g) dan dihitung dari kurva kalibrasi quercetin
dalam rentang konsentrasi 0-50 μg/mL.
C. Penentuan kandungan flavonol total (TFlC)
TFlC ditentukan sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Kumaran dan Joel Karunakaran
(2007). Hasilnya diungkapkan sebagai mg setara quercetin per gram ekstrak kering (mg QE/g),
yang ditentukan dengan ekstrapolasi kurva kalibrasi standar quercetin (0-50 μg/mL).
Tes antioksidan
A. Aktivitas penangkapan radikal DPPH
Aktivitas penangkapan radikal DPPH diukur sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Cavar
dkk. (2012) dengan beberapa modifikasi. Aliquot sebanyak 3 mL larutan DPPH (0,1 mM) yang
disiapkan dalam metanol ditambahkan ke 300 μL berbagai konsentrasi (5–500 μg/mL) ekstrak
metanol dari daun, batang, dan rimpang. Campuran reaksi dibiarkan bereaksi dalam kegelapan
selama 30 menit pada suhu ruangan, dan absorbansinya diukur pada panjang gelombang 517
nm. Asam askorbat dan BHT (dengan konsentrasi yang sama dengan ekstrak tanaman)
digunakan sebagai standar dan menjalani prosedur yang sama untuk perbandingan. Aktivitas
penangkapan radikal DPPH atau konsentrasi inhibisi (IC) dihitung menggunakan persamaan
berikut: IC (%) = [(A0 - As)/A0] × 100, di mana A0 adalah nilai absorbansi kontrol dan As adalah
absorbansi sampel uji. Persentase inhibisi dari standar dan sampel uji dihitung untuk setiap
konsentrasi dan grafik persentase inhibisi terhadap konsentrasi dibuat. Dari grafik ini,
1
0
concentration were plotted. From these graphs, the concentrations that reduce the
absorption of DPPH solution by 50% (IC) were calculated.
B. ABTS-free radical scavenging activity
•+
ABTS radical cation (ABTS ) scavenging activity of the extracts was performed according
to the procedure described by Ahmad et al. (2013) with minor modifications. The ABTS
solution was prepared by mixing equal volume of ABTS (7 mM) and potassium
persulfate (2.45 mM) and stored in the dark at room temperature for 12 h. Prior to use,
the solution was diluted with methanol (1:50) to get an absorbance of 0.706 ± 0.01 at
734 nm. An aliquot of 300 μL of various concentrations of extracts (5–500 μg/mL) or
negative control (absolute methanol) was added to 3 mL of ABTS solution. After
incubation for 6 min in the dark, the absorbance of the mixture was read at 734 nm. The
radical scavenging activity was expressed as the inhibition concentration in percentage
(IC%) and calculated using the following equation: Scavenging activity (IC%) = (1 – As/Ac) × 100, di mana As adalah absorbansi ekstrak dan Ac adalah absorbansi kontrol. Nilai IC50 yang
× 100, where As is the absorbance of extract and Ac is the absorbance of control. The
IC50 value which was expressed as the concentration of the sample required to cause
50% inhibition of the ABTS•+ radicals was determined from the graph of scavenging
activity against concentration. Ascorbic acid and BHT (same concentration as plantC. Uji daya reduksi (RPA)
extracts) were used as standards.
C. Reducing power assay (RPA)
The reducing power of plant extracts was determined by the method described by
Shahid-Ud-Daula et al. (2015).
D. FRAP (ferric-reducing antioxidant power) assay
The ferric reducing ability of the extracts was estimated based on the method of Karim
et al. (2014) with some modifications. FRAP reagent was freshly prepared by mixing 100
mL of acetate buffer (300 mM, pH 3.6), 10 mL of TPTZ solution (10 mM TPTZ in 40 mM
hydrochloric acid) and 10 mL ferric chloride heptahydrate (20 mM) in a ratio of 10:1:1.
An aliquot of 0.3 mL of various concentrations (5-500 μg/mL) of extracts or absolute
methanol (the blank) was mixed with 3 mL of FRAP reagent and allowed to react for 30
min in the dark. The TPTZ (ferrous tripyridyltriazine complex) was then measured at 593
nm. The value EC50 was determined as the concentration of each sample required to
give 0.5 absorbance. The antioxidant potential of the plant extract was compared with
those of standards, ascorbic acid and BHT, at the same concentration. absorbance of the
konsentrasi yang mengurangi absorbsi larutan DPPH sebesar 50% (IC) dihitung.
B. Aktivitas penangkapan radikal bebas ABTS
Aktivitas penangkapan radikal kation ABTS (ABTS•+) dari ekstrak dilakukan sesuai dengan
prosedur yang dijelaskan oleh Ahmad dkk. (2013) dengan sedikit modifikasi. Larutan ABTS
disiapkan dengan mencampurkan volume yang sama dari ABTS (7 mM) dan kalium persulfat
(2,45 mM) dan disimpan dalam kegelapan pada suhu ruangan selama 12 jam. Sebelum
digunakan, larutan ini diencerkan dengan metanol (1:50) hingga mendapatkan absorbansi
sekitar 0,706 ± 0,01 pada 734 nm. Aliquot sebanyak 300 μL berbagai konsentrasi ekstrak (5–
500 μg/mL) atau kontrol negatif (metanol murni) ditambahkan ke 3 mL larutan ABTS. Setelah
diinkubasi selama 6 menit dalam kegelapan, absorbansi campuran dibaca pada 734 nm.
Aktivitas penangkapan radikal ini diungkapkan sebagai konsentrasi inhibisi dalam persentase
(IC%) dan dihitung menggunakan persamaan berikut: Aktivitas penangkapan (IC%) = (1 - As/Ac)
menyatakan konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menyebabkan inhibisi 50% radikal
ABTS•+ ditentukan dari grafik aktivitas penangkapan terhadap konsentrasi. Asam askorbat dan
BHT (dengan konsentrasi yang sama dengan ekstrak tanaman) digunakan sebagai standar.
Daya reduksi ekstrak tanaman ditentukan dengan metode yang dijelaskan oleh Shahid-Ud-
Daula dkk. (2015).
D. Uji FRAP (ferric-reducing antioxidant power)
Kemampuan reduksi besi (FRAP) dari ekstrak diestimasi berdasarkan metode yang
dikembangkan oleh Karim dkk. (2014) dengan beberapa modifikasi. Reagen FRAP disiapkan
secara segar dengan mencampurkan 100 mL larutan buffer asetat (300 mM, pH 3,6), 10 mL
larutan TPTZ (10 mM TPTZ dalam 40 mM asam hidroklorida) dan 10 mL heptahidrat klorida
besi (20 mM) dalam rasio 10:1:1. Aliquot sebanyak 0,3 mL dari berbagai konsentrasi (5-500
μg/mL) ekstrak atau metanol murni (blank) dicampur dengan 3 mL reagen FRAP dan dibiarkan
bereaksi selama 30 menit dalam kegelapan. Kemudian, TPTZ (kompleks besi ferus
tripiridiltriazin) diukur pada panjang gelombang 593 nm. Nilai EC50 ditentukan sebagai
konsentrasi sampel yang diperlukan untuk menghasilkan absorbansi 0,5. Potensi antioksidan
ekstrak tanaman dibandingkan dengan standar, asam askorbat dan BHT, pada konsentrasi
yang sama.
1
1
blue colored Fe2+
E. Total antioxidant capacity (TAC)
The TAC of the plant extract was evaluated using the phosphomolybdenum assay
described by Saeed et al. (2012).Analiquot of 0.3 mL of methanolic extracts (1 mg/mL)
was mixed with 3 mL of reagent solution (0.6 M sulfuric acid, 28 mM sodium phosphate
and 4 mM ammonium molybdate). The reaction mixture was incubated at 95 °C for 90
min in a water bath and a green color developed. The mixture was cooled to room
temperature and the absorbance was measured against a blank (absolute methanol) at
695 nm. The antioxidant activity of the extract was expressed as mg of ascorbic acid
equivalent per g of dry extract (mg AE/g).
Determination of antimicrobial activity
A. Microorganisms
The antimicrobial activity of plant extracts was tested against nine different
microorganisms. Two Gram-negative strains (Escherichia coli ATCC 25922 and
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853) and three Gram-positive strains (Bacillus subtilis
ATCC 6633, Bacillus spizizenii ATCC 6633 and Staphylococcus aureus ATCC 25923) were
used. All bacterial strains were purchased from BioMérieux, Inc., Durhum, North
Carolina, USA. In antifungal assay, four species of fungi (Candida albicans ATCC 10231,
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton rubrum ATCC 28188 and
Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763) obtained commercially from Oxide Limited,
Basingstoke, Hampshire, England, were used as test microorganisms.v
B. Disc diffusion assay
The agar diffusion technique described by Jorgensen et al. (1999) was used for the
determination of antimicrobial activity of the plant extracts. All bacteria and fungi were
cultured stationarily (except for B. subtilis and B. spizizenii where shaking was needed)
from respective stocks into the appropriate broth (nutrient agar for all bacteria,
sabouraud dextrose agar for C. albicans & S. cerevisiae, and potato dextrose agar for A.
brasiliensis and T. rubrum) and incubated at 37 °C for 24 h and 25 °C for 48 h,
respectively. Suspension of each microbial species was then adjusted to an optical
density of McFarland Standard 0.5 and spread uniformly over the surface of agar plates
with the respective growth medium. Sterile paper discs (of 6 mm diameter and made
from Whatman No. 1 filter) impregnated with 10 μL of methanol extracts were carefully
E. Kapasitas antioksidan total (TAC)
TAC dari ekstrak tanaman dievaluasi menggunakan uji fosfomolibdenum yang dijelaskan oleh
Saeed dkk. (2012). Aliquot sebanyak 0,3 mL ekstrak metanol (1 mg/mL) dicampur dengan 3 mL
larutan reagen (0,6 M asam sulfat, 28 mM natrium fosfat, dan 4 mM amonium molibdat).
Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 95 °C selama 90 menit dalam bak air dan menghasilkan
warna hijau. Campuran kemudian didinginkan ke suhu ruangan, dan absorbansinya diukur
terhadap blanko (metanol murni) pada panjang gelombang 695 nm. Aktivitas antioksidan
ekstrak diungkapkan sebagai mg setara asam askorbat per g ekstrak kering (mg AE/g).
Penentuan aktivitas antimikroba
A. Mikroorganisme
Aktivitas antimikroba ekstrak tanaman diuji terhadap sembilan mikroorganisme berbeda. Dua
jenis mikroba Gram-negatif (Escherichia coli ATCC 25922 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853) dan tiga jenis mikroba Gram-positif (Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus spizizenii ATCC
6633, dan Staphylococcus aureus ATCC 25923) digunakan. Semua jenis bakteri dibeli dari
BioMérieux, Inc., Durham, North Carolina, Amerika Serikat. Dalam uji antijamur, empat spesies
jamur (Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton
rubrum ATCC 28188, dan Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763) yang diperoleh secara
komersial dari Oxide Limited, Basingstoke, Hampshire, Inggris, digunakan sebagai
mikroorganisme uji.
B. Uji difusi cakram
Teknik difusi agar yang dijelaskan oleh Jorgensen dkk. (1999) digunakan untuk menentukan
aktivitas antimikroba ekstrak tanaman. Semua bakteri dan jamur dikultur secara stasioner
(kecuali untuk B. subtilis dan B. spizizenii yang memerlukan pengocokan) dari stok masing-
masing ke dalam cairan yang sesuai (nutrien agar untuk semua bakteri, sabouraud dextrose
agar untuk C. albicans & S. cerevisiae, dan potato dextrose agar untuk A. brasiliensis dan T.
rubrum) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam dan 25 °C selama 48 jam, masing-
masing. Suspensi dari setiap spesies mikroba kemudian disesuaikan dengan kekeruhan Standar
McFarland 0,5 dan disebar merata di permukaan piring agar dengan medium pertumbuhan
yang sesuai. Cakram kertas steril (berdiameter 6 mm dan terbuat dari Whatman No. 1 filter)
yang telah diberi 10 μL ekstrak metanol diletakkan dengan hati-hati di atas piring agar yang
1
2
placed on the inoculated agar plates with slight pressure. Standard antimicrobial disks of
Penicillin G (10 μg/disc), tetracycline (30 μg/disc), chloramphenicol (75 μg/disc),
gentamycin (30 μg/ disc), amphotericin B (10 μg/disc), fluconazole (10 μg/disc) and
itraconazole (10 μg/disc) were used as positive controls. Absolute methanol and
equivalent quantities of DMSO employed to dissolve the plant extracts were used as
negative controls. The plates were incubated at 37 °C for 24 h for bacterial strains and
25 °C for 48–72 h for fungi isolates. Antimicrobial activity was evaluated by measuring
the zone of inhibition including the disc (in mm) against the test organisms.
Antidiabetic activity
Experimental rats were initially allowed to fast for 12–16 h. Diabetes in these rats was
then induced by a single dose of alloxan monohydrate at 120 mg/kg via intraperitoneal
(i.p.) route. Fasting blood glucose concentration was measured after 3 days or 72 h of
injection to confirm diabetes in alloxan treated rats (De Haro-Hernández et al., 2004).
Ani- mals with fasting blood glucose level equal or above 15 mmol/L were used in the
study. These rats were further divided into four groups: I, Alloxan; II, Vehicle (1% DMSO,
5% methanol and 94% distilled water); III, Crude extract; IV, Normal or non-diabetic
control. Each group contains four rats. Alloxan intraperitoneal injections at a single
dosage of 120 mg/kg body weight were administered only to Groups I, II and III. Blood
glucose reading (mmol/L) of animals in each group was taken once every week until the
end of the 10 weeks experimental period. Animals blood glucose samples were drawn
from animals tail tips using a lancet and blood glucose readings were measured using a
glucometer. From these readings, the mean blood glucose value (mmol/L) per group
was calculated. The experimental procedure was approved by the University Research
Ethics Committee (UREC) of Universiti Brunei Darussalam (Ref. No. UBD/AVC-RI/1.21.6).
Anticancer activity
Cytotoxicity test of leaves extract of E. fimbriobracteata was carried out on cervical
cancer cells (CaSki) using the 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) assay according to themethod described by Mosmann (1983) with
modifications. Cell line was cultured in RPMI-1640 medium supplemented with 10%
fetal bovine serum (FBS). Prior to the MTT assay, cells which reached 70–80%
confluency were trypsinized. Diluted (100 μL containing approximately 10,000 cells)
suspension of trypsinized cells (1 × 105 cells/mL) were distributed into each well of 96-
telah ditanami dengan sedikit tekanan. Disk antimikroba standar seperti Penicillin G (10
μg/cakram), tetracycline (30 μg/cakram), chloramphenicol (75 μg/cakram), gentamycin (30
μg/cakram), amphotericin B (10 μg/cakram), fluconazole (10 μg/cakram), dan itraconazole (10
μg/cakram) digunakan sebagai kontrol positif. Metanol murni dan jumlah yang setara dari
DMSO yang digunakan untuk melarutkan ekstrak tanaman digunakan sebagai kontrol negatif.
Piring-piring ini diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam untuk bakteri dan 25 °C selama 48-
72 jam untuk jamur. Aktivitas antimikroba dievaluasi dengan mengukur zona hambatan
termasuk cakram (dalam mm) terhadap organisme uji.
Aktivitas antidiabetes
Tikus percobaan awalnya dibiarkan berpuasa selama 12-16 jam. Diabetes pada tikus-tikus ini
kemudian diinduksi dengan satu dosis alloxan monohidrat sebanyak 120 mg/kg melalui rute
intraperitoneal (i.p.). Konsentrasi glukosa darah puasa diukur setelah 3 hari atau 72 jam
setelah injeksi untuk mengkonfirmasi diabetes pada tikus yang diobati dengan alloxan (De
Haro-Hernández dkk., 2004). Hewan-hewan dengan kadar glukosa darah puasa yang sama
atau di atas 15 mmol/L digunakan dalam penelitian ini. Tikus-tikus ini kemudian dibagi menjadi
empat kelompok: I, Alloxan; II, Kendaraan (1% DMSO, 5% metanol, dan 94% air suling); III,
Ekstrak mentah; IV, Kelompok kontrol normal atau non-diabetes. Setiap kelompok berisi
empat tikus. Injeksi intraperitoneal alloxan dengan dosis tunggal sebanyak 120 mg/kg berat
badan hanya diberikan kepada Kelompok I, II, dan III. Pembacaan glukosa darah (mmol/L)
hewan di setiap kelompok dilakukan sekali setiap minggu hingga akhir periode percobaan
selama 10 minggu. Sampel darah glukosa hewan diambil dari ujung ekor hewan menggunakan
lancet, dan pembacaan glukosa darah diukur menggunakan glukometer. Dari pembacaan ini,
nilai rata-rata glukosa darah (mmol/L) per kelompok dihitung. Prosedur percobaan ini disetujui
oleh Komite Etika Penelitian Universiti Brunei Darussalam (No. Ref. UBD/AVC-RI/1.21.6).
Aktivitas antikanker
Uji sitotoksisitas ekstrak daun E. fimbriobracteata dilakukan pada sel kanker serviks (CaSki)
menggunakan uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) sesuai dengan
metode yang dijelaskan oleh Mosmann (1983) dengan modifikasi. Garis sel dikultur dalam
medium RPMI-1640 yang diperkaya dengan 10% serum bovin fetal (FBS). Sebelum uji MTT, sel-
sel yang mencapai 70-80% konfluensi di-tripsin. Suspensi yang diencerkan (100 μL yang
mengandung sekitar 10.000 sel) dari sel yang di-tripsin (1 × 10^5 sel/mL) didistribusikan ke
setiap sumur piring mikrotiter 96 sumur dan diinkubasi pada suhu 37 °C dalam atmosfer
1
3
well microtitre plates and incubated at 37 °C in 5% CO2 humidified air for 24 h. Then 100
μL of plant extract at different concentrations was added into each well except for the
control. The vehicle solution (100 μL) and an equal volume of the growth media
(containing 10% FBS) were added to control wells serving as vehicle control and as
untreated cells control, respectively. The cells were incubated at 37 °C in 5% CO2
incubator and subjected to MTT assay after 24, 48 and 72 h of treatment. The culture
medium (150 μL) was removed from each well and replaced with 100 μLofMTT (0.5
mg/mL) solution followed by 2 h of incubation to allow the formation of formazan
crystals. The supernatant (150 μL) from each well was then removed and 200 μL of
DMSO was added to solubilize the crystals. The absorbance of the samples and the
background absorbance were measured at 540 nm and 690 nm, respectively, using a
microplate reader. The cell viability in response to treatment was represented as the
percentage cytotoxicity which is defined as the percentage of cell death as a result of
treatment. The percentage of cytotoxicity was determined using the following formula:
Percentage of cytotoxicity =Absorbance of untreated cells−Absorbance of treated cells
Absorbance of untreated cells
X 100%
where, Absorbance of untreated cells = Abs 540 nm – Abs 690 nm.
Therefore, the percentage of cell viability was calculated as follows: Percentage of
viability = 100 % − Percentage of cytotoxicity A graph of the percentage of cell viability
against crude concentration was constructed and the IC50 values (i.e., the concentration
which inhibits growth by 50%) of the extract was determined from the graph. Values
≤20 μg/mL were considered to exhibit high inhibiting activity as suggested by the
National Cancer Institute, USA (Geran, 1972).
Statistical analyses
Experimental results were expressed as mean ± standard deviation of three parallel
measurements. Tukey's pair-wise comparison (HSD) and least significant difference
(LSD) test were performed to determine significant differences between mean values (p
b 0.05). Pearson correlation test was also performed to determine inter-relationships
among TPC, TFC, TFlC, and antioxidant activities. All analyses were conducted using
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS; IBM Corp.,Armonk, NY, USA).
terhidrasi 5% CO2 selama 24 jam. Kemudian 100 μL ekstrak tanaman pada konsentrasi yang
berbeda ditambahkan ke setiap sumur kecuali kontrol. Larutan kendaraan (100 μL) dan volume
yang sama dari media pertumbuhan (yang mengandung 10% FBS) ditambahkan ke sumur
kontrol sebagai kontrol kendaraan dan sebagai kontrol sel yang tidak diobati, masing-masing.
Sel-sel diinkubasi pada suhu 37 °C dalam inkubator 5% CO2 dan menjalani uji MTT setelah 24,
48, dan 72 jam perlakuan. Medium kultur (150 μL) dihapus dari setiap sumur dan diganti
dengan 100 μL larutan MTT (0,5 mg/mL) yang diikuti oleh inkubasi selama 2 jam untuk
memungkinkan pembentukan kristal formazan. Supernatan (150 μL) dari setiap sumur
kemudian dihapus dan ditambahkan 200 μL DMSO untuk menghilangkan kristal-kristal.
Absorbansi sampel dan absorbansi latar belakang diukur pada panjang gelombang 540 nm dan
690 nm, masing-masing, menggunakan pembaca mikroplat. Viabilitas sel sebagai respons
terhadap perlakuan diwakili sebagai sitotoksisitas persentase yang didefinisikan sebagai
persentase kematian sel akibat perlakuan. Persentase sitotoksisitas ditentukan menggunakan
rumus berikut:
Persentase sitotoksisitas = Absorbansi sel yang tidak diobati− Absorbansi sel yang diobati
Absorbansi sel yang tidak diobati
X 100%
Dimana, Absorbansi sel yang tidak diobati = Abs 540 nm - Abs 690 nm.
Oleh karena itu, persentase viabilitas sel dihitung sebagai berikut: Persentase viabilitas = 100%
- Persentase sitotoksisitas. Grafik persentase viabilitas sel terhadap konsentrasi ekstrak
mentah dibuat, dan nilai IC50 (yaitu, konsentrasi yang menghambat pertumbuhan sebesar
50%) dari ekstrak ditentukan dari grafik tersebut. Nilai-nilai ≤20 μg/mL dianggap memiliki
aktivitas penghambatan tinggi, seperti yang disarankan oleh National Cancer Institute, Amerika
Serikat (Geran, 1972).
Analisis statistik
Hasil percobaan diungkapkan sebagai mean ± deviasi standar dari tiga pengukuran sejajar. Uji
perbandingan pasangan Tukey (HSD) dan uji perbedaan yang paling tidak signifikan (LSD)
dilakukan untuk menentukan perbedaan signifikan antara nilai rata-rata (p < 0,05). Uji korelasi
Pearson juga dilakukan untuk menentukan hubungan antara TPC, TFC, TFlC, dan aktivitas
antioksidan. Semua analisis dilakukan dengan menggunakan Statistical Package for the Social
Sciences (SPSS; IBM Corp., Armonk, NY, Amerika Serikat).
1
4