BAB III

METODE PENELITIAN

A. Rencangan dan Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini merupakan kriteria

penelitian diskriptif dengan observasional (non-eksperimen).

B. Desain Penelitian

Desain penelitian ini merupakan observasional dan kriteria penelitian

diskriptif yang bertujuan untuk mendiskripsikan warna granula dan ukuran sel

eosinofil pada pewarnaan giemsa dengan menggunakan pengenceran NaCl

0,9% dan buffer phospat. Warna granula berdasarkan kriteria baik yaitu warna

granula merah – orange, sedangkan kriteria tidak baik yaitu warna granula

ungu atau selain warna merah – orange, dan ukuran sel eosinofil berdasarkan

normositik dengan ukuran 10 – 15 µm, mikrositik dengan ukuran < 10 µm, dan

makrositik dengan ukuran > 15 µm.

26
C. Alur Penelitian

Menyiapkan larutan Menyiapkan larutan pengencer

pengencer NaCl 0,9% Buffer phospat

Pembuatan cat Giemsa 10% Pembuatan cat Giemsa 10% dengan

dengan pengenceran NaCl 0,9% pengenceran buffer phospat dengan
dengan perbandingan 1 : 9 perbandingan 1 : 9

Pengambilan sampel darah

vena 2 ml menggunakan
tabung reaksi dengan
antikoagulan EDTA

Pembuatan sediaan apusan darah tepi

Sediaan apusan darah tepi 1 Sediaan apusan darah tepi 2

Pengecetan sediaan menggunakan Pengecetan sediaan menggunakan

pewarnaan Giemsa dengan pewarnaan Giemsa dengan
pengencer NaCl 0,9% pengencer Buffer Phospat

Pengamatan morfologi eosinofil Pengamatan morfologi eosinofil

Pencatatan hasil pengamatan

warna granula dan ukuran sel
eosinofil

Analisis data secara deskriptif

Gambar 3.1 Alur Penelitian

27
D. Variabel Penelitian dan Definisi Oprasional

1. Variabel Penelitian

Variabel dalam penelitian ini adalah warna granula dan ukuran sel

eosinofil pada pewarnaan giemsa pengenceran menggunakan NaCl 0,9%

dan buffer phospat.

2. Definisi Oprasional

Tabel 3.1 Definisi Oprasional

Definisi Operasional
Warna granula sel Warna granula berdasarkan kriteria baik yaitu
eosinofil warna granula merah – orange, sedangkan kriteria
tidak baik yaitu warna granula ungu atau selain
warna merah – orange yang diamati secara
mikroskopis melalui sediaan apusan darah tepi
dengan melakukan pewarnaan giemsa
menggunakan pengencer NaCl 0,9% dan Buffer
Phospat.
Ukuran sel Ukuran sel eosinofil berdasarkan normositik yaitu
eosinofil dengan ukuran 10–15 µm, mikrositik yaitu dengan
ukuran < 10 µm dan makrositik yaitu dengan
ukuran > 15 µm yang diamati secara mikroskopis
melalui sediaan apusan darah tepi dengan
melakukan pewarnaan giemsa menggunakan
pengencer NaCl 0,9% dan Buffer Phospat.
Pengenceran NaCl Pengenceran NaCl 0,9% digunakan dalam cat
0,9% Giemsa untuk pemeriksaan sediaan apusan darah
tepi agar pH Giemsa tetap dipertahankan.
Pengenceran Pengenceran Buffer Phospat digunakan dalam cat
Buffer phospat Giemsa untuk pemeriksaan sediaan apusan darah
tepi agar pH Giemsa tetap dipertahankan.

E. Populasi dan Sampel

1. Populasi

Populasi adalah sekelompok individu yang memiliki karakteristik

yang sama, yang mungkin diamati. Populasi dalam penelitian ini adalah

28
 anak yang tinggal di Panti Asuhan Darul Yatim Sayung Kabupaten Demak

yang tercatat 60 orang.

2. Sampel

Sampel adalah sebagian dari populasi yang menjadi objek penelitian.

Sampel penelitian ini diambil dari anak yang tinggal di Panti Asuhan Darul

Sayung Kabupaten Demak Yatim yang berjumlah 15 orang dan yang

bersedia menjadi responden. Teknik pengambilan sampel dilakukan dengan

Simple Rondom Sampling yaitu pengambilan sampel dilakukan secara acak.

Penentuan jumlah sampel ditentukan berdasarkan 25% karena jumlah

populasi < 100 (Sastroasmoro S, 2010).

n = N × 25% Keterangan :
n : Sampel
n = 60 × 25%
N : Populasi

Penelitian ini menggunakan 2 perlakuan sehingga terdapat 30unit

kemudian dilakukan duplo.

F. Lokasi Penelitian dan Waktu Penelitian

1. Lokasi Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan di Laboratorium Hematologi Jurusan

Analis Kesehatan Poltekkes Kemenkes Semarang.

2. Waktu Penelitian

a. Penyusunan proposal : November 2018 – Januari 2019

b. Penelitian : Februari 2019

c. Analisis data : Maret - April 2019

d. Penyusunan hasil penelitian : Mei 2019

29
G. Instrumen Penelitian

1. Instrumentasi Observasional

Berupa lembar informed consent.

2. Instrumen Pemeriksaan

a. Alat Pemeriksaan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah torniquet, spuit,

kapas alkohol, kapas kering, hepavix, tempat limbah, tabung reaksi, pipet

tetes, objek glass, pH meter digital, jembatan pengecetan dan mikroskop.

b. Bahan Pemeriksaan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah larutan buffer

phospat, larutan NaCl 0,9%, giemsa stock, metanol, alkohol 70%,

antikoagulan EDTA dan minyak imersi.

c. Sampel Pemeriksaan

Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah darah vena.

3. Tahap penelitian

a. Mengukur pH NaCl 0,9%

Menyiapkan larutan NaCl 0,9 % yang akan diukur pH nya.

Membersihkan probe elektroda menggunakan aquadest, lalu

mengeringkan probe elektroda menggunakan tissu bersih. Mengaktifkan

tombol ON pada pH meter digital, lalu mencelupkan probe elektroda

pada larutan NaCl 0,9%. Menunggu hingga pembacaan yang stabil dan

mencatat hasil pengukuran pH yang muncul pada layar display.

Mengangkat probe elektroda dari larutan NaCl 0,9%, lalu membilas

dengan aquadest dan mengeringkan probe elektroda dengan

30
 menggunakan tissu. NaCl 0,9% yang digunakan harus memiliki pH 6,8 –

7,2. (Ervana N, 2017).

b. Mengukur pH buffer phospat

Menyiapkan larutan buffer phospat yang akan diukur pHnya,

kemudian membersihkan probe elektroda menggunakan aquadest, dan

mengeringkan dengan menggunakan tissu bersih. Mencelupkan probe

elektroda pada larutan buffer phospat. Menunggu hingga pembacaan

yang stabil dan mencatat hasil pengukuran pH yang muncul pada layar

display. Mengangkat probe elektroda dari larutan buffer phospat, lalu

menekan tombol OFF pada alat pH meter digital. Membilas dengan

aquadest dan mengeringkan probe elektroda dengan menggunakan tissu

bersih. Buffer phospat yang digunakan harus memiliki pH 6,8 – 7,2.

(Ervana N, 2017).

c. Membuat larutan NaCl 0,9%

Menimbang 0,9 gram NaCl diatas galas arloji dengan menggunakan

timbangan analitik. Melarutkan NaCl di dalam beaker glass dengan

menggunakan aquadest sedikit demi sedikit hingga larut. Memindahkan

kedalam labu ukur 100 ml, ditambah dengan aquadest sampai tanda batas

dan labu ukur ditutup lalu dihomogenkan.

d. Membuat larutan buffer phospat

1) Membuat larutan Na2HPO4 0,1M

Menimbang Na2HPO4.2H2O sebanyak 5,94 gram dengan

menggunakan timbangan analitik. Melarutkan Na2HPO4.2H2O

kedalam beaker glass 250 ml dengan menambahkan aquadest 250 ml.

31
 Menghomogenkan larutan, kemudian memasukan ke dalam labu ukur

500 ml dengan menambahkan aquadest sampai tanda batas dan

menghomogenkan kembali untuk mendapatkan larutan Na2HPO4

0,1M (Asani L, 2015).

2) Membuat larutan KH2PO4 0,1M

Menimbang KH2PO4.2H2O 4,54 gram dengan menggunakan

timbangan analitik. Melarutkan KH2PO4.2H2O kedalam beaker glass

250 ml dengan menambahkan aquadest 250 ml. Menghomogenkan

larutan, kemudian masukkan kedalam labu ukur 500 ml dengan

menambahkan aquadest sampai tanda batas dan homogenkan kembali

untuk mendapatkan larutan KH2PO4 0,1M (Asani L, 2015).

3) Membuat larutan buffer phospat

Mencampurkan sebanyak 51,0 ml larutan Na2HPO4 0,1M, dan

menambahkan dengan larutan KH2PO4 0,1M sebanyak 49,0 ml

kemudian menghomogenkan larutan. Mengukur pH buffer phospat

dengan menggunakan pH meter.

4) Mengkondisikan pH buffer phospat agar sama dengan pH NaCl 0,9%

pH buffer phospat akan diukur menggunakan pH meter, jika pH

buffer phospat belum sama atau lebih asam dari pH NaCl 0,9% maka

buffer phospat akan ditambah basa yaitu Nutrium hidroksida hingga

mencapai pH yang sesuai. Jika pHnya lebih basa maka akan ditambah

dengan asam lemah yaitu asam asetat sampai pH yang sama dengan

NaCl 0,9%.

32
e. Cara membuat cat giemsa dengan pengencer NaCl 0,9%

Membuat larutan giemsa 10% menggunakan pengenceran NaCl

0,9% dengan perbandingan 1:9. Mengambil 1 ml giemsa akan diencerkan

dengan 9 ml NaCl 0,9%. Melakukan pewarnaan sediaan apusan darah

tepi dengan menggunakan cat giemsa 10% selama 20-25 menit.

f. Cara membuat cat giemsa dengan pengencer buffer phospat

Membuat larutan giemsa 10% menggunakan pengenceran buffer

phospat dengan perbandingan 1:9. Mengambil 1 ml giemsa akan

diencerkan dengan 9 ml buffer phospat. Melakukan pewarnaan sediaan

apusan darah tepi dengan menggunakan cat giemsa 10% selama 20-25

menit.

g. Cara mengambil sampel darah vena

1) Menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.

2) Menggunakan APD sebelum melakukan pengambilan darah.

3) Responden dipersilahkan duduk dengan tenang

4) Memasang tourniquet pada lengan atas pada tangan sebelah kanan

atau kiri.

5) Responden diminta untuk mengepalkan tangan dan membuka

tangannya beberapa kali agar vena terlihat dengan jelas.

6) Membersihkan tangan yang akan diambil dengan kapas alkohol 70%

dan tunggu hingga kering.

7) Menusuk vena menggunakan jarum spuit dengan sudut 45O.

8) Menarik spuit secara perlahan-lahan sampai 2 ml.

33
 9) Melepaskan tourniquet dan meletakkan kapas diatas tempat tusukan,

menarik jarum spuit secara perlahan-lahan.

10) Melekatkan hepavix pada tempat tusukan.

11) Melepaskan jarum pada spuit, lalu darah dialirkan kedalam tabung

reaksi dengan antikoagulan EDTA dan homogenkan.

12) Memberi label pada tabung.

h. Cara membuat sediaan apusan darah

1) Membersihkan kaca objek dengan menggunakan tissu bersih.

2) Meneteskan darah diatas kaca objek (pada bagian tepi) dengan

mengunakan pipet tetes.

3) Meletakkan kaca objek lainnya (digunakan sebagai slider) di depan

tetesan darah, dan membentuk sudut 30O. Kemudian gerakkanlah

kaca objek yang berperan sebagai slider ke arah belakang menuju

tetesan darah, sehingga terjadi kontak antara tetesan darah dengan

slider.

4) Menggerakkan slider ke arah yang berlawanan dengan cepat.

5) Membiarkan sampai kering dan setelah itu dilakukan pewarnaan

preparat sediaan.

34
 Gambar 3.2 Pembuatan sediaan apusan darah tepi

Sumber: Mitra, 2012

i. Pewarnaan sediaan apusan darah tepi dengan cat giemsa

1) Melakukan pewarnaan sediaan apusan darah tepi dengan cat giemsa

pengenceran NaCl 0.9%

Menyiapkan cat giemsa dengan pengenceran NaCl 0,9%,

metanol, dan air, kemudian meletakkan sediaan apusan darah tepi

pada rak tempat untuk pewarnaan. Meneteskan metanol keatas sediaan

dengan bagian yang terlapisi darah tertutup semua, menggenangi

selama 5-10 menit, lalu membuang keseluruhan metanol, dan tunggu

sampai kering. Kemudian meneteskan cat giemsa dengan pengenceran

NaCl 0,9 % diatas sediaan dengan bagian yang berlapis darah tertutup

semua dan menggenangi selama 20-25 menit. Membilas dengan

35
 menggunkan air mengalir secara perlahan. Lalu meletakkan sediaan

secara vertikal dan membiarkan sediaan sampai kering.

2) Melakukan pewarnaan sediaan apusan darah tepi dengan cat giemsa

pengenceran buffer phospat

Menyiapkan cat giemsa dengan pengenceran buffer phospat,

metanol, dan air, kemudian meletakkan sediaan apusan darah tepi

pada rak tempat untuk pewarnaan. Meneteskan metanol keatas sediaan

dengan bagian yang terlapisi darah tertutup semua, menggenangi

selama 5-10 menit, lalu membuang keseluruhan metanol, dan tunggu

sampai kering. Kemudian meneteskan cat giemsa dengan pengenceran

buffer phospat diatas sediaan dengan bagian yang berlapis darah

tertutup semua dan menggenangi selama 20-25 menit. Membilas

dengan menggunkan air mengalir secara perlahan, lalu meletakkan

sediaan secara vertikal dan membiarkan sampai kering.

j. Cara memeriksa sediaan apusan darah tepi dengan mikroskop trinokuler

1) Menyiapkan mikroskop trinokuler.

2) Meletakkan preparat sediaan diatas meja mikroskop dan

menghubungkan mikroskop dengan komputer, lalu membuka aplikasi

ZEN.

3) Melakukan pengamatan dengan menggunakan perbesaran 10x, untuk

mendapatkan gambaran mikroskopis secara keseluruhan.

4) Melakukan pengamatan dengan perbesaran 100x dengan

menggunakan minyak imersi 1 tetes.

36
 5) Memilih tulisan “live” yang digunakan untuk melihat tampilan

preparat pada layar komputer.

6) Mecari sel eosinofil, apabila sudah ditemukan. Lalu memilih tulisan

stop.

7) Memilih “snap foto” yang digunakan untuk mengambil gambar sel

eosinofil untuk mengamati warna granula dan ukuran sel eosinofil.

8) Mengukur sel eosinofil dengan cara memilih menu “graphick” lalu

pilih “line”. Kemudian mengukur sel eosinofil dengan cara membuat

garis yang disesuaikan dengan ukuran sel eosinafil, setelah garis

terbentuk maka secaran otomatis akan muncul angka yang

menggambarkan ukuran dari sel eosinofil.

H. Teknik Pengumpulan Data

Data yang dikumpulkan berupa data primer, hasil pengamatan morfologi

eosinofil menggunakan darah vena yang dibuat sediaan apusan darah tepi.

Pemeriksaan setiap unit penelitian dilakukan dengan membuat dua preparat

sediaan apusan darah tepi.

Pembuatan dua preparat sediaan apusan darah tepi setiap unit digunakan

untuk mengkontrol penyerapan cat giemsa pada eosinofil dan untuk

memperoleh validitas hasil pengamatan morfologi eosinofil.

I. Pengolahan Data dan Analisis Data

Data yang diperoleh dari penelitian ini merupakan hasil dari pengamatan

morfologi eosinofil pada sediaan apusan darah tepi yang dilakukan pewarnaan

giemsa dengan menggunakan pengenceran NaCl 0,9% dan Buffer Phospat.

37
 Data hasil pengamatan morfologi eosinofil kemudian disajikan dalam

bentuk tabel dan analisa secara diskriptif dengan presentase dari warna granula

dan ukuran eosinofil pada setiap perlakuan. Warna granula berdasarkan kriteria

baik yaitu warna granula merah – orange, sedangkan kriteria tidak baik yaitu

warna granula ungu atau selain warna merah – orange, dan ukuran sel eosinofil

berdasarkan normositik dengan ukuran 10 – 15 µm, mikrositik dengan ukuran

< 10 µm, dan makrositik dengan ukuran > 15 µm.

J. Etika Peneliti

1. Lembar persetujuan (informed consent)

Lembar pengesahan akan diberikan kepada responden yang diteliti,

peneliti akan menjelaskan maksud dan tujuan penelitian yang dilakukan,

serta mengenai dampak-dampak yang ditimbulkan selama dan sesudah

pengumpulan data. Jika responden tidak bersedia untuk diteliti, maka

peneliti tidak boleh memaksa dan tetap menghormati hak-hak responden.

2. Tanpa nama (anonimity)

Identitas responden tidak akan dicantumkan dalam lembar

pengumpulan data demi menjadi kerahasiaan responden.

3. Kerahasiaan

Dalam penelitian kerahasiaan responden akan dijamin oleh peneliti.

Informasi yang telah dikumpulkan oleh peneliti dijamin rahasia. Kepada

kelompok tertentu peneliti akan melaporkan sebagian hasil penelitiannya.

K. Jadwal Penelitian

1. Pengambilan sampel dan pembuatan apusaan darah : Februari 2019

2. Pewarnaan sediaan apusan darah tepi : Februari 2019

38
3. Pembacaan sediaan apusan darah tepi : April 2019

4. Validasi hasil : Mei 2019

5. Penyusunan hasil : Mei 2019

39