Subeki

Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,

mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan
menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4).
Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada
tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak
hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi
pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas
Kromatografi lapisan tipis (TLC) ditemukan pada tahun 1938
oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian disempurnakan
oleh Stahl pada tahun 1958.

Pada akhir tahun 1960 an, usaha dilakukan untuk

pengembangan kromatografi cair dan menghasilkan HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)
1. Pelarut grade HPLC
2. Pelarut di dalam wadah harus cukup
3. Wadah transparan dan tidak bereaksi
dengan pelarut
4. Pelarut di dalam wadah diberi label
5. Pelarut harus disaring/sonikasi
6. Dapat dideteksi oleh detektor
7. Dapat melarutkan sampel
8. Kekentalan rendah
9. Harga terjangkau
Untuk menghilangkan gas-gas yang
Yang terlarut dalam solvent
Jangan melebihi batas
tekanan maksimum untuk
masing-masing kolom.
Kolom kecil (mak 3000 psi)
Kolom besar (mak 2000
psi)
Flow rate 0.1-10 ml/min
Kolom analitik dapat run sampel
sebesar 1-4 mg sekali running, dan
Kolom preparative 80-320 mg.
Tergantung dengan jenis kolom dan
Fase mobil yang digunakan.
Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi
sampel dengan cara automatis. Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila INJECT difungsikan, maka
sampel akan masuk ke dalam kolom.
 Guard column Column

Kolom adalah jantung kromatografi. Kolom dapat dibagi menjadi dua

a. Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm.
b. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm
 Entrance

Guard
column Porous titanium

Stainless
jacket

Main column

Porous titanium

Exit
 HPLC - Modes
• Normal Phase.
- Fase tetap bersifat Polar dan fase
gerak adalah non-polar.

• Reverse Phase.
- fase tetap bersifat Non-polar dan fase gerak
adalah polar
• Normal Phase

Fase tetap (stationary phase)

silica

Fase gerak (mobile phase)

• n-hexane, petroleum ether, chloroform, etc
• Reverse Phase.
Fase tetap (stationary phase)
• C-2 Ethyl Silyl -Si-CH2-CH3
•C-8 Octyl Silyl -Si-(CH2)7-CH3
• C-18 Octadecyl Silyl -Si-(CH2)17-CH3
•CN Cyanopropyl Silyl -Si-(CH2)3-
CN
Fase gerak (mobile phase)
• Methanol CH3OH
• Acetonitrile CH3CN
• Tetrahydrofuran
• Water H2O
 Berbagai pelarut dan tingkat kepolarannya
Solvent Eluent strength (εo) Ultraviolet cutoff nm

Pentane 0.00 190

Hexane 0.01 195
Heptane 0.01 200
Trichlorotrifluoroethane 0.02 231
Increasing Toluene 0.22 284
polarity Chloroform 0.26 245
Dichloromethane 0.30 233
Diethyl ether 0.43 215
Ethyl acetat 0.48 256
Methyl t-butyl ether 0.48 210
Dioxane 0.51 215
Acetonitril 0.52 190
Acetone 0.53 330
Tetrahydrofuran 0.53 212
2-propanol 0.60 205
methanol 0.70 205
 Chiral separations
Chiral compounds or enantiomers have identical
molecular structures that are mirror images of
each other.
A. UV-vis Absorbance detector
cocok mendeteksi sebagian besar
sampel dengan kisaran 190
sampai 460-600 nm
B. Refractive Index (RI) detector
Sangat sensitif terhadap suhu dan sulit menstabilkan baseline
C. Diode array detector
D. Fluorescence Detector

E. Fourier Transform Infrared Detector

F. Electrochemical Detectors
 Komposisi fase mobil
1. ISOCRATIC ELUTION
The constant eluent composition is
pumped through the column during the
whole analysis.

2. GRADIENT ELUTION
The eluent composition is steadily
changed during the run.
GRADIENT ELUTION
 APLIKASI HPLC

veterinary
Environmental

Agriculture and food Chemistry

Biomedical
 CONTOH ANALISIS KANDUNGAN BRUCEIN-A

0.35
0.25 mg/ml 0.3

(Bruceine A/IS)
Ratio peak area
0.25
0.2
0.15
0.1 Y = 0.03550435 + 0.14268869x
0.05 R = 0.99270964
0
0 0.5 1 1.5 2
Concentration

IS

Bruceine A
2 mg/ml

Fig. Chromatogram of bruceine A at wavelength 240 nm.

(ODS column 250 mm x 4.5 mm, press 3000 psi, flow rate 1 ml/min, solvent MeOH:CH 3CN:H2O)
 Mice
serum

Fig. Chromatogram of bruceine A in mice serum at wavelength 240 nm.

(ODS column 250 mm x 4.5 mm, press 3000 psi, flow rate 1 ml/min, solvent MeOH:CH 3CN:H2O)
 Brucea javanica Seed
(1 kg)
Boiled for 30 min (5L x 2)
Filtered
Filtrate Residue
Evaporated
Concentrate
EtOAc (500 ml x 4)
Parasitemia Aqueous layer EtOAc layer
Control 12.5 % 0.9 % 0.4 %
Evaporated
Solid
(60.6 g)
SiO2, 350 g
CHCl3 3% M/C 20% M/C 70% M/C MeOH
Parasitemia Fr 1 Fr 3 Fr 4 Fr 5
Control 11.7 % 18.1 g Fr 2 10.8 g 4.9 g 3.8 g
10.2 % 3.2 g 0.2 % 0.5 % 1.6 %
9.7 %
Compounds
Active

Fig. Isolation of the active compounds from Brucea javanica seeds. 　

 Active
Compound

Fig. Chromatogram of active compound from Brucea javanica at wavelength 221 nm.
(ODS column 250 mm x 4.5 mm, press 3000 psi, flow rate 1 ml/min, solvent MeOH:CH 3CN:H2O)
 OH O
O
HO 12
21
OCH3
11 13
20
19
1
O 9 14
OR
2 10 8 15
H H
3 5 7 16

HO 4 6 O O
H H
18

5' 9'
O
R= Bruceantinol (2)
2' 8'
4'
1' 3'
6'
7' O
O

Fig. Chemical structure of active compound from Brucea javanica.

Analisis dengan HPLC

• Cepat (minutes)
• resolusi tinggi
• Sensitivitas tinggi (ng-fg)
• Reproducibility tinggi (+/- 1%)
• Accuracy tinggi
• Automatic
 Disadvantages of HPLC

• Cost
• Complexity
• Low sensitivity (some compounds)
• Irreversibly adsorbed compounds
not detected
• Coelution difficult to detect