PENANGANAN

SAMPEL

10/09/2021 1
Obat yang sering ditemukan overdosis
 Fraksi A (Asam Kuat)
Salisilat, Phenitoin
 Fraksi A-2 (Asam Lemah)
Barbiturat, Klorpropamid, Glutetimid, Parasetamol,
Phenilbutazon dan Phenitoin
 Fraksi A-3 (Obat netrak)
Coffein, Carbromal, Chlordiazepokside, Chlormethiazole,
Flurazepam, Glutethimide, Lorazepam, Meprobamate,
Methaqualone, Methyprylone, Nitrazepam, Phenazone,
Temazepam dan Theophyline
10/09/2021 2
  Fraksi B (Obat Basa)
Amitriptyline, Amphetamin, Chlordiazepoxide,
Chlormethiazole, Chlorpromazine, Clomipramine,
Desipramine, Dextropropyphene, Diazepam,
Dihydrocodein, Dothiepin, Doxepin, Ergot alkaloid,
Imipramine, Morphine, Nitrazepam, Orphanedrine,
Oxprenolol, Quinine, Temazepam, Theophylline,
Trimipramine
 Fraksi BE (Benzophenone) : Benzodiazepin
 Fraksi O (Opiat)
Codein, Morphin

10/09/2021 3
 PENANGANAN SAMPEL

Sampel

Pengotor Analit

Eksogen Endogen

Sensitivitas & Selektivitas

Pemurnian sampel
Pemurnian awal /
penanganan awal

Ekstraksi

Kromatografi
 Pemurnian awal
Hidrolisis
Liofilisasi
konjugat

Ekstraksi solfen Homogenisasi

Derivatisasi
Presipitasi /
PRE- kimia sebagai
denaturasi
TREATMENT pendahuluan
protein
ekstraksi
Presipitasi / denaturasi protein
Protein  pengotor endogen :
Mengikat obat  hasil analisis tidak
valid
Merusak alat (kolom HPLC)

Presipitasi / denaturasi protein

Perusakan ikatan antara protein dengan
obat / metabolitnya
Presipitasi / denaturasi protein
Penambahan zat kimia

Sentrifugasi

Pemanasan

Ultrafiltrasi
Presipitasi / denaturasi protein

Sampel Metanol Asetonitril

Sentrifuge
Endapan Supernatan
Pemanasan
Sentrifuge
Endapan Supernatan
Ekstraksi
 Pemilihan pelarut untuk ekstraksi terbatas berdasarkan
polaritas senyawa aktif yang akan dianalisis
 Pilihan pelarut : eter, hidrokarbon terklorinasi, etil asetat
atau aseton
 Senyawa asam diekstrasi dalam suasana asam (pH < pKa
-2) dan senyawa basa pada suasana basa (pH > pKb + 2)
dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai.
 Senyawa netral diekstrasi pada suasana netral (pH sekitar
7) dengan menggunakan pelarut organik

10/09/2021 10
Pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan kelarutan
Ekstraksi padat – cair
Pemisahan senyawa menggunakan kolom
kromatografi.
Pemisahan didasarkan perbedaan

kelarutan dalam fase gerak (pelarut)

Parameter : konstanta distribusi (KD)
Ekstraksi cair – cair
 Konstanta Distribusi (KD)

KD = [Vlarutan x Wsolut dalam fase diam]

[Wfase diam x Wsolut dalam larutan]
Nilai KD dipengaruhi oleh :
Polaritas pelarut
Kecepatan aliran larutan
Kontak larutan dengan fase diam
 Ekstraksi cair – cair

Pemisahan didasarkan perbedaan kelarutan senyawa pada

pelarut organik & air.
Parameter : koefisien partisi (P)
P = Corganik / Cair
Faktor yang mempengaruhi P
Pelarut yang digunakan
pH
Derajat ionisasi
 Ekstraksi cair – cair

Darah utuh
Sentrifuge
serum protein CHCl3
analit protein CHCl3
uapkan
analit
Ekstraksi pelarut untuk menghilangkan
senyawa hidrokarbon

Atur pH

Obat terionisasi

Ekstraksi dg pelarut organik

Fase organik /
Fase hidrofilik :
hidrofobik :
Obat terionisasi
hidrokarbon
 Ekstraksi cair-cair senyawa aktif seperti obat dan senyawa
lipofilik lainnya dari spesimen ke dalam pelarut organik
tak bercampur dengan air yang sesuai, biasanya dilakukan
pada pH yang terkontrol
 Ekstraksi bertujuan menghilangkan air dan senyawa lain
yang mengganggu analisis, dilanjutkan dengan pemekatan
dengan penguapan atau dengan SPE dan akhirnya
dilarutkan dalam pelarut yang sesuai sebelum dilakukan
analisis

10/09/2021 16
  Ekstraksi dapat dilakukan dalam tabung reaksi sesuai
dan pengocokan dilakukan menggunakan vortex.
 Penguapan dapat dilakukan dengan hembusan gas
nitrogen, udara panas atau dalam alat penguap putar
vakum (vacuum rotary evaporator)
 Selain itu pemisahan juga dapat dilakukan
menggunakan sentrifuge

10/09/2021 17
EKSTRAKSI URINE (yang sering overdosis)

 10 ml urine + asam fosfat atau tartat, diatur pH 3,

ekstrak dengan 2 x 30 ml bagian eter. Gabungkan
ekstrak eter dan cuci dengan 5 ml air
 Lapisan air yang tinggal untuk ekstraksi selanjutnya
 Ekstrak lapisan eter dengan 5 ml larutan natrium
bikarbonat dan lapisan air yang tinggal untuk penentuan
adanya salisilat atau asam kuat (Fraksi A 1)
 Ekstrak lapisan eter dengan 5 ml NaOH 0,5 M dan
lapisan air yang tinggal untuk penentuan barbiturat atau
asam lemah (Fraksi A 2)
10/09/2021 18
  Cuci larutan eter dengan air, buang cairan pencuci,
keringkan larutan dengan natrium sulfat anhidrat dan
uapkan hingga kering. Residu mengandung obat netral
(Fraksi A 3)

10/09/2021 19
Faktor-faktor yang harus diperhatikan
dalam proses ekstraksi
 Sifat fisiko-kimia analit (pKa, stabilitas, kelarutan,
volatilitas, dll)
 Sifat alami dari sampel : mengandung protein atau lemak,
stabilitas
 Sifat fisiko kimia pelarut organik yang digunakan
(poralitas, volatility dan kemampuan pelarutan, dll)
 Metode atau teknik analisis yang akan digunakan

10/09/2021 20
Ekstraksi Senyawa Diuretik
 Sebanyak 3 ml urin dipipet ke dalam tabung sentrifuse,
ditambahkan sejumlah baku internal dan ditambahkan
dapat fosfat pH 5 dan 0,5 gr natrium sulfat anhidrat
 Campuran divortex dan diekstraksi dengan 5 ml dietileter,
lalu divortex lagi selama 5 menit
 Tabung disentrifugasi pada 2500 g selama 5 menit. Fase
organik dipindahkan ke dalam tabung yang lain dan
diuapkan dengan aliran udara panas atau hembusan gas
nitrogen.

10/09/2021 21
  Residu dilarutkan dalam 200 µl metanol dan disaring
dengan saringan 0,45 µm, dan 5 atau 10 µl
 Setelah itu baru disuntikan ke kromatografi

10/09/2021 22
Solid Phase Extraction (SPE)
Teknik SPE digunakan untuk pra-perlakuan sampel
atau clean-up sampel-sampel yang kotor seperti
sampel dengan kandungan matriks yang tinggi
seperti garam-garam, protein, polimer, resin dll.

Efisiensi SPE dapat memperoleh recovery yang

tinggi (>99 %).
 Tahapan SPE

Pengkondisian

Retensi
(tertahannya)
sampel

Pembilasan

Elusi
 KLT
Fase diam : padat
Fase gerak : cair
Pemisahan senyawa
Analisis kualitatif &
kuantitatif (kurang
sensitiv)
 GC
Fase diam : padat / cair
Fase gerak : gas inert
Analisis kualitatif &
kuantitatif
Untuk pemeriksaan zat yang
volatil & tahan panas
 HPLC
Fase diam : padat
Fase gerak : cair
Analisis kualitatif &
kuantitatif
Untuk pemeriksaan zat yang
tidak tahan panas & tidak
volatil
 Gel Permeation
Chromatography (GPC)

Pemisahan berdasar perbedaan ukuran partikel

Fase diam : gel
Gel berupa butiran – butiran berpori (dekstran,
poliakrilamid, polistiren)
Fase gerak : cair
Contoh : pemisahan makromolekul (lemak, protein,
garam) dari sampel
 Liofilisasi
Alasan pemilihan liofilisasi :
Air sangat banyak, analit sangat larut air sehingga tidak
dapat dipisahkan secara ekstraksi pelarut
Analit mudah menguap & rusak oleh pemanasan

Contoh :
Feses  mengandung mikroflora yang merusak analit pada
suhu kamar
Feses  liofilisasi  serbuk  larutkan dengan pelarut yg
sesuai  ekstraksi
 Liofilisasi
Sampel dibekukan

Lyophilizer

Uap air divacum Padatan kering

Sublimasi Larutkan dg
pelarut yg sesuai
 Hidrolisis konjugat

Hidrolisis dengan penambahan

enzim
Homogenisasi
 Derivatisasi kimia
Obat / metabolit  ekstraksi  rusak
Derivat obat / metabolit  ekstraksi  tidak rusak
Hidralazin  ekstraksi pelarut organik (pH basa)
 rusak
Hidralazin + NaNO3 (pada pH asam)  tetrazolo
(1,5) phthalazin  ekstraksi pelarut organik (pH
basa)  tidak rusak
 To 20 mL-aliquot of each sample was added 1 mL of concentrated hydrochloric
acid, which was then heated for 15 min at 100°C for breaking glucoronide
conjugates. After cooling, the pH of the mixture was adjusted to 8-9 with
concentrated ammonia. The first portion was extracted with 2×15 mL of
chloroform-isopropanol (8:2). The organic phase was separated and evaporated
to dryness under stream of nitrogen.

Contoh kasus
10/09/2021 34