Bioteknologi reproduksi

TE sering dikatkan dg metod mutakhir disebut

bioteknik.
Bioteknik is tindakan biologis yg terkontrol dan
terarah dari fungsi fungsi tubuh untk tujuan
perencanaan dan pengendalian suatu proses
biologis yg dialami dalam produksi ternak.
TE mempunyai rangkaian mata rantai bioteknik
yaitu superovulasi, sinkronisasi, IB, pembekuan
embrio( mikromanipulasi)

TRANFER EMBRIO INDUSTRI

TE pertama pada kelinci (heape 1890); kambing
dan domba (warwick,1932); babi (kvansnickel,
1951); sapi (willet et al, 1951); kuda (oquri and
tsutumi, 1974); monyet (kraemer et al, 1976);
manusia ( steptoe and edward 1978) dan anjing
( kenney et al,1979).
Pada th 1980 selain peningkatan
tekniksuperovulasi dan koleksi juga
dikembangkan teknik mikromanipulasi embrio

Contoh micromanipulasi embrio

Pembuahan kembar identik dan binatang
khemer (williadsen ,1982)
Ternak klonning (prather et al, 1987)
Gabungan TE dg rekaysa genetik (Palmeter ,
1982) yaitu injeksi gen pertumbuhan kedalam
sel telur, sehingga menghasilkan supermouse
(2x normal)
Hammer et al, (1986) berhasil membuat ternak
transgenik pada kelinci,domba,babi)

DI AS --- dilakukan transgenik pada kambing

menghasilkan human tissue tipe plasminogen
activator (Ebert et al. 1991)
Ingris transgenik domba memproduksi human
alpha -1 antitripsin (wrieght et al, 1991)
Netherland memproduksi protein spesifik dari
air susu sapi malalui bovine casein human
laktoferin(herman de boer et al, 1991)

Transfer embrio
Adalah cara perkawinan dengan memproduksi
banyak embrio dalam jumlah yang banyak pada
satu kali periode dari betina donor unggul yang
dipindahkan pada resipien biasa dan dipelihara
sampai lahir.
TE menyangkut ilmu embriologi.
Embriologi adalah ilmu yang mempelajari
embrio.
Embrio adalah suatu makluk yang sedang
berkembang dan belum mempunyai bentuk yang
definitif ( mempunyai bentuk saperti dewasa

Fetus --- adalah semua makluk yang sudah

berkembang da sudah mempunyai bentuk yang
definitif.
Embriologi mencakup :
Progenese adalah mempelajari mulai dari
pembentukan sel kelamin sampai terjadi zygote
Embriogenesis- adalah mulai dari zigot sampai
embrio
Organogenesis adalah mempelajari pembentukan
organ

Embriogenesis
Membahas pembelahan sel telur / zigot
(cleacage) sampai blastosis
Pembelahan zigot secara mitosis yaitu 2
menjadi 4 ,8 dst.
Besar zigot yang sudah membelah sama karena
masih mempunyai zona pellusida
Sel telur yang mempunyai banyak sel anak
disebut morula dan sel anak disebut blastomer
Beda morula dg blastosis hanya rongga yag ada
pada blastosis

Macam macam blastosis

Sello blastosis--- mempunyai rongga dan
terdapat pada katak dan mamalia
Stereoblastosis --- tidak berongga dan terdapat
pada ikan terutama yg bertulang rawan
Dalam pengembangan ternak sapi TE
berkembang 10 tahun belakangan ini dan
secara garis besar pelaksanaan TE secara
praktis ditujukan utk meningkatkan jumlah
keturunan dari bibit unggul

Faktor yang mempengaruhi TE

Rangkaian primer mencakup mencakup
superovulasi yaitu seoptimal mungkin sel telur
yang terbuahi (embrio). Hasil embrio yang
ditampung tercatat 0 70 sel telur, rata rata
12 sel telur. Hasil superovulasi bukan jumlah
tetapi kualitas. Evaluasi embrio yang
ditampung adalah :

1.

15 20 % ( unfertilisasi)
15 20 % ( degenerasi)
30 40% untransferable embrio

penyebaran embrio yang dipanen

10 % masih bentuk sel telur
70 % -- berada pada apex kornua uteri
20 % -- berada pada cabang tanduk
rahim (bifurkatio uteri)
Embrio dipanen pada umur 6 7 hari
Penentuan kualitas embrio sangat sulit
Penentuan resipien sulit mencakup umur,
berat dan respon terhadap sinkronisasi
estrus

2. Rangkaian skunder mencakup

penyediaan resipien tidak sesuai dengan
jumlah embrio. Penggunaan embrio beku
10 20 % lebih rendah dari embrio segar.
Embrio beku akan mengalami
pencampuran dengan medium pembeku.
Apabila tersedia 6 embrio , sedangkan
hasil pembilasan 2 embrio maka dapat
dilakukan mikromanipulasi embrio untuk
produksi kembar identik

Pengembangan dan penggunaan

TE
1. IN Vitro Fertilisasi (IVF) --- ova dari RPH
2.

3.
4.

--- maturasi in vitro fertilisasi in vitro

Peningkatan keturunan (progeni) dari
bibit betina unggul. TE akan produksi
beberapa padet dalam sekali kawin
sehingga intensitas seleksi dapat
ditingkatkan
Pengembangan biakan sapi yang exotic
Reduksi interval genetis

4. Penentuan jenis kelamin

5. Kelahiran kembar
6. Pengawetan embrio
7. Manipulasi embrio mencakup kembar
identik, sexing klonning, chimera one
sperm injection dan transfer gen.

Sejarah TE
Dimulai tahun 1891 yang dilaporkan oleh
Heape yang dilakukan pada kelnci. Pada
tahun 1971 masih merupakan laboratorium
experimen dan sesudah tahun 1971 baru
pad sapi di Eropah seperti pada sapi
simental dan sapi limosin di USA ,Kanada
dan New Zeland dengan tujuan hanya untk
menghasilkan pedet yang langka,
sedangkan genetik make up belum
diperhatikan.

Sejarah TE di Indonesia
Introduksi TE pada sapi perah tahun 1984 oleh
Dep. Koperasi dg mendatangkan embrio beku
dari Texas yg bekerja sama dg tenaga asing
Granada Internasional corporation texas USA ,
harga embrio 200 dollar/embrio.
Pihak Indonesia hanya penyadiaan dan seleksi
resipien yang pantas menerima embrio.
Hasil 30 % bunting dari 200 resipien .

Tahun 1985 didatangkan tenaga ahli dari

Inggris yaitu kelompok internasional embrio . TE
dilakukan tanpa pembedahan pada sapi Bali, di
proyek P3 Bali ( donor dan resipien sapi bali).
Hasil 50 % - yaitu 5 13 embrio /donor
Dicoba TE pada kerbau tapi belum berhasil
Tahun 1986 didatangkan 200 embrio beku dari
Inggris oleh dirjen peternakan yang dialokasikan
di Jatim. Jabar da Jateng

Keuntungan TE
1. Didapatkan anak sapi yang unggul
2. Meningkatkan populasi ternakyang
3.
4.
5.
6.

seragam dan unggul

Embrio dapat dibekukan
Perbaikan genetik lebih cepat dan efektif
Kelahiran kembar
Penggunaan gen baru lebih cepat
terutama menyangkut resisten penyakit

Hambatan TE
1. Perlu tenaga ahli yang terampil terutama

dalam reproduksi
2. Perlu dukungan tatalaksana dan
pencatatan yang cermat
3. Mahal
Yang perlu diingat adalah teknologi baru
harus berpedoman pada terdahulu dan
telnologi baru tersebut harus
memperhatikan lingkungan

Rangkaian kegiatan TE
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Seleksi donor dan resipien

Sinkronisasi donor dan resipien
Superovulasi atau multiple ovulation
embrio transfer (MOET)
Inseminasi donor
Panen embrio atau flushing
Evaluasi embrio dan penyimpanan
transfer embrio pada resipien

1.Seleksi Donor dan Resipien

Identifikasi donor
1. 60 hari pascapartum
2. siklus berahi dan alat reproduksi normal
Kriteria donor
1. genetic superiority
2. reproduction ability
3. market value of progeny

SYARAT SYARAT DONOR

Dewasa kelamin
Pernah beranak dan bebas dari penyakit
s/c berkisar 1 2
Tidak pernah retentio secundinarum
Anak sudah harus disapih

SELEKSI RESIPIEN
Identifikasi resipien
1. 60 hari pascapartum
2. siklus berahi dan alat reproduksi normal
3. sapi dara harus besar
4. bebas penyakit reproduksi(endometritis)
Kriteria resipien
- tidak perlu unggul
- harus sudah diseleksi 2 siklus sebelum
program TE

Manajemen donor dan resipien

Harus memperhatikan nilai genetik yaitu
kemampuan menurunkan sifat yang diinginkan
pada turunan dengan kriteria pada :
1. sapi potong mencakup maternal breeding
value; weanning value dan yearling value.
2. sapi perah mencakup cow index; repeatability;
keserasian tipe; registrasi paper
Selain itu kesehatan dan makanan harus cukup
karena ternak yang sakit tidak respon terhadap
MOET

2.Sinkronisasi donor dan resipien

Sinkronisasi adalah penyerentakan berahi
sehingga terjadi berahi dan ovulasi
Tujuan sinkronisasi:
1. untuk menyamakan kondisi saluran
reproduksi donor dan resipen
2. untuk meningkatkan kerja hormon FSH
pada donor
Bahan yang digunakan PGF2 alpha

Organ sasaran PGF2alpha

Korpus luteum (KL) periodikum adalah KL yang
sedang berkembang dan runtuh secara
periodik pada betina sehat dan tidak bunting
2. KL graviditatum adalah KL yang ada pada
masa bunting
3. KL persisten adalah KL yang menetap pada
ovarium hewan tidak bunting tetapi mengalami
gangguan pada uterus
Prostaglandin ini dapat menyebabkan
keguguran pada ternak bunting. Hipofungsi
ovarium menyebabkan anestrus dan dapat
diblok dengan progesteron
1.

Parameter keberhasilan pemakaian

prostagalandin F2 alpha
1. Luteolisis setelah 1 atau 2 hari

penyuntikan yang ditandai dengan

berahi dan bila di palpasi tidak ada KL
2. Durasi siklus berahi pendek
3. Adanya gambaran berahi pada uterus
dan servix
4. Indek kebuntingan

Pemakaian prostaglandin
1. Palpasi rektal yaitu identifikasi KL pada

ovarium , kemudian di injeksi PG 1kali

atau PG1 dan estrus terjadi 48 96 jam
setelah penyuntikan
2. Tanpa palpasi rektal yaitu ada atau tidak
ada KL di injeksi 2 kali PG1 pada ke 1
dan PG2 pada ke 11
3. Hari 0 (estrus) kemudian di injeksi hari
ke 8 dan hari ke 10

Program sinkronisasi berahi pada

programTE
Donor
Hari: 0
11 14 25 27 29 30
36
------/-------/-------/-----/------/----/----/-----------/
pg1
pg2 E moet IB IB IB panen
Resipien
Hari 0
15 26 29
36
-----/----------------/-------/-------/---------------/
E
pg1 pg2 E
transfer

3.Superovulasi = MOET
Adalah penyuntikan hormon gonadotropin yang
meransang pembentukan banyak folikel dan
mematangkan lebih cepat sehingga terjadi ovulasi yang
banyak.
Pada ternak ruminansia adalah unipara sehingga
multiple ovulasi jarang terjadi dan selama masa produktif
hanya 4 ekor pedet ,walaupun folikel primer di ovarium
berkisar 100.000
Hormon gonadotropin di injeksi pada fase lutheal
( sebelum level progesteron turun) akan menstimulr
pematangan sejumlah folikel dan diberikan seb kadar
progesteron turun

Hormon gonadotropin utk MOET

1. FSH = folikel stimulating hormon
2. PMSG = pregnant mare,s serume
3.
4.
5.

gonadotropin
LH = leteinizing hormon
HCG = humane chorionic gonadotropin
LTH = luteotropin hormon
Semua hormon ini merupakan aplikasi
efektif dalam TE utk meransang agar
terjadi ovulasi ganda (multiple)

FSH = Folikel stimulating hormon

Berguna untuk meransang pembentukan dan
pematangan folikel
Waktu paruh 2 5 jam
Menghasilkan KL dan daya hidup embrio yang
baik
Dosis 2 6 mg/ suntikan dengan interval
setengah hari selama 4 hari berturut - turut
Penyuntikan dimulai pada hari ke 9 14 siklus
berahi
Pemberian FSH tidak perlu ditambah LH krn
FSH tidak bisa dipisahkan dengan LH

Kombinasi PGF2alpha dengan FSH akan

berguna untuk:
1. Ramalan terhadap suntikan gonadotropin dengan
berahi yang nyata
2. Bila PG diberikan maka berahi akan muncul 2 hari
kemudian
3. Apabila tidak ada PG maka berahi akan muncul 3
hari kemudian
Perbedaan ini disebabkan kadar estrogen yang
tinggi dalam darah pada treatmen MOET
Keuntungan dari FSH adalah tidak perlu
penambahan LH, banyak sel telur dan embrio
banyak yang hidup

PMSG=pegnant mare,s serume

gonadotropin

1.
2.

Mempunya efek yang sama dengan FSH

Suntikan tunggal dengan dosis 2500 i.u secara
i.m
Kelebihan PMSG adalah murah dengan masa
paruh 2 4 hari ( long acting effect)
Kelemahan:
antigenik tinggi sehingga mampu
menimbulkan antibodi/antihormon yang dapat
menekan fungsi ovari pada siklus berikutnya
Sering terjadi ovulasi tertunda(delayed
ovulation) karena masa paruh yang panjang

3. Adanya folikel yang tidak ovulasi atau

sistik folikel
4. Perlu penambahan HCG sebagai LH
pada waktu IB
PMSG ini dihasilkan oleh endometrium
dan tidak ditemukan dalam urin karena
hormon protein yang bermolekul besar
Mempunyai aktivitas meransang folikel

HCG= humane chorionic

gonadotropin
Adalah glikoprotein yang mengandung
galaktosa dan hexosamin
Bersifat luteinizing dan luteotropin
Dihasilkan pada hari ke 6 kebuntingan
(urin) pada plasenta
HCG memuncak pada pertengahan bulan
ke 2 dan rendah akhir bulan ke 3
kebuntingan saat progesteron mulai naik
bersama estrogen

Penyimpangan MOET
Bisa berlansung selamanya dan ada juga sesaat
pada ovarium
Sulit didapatkan embrio hidup yang disebabkan
sulit menseleksi sel telur yang baik oleh fimbrae
Output progesteron yang tinggi maka KL banyak
sehingga terjadi penyimpangan transpor dari sel
telur dalam oviduct
Repeat breeding yang ditandai dengan tidak
terjadi fertilisasi, kematian embrio dini, hormon
tidak seimbang dan kelainan genetik

Mekanisme pada penambahan

derajat ovulasi
Bertambahnya produksi dan pelepasan
hormon gonadotropin dari hipopisa
anterior
Bertambahnya respon ovari terhadap
pemberian gonadotropin
Kombinasi 1 dan 2
Palpasi pada saat berahi atau ovulasi
tidak boleh tetapi palpasi setelah MOET
atau sebelum koleksi sangat dianjurkan

4. Inseminasi Donor
Dapat dilakukan dengan kawin alam maupun
dengan IB
Prinsipnya sama dengan ternak yng tidak di
treatment MOET
IB dilakukan 2 hari setelah PG3 , adakalanya
tidak memperlihatkan berahi maka penggunaan
kandang khusus dengan deteksi yang cermat
sangat bermanfaat
Apabila dengan kawin alam maka pejantan
harus disatukan dengan donor sehari sebelum
berahi dan sehari sesudahnya dipisahkan

Apabila dengan IB baik semen beku mapun

semen cair diberikan beberapa kali
Apabila semen cair diberikan 2 x inseminasi
dengan interval 12 jam dan konsentrasi 50 juta
sperma motil
Semen cair lebih baik karena viabilitas lebih lama
dalam saluran reproduksi betina
Waktu inseminasi pertama adalah 12 jam setelah
awal berahi
Apabila dengan semen beku diberikan 3 x
inseminasi dengan 2 straw /inseminasidengan
konsentrasi 25 jutasperma motil

Semen yang digunakan harus yang

berkualitas baik karena pola hormonal
sapi yang berubah sehingga menciptakan
saluran reproduksi donor yang kurang
menguntungkan. Penggunaan semen
yang berkualitas sedang atau buruk sering
menghasilkan ova yang tidak terfertilisasi
atau embrio berdegenerasi.

Urungkan pelaksanaan IB bila:

Hewan sakit
Tidak ada indikasi berahi
Lendir berahi keruh dan bernanah
Hewan buntng
kurang dari 50 hari pascapartum

Harus diperhatikan dalam

pelaksanaan IB:
Hanya menggunakan semen beku dngan
motilitas > 40% sesudah thawing
Waktu pelaksanaan IB < 2,5 menit
sesudah thawing
Plastik sheat hanya sekali pakai
Harus pakai sarung tangan
Teknik inseminasi adalah metoda
rektovaginal dengan waktu dan tempat
deposisi semen harus tepat

Perhitungan waktu IB didasarkan pada

Waktu ovulasi :10 15 jam sesudah akhir
berahi
Waktu kapasitasi: 4 6 jam
Umur sperma: 24 jam
Umur ovum: 12 jam

Teknik inseminasi
Melalui rektovaginaldan inseminasikan pada
waktu ,tempat yang tepat
Faktor yang mempengaruhi pelaksanaan IB:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Perlakuan semen waktu inseminasi

Tempat deposisi semen
Keterampilan inseminator
Potensi reproduksi betina
Peternak dalam deteksi berahi
Sistim pelayanan

THAWING
Adalah pencairan kembali semen beku
sebelum diinseminasikan
Prosedur thawing;
1. Siapkan media thawing dengan temperatur air 32
38c (apabila >40c maka sperma akan mati)
2. Buka container dan pilih container yang berisi
semen beku
3. Angkat canister 50 mm dibawa canister
4. Ambil straw yang diinginkan
5. Letakkan steraw dalam media thawing selama 30
detik dan segera diinseminasikan

Prosedur IB
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

Siapkan peralatan IB
Bawa straw dalam termos 1 liter N2 cair
Siapkan betina pada kandang jepit
Thawing straw dg air pada temp 35 C (20 detik), atau 50C (10
detik) atau 75C selama 8 detik
Bersihkan da keringkan straw dg tissue
Masukkan straw dalam inseminasi gun dg ujung berkapas
dimasukkan lebih dulu
Tegakkan inseminasi gun setinggi mata
Gunting rata ujung strawdan tinggalkan 1cm diluar inseminasi gun
Pasang dan fixer plastik sheat
Fixer servik melalui rektum dg tangan kiri
Bersihkan dan buka vulva
Masukkan gun IB pada posisi 4
Semprotkan semen sambil menarik mundur gun dan catat tgl IB

Tolak ukur keberhasilan IB

1.

Non return rate = pengukuran dilakukan dengan

menghitung jumlah betina yang tidak kembali berahi
dalam kurun waktu 30 hari atau siklus berahi.
NR (%) = jumlah seluruh betina yang tidak kembali
berahi dibagi dengan jumlah seluruh betina yang
diinseminasi (pada waktu tertentu). Ukuran ini kurang
akurat karena belum tentu sapi yang tidak minta kmbali
adalah bunting. Tidak kembali minta kawin bisa saja
terjadi berahi tenang atau kematian embrio dini ,
disamping faktor kelalaian dalam pengamatan berahi
oleh peternak. Namun demikian dapat dengan cepat
diketahui.

2. Conception Rate = CR
Atau angka kebuntingan yang pengukuran
dilakukan setelah 60 90 hari inseminasi
terakhirdan ditentukan setelah palpasi
rektal. Untuk pengukuran CR (%)= jumlah
betina yang bunting pada IB pertama
dibagi dengan jumlah betina yang
diinseminasi . Standar angka kebuntingan
untuk indonesia adalah 60 %

3. Service per coception =s/c

Atau angka perkawinan perkebuntingan adalah
jumlah inseminasi atau service yang dibutuhkan
oleh seekor betina sampai menjadi bunting.
Sangat bermanfat apabila menggunakan semen
dari satu pejantan yang unggul. Perhitungan
bedasarkan S/C = banyaknya inseminasi atau
jumlah straw yang digunakan dibagi jumlah
betina yang bunting. Ideal s/c adalah 1.contoh
100 ekor sapi: 60 x 1 =60
20 x 2 = 40
10 x 3 = 30
10 x 4 = 40 t0tal = 60+40 +30 +40 = 170/100 =1,7

4. Calving Rate
Atau kelahiran adalah persentase jumlah
anak yang lahir dibandingkan dengan
jumlah betina yang di inseminasi. Hasil ini
merupakan evaluasi yang akurat dan
nyata dari pelayanan IB tetapi harus
menunggu waktu yang lama.
NR (%) = jumlah anak yang lahir dibagi
seluruh betina yang di IB.

5. Panen embrio/ koleksi embrio

atau flushing
Embrio dapat di panen dan dikoleksi dari
saluran telur maupun uterus
Panen dilakukan saat embrio saat
berumur 7 8 hari setelah IB terakhir
Media yang digunakan adalah PBS
(phospate buffer solution) dan FCS(foetal
calf serume)
Ada 2 cara panen embrio yaitu dengan
pembedahan dan tanpa pembedahan

Dalam TE embrio dapat di panen dalam

stadium dan lokasi tertentu yang
berpedoman pada umur
Embrio dapat terkoleksi 40 80 % dari
jumlah KL yang ada pada kedua ovarium
3 4 hari setelah ovulasi embrio berada
pada saluran telur
5 hari setelah ovulasi berada pada uteus

Metoda bedah
Embrio dibilas dari arah fimbrae ke utero tubal
junction (UTJ) atau sebaliknya, tetapi lebih baik
kearah fimbrae hasil lebih banyak
Dapat juga dari uterus ke arah fimbrae atau
sebaliknya
Keuntungan cara bedah adalah:
Jumlah media yang digunakan sedikit 20 75 ml
Pencucian dapat dilakukan dari pangkal uterus atau
dari uterus sampai fimbrae
Embrio lebih banyak didapat
Kerugian : 1. adhesi (pelekatan uterus) dan infeksi

Metoda tanpa bedah

Dilakukan pada hari ke 6 atau ke 8 dan
tidak bisa pada hari ke 1 atau ke 3
Sebaiknya donor dipuasakan sebelum
dibilas selama 24 jam
Diletakkan pada kandang jepit
Pembilasan dengan kateter foley (42 cm
panjang) dan bercabang dua serta
tempat kantong udara ( balon ) untuk
menutup pangkal uterus

Keuntungan ;
Lebih praktis
Menghemat waktu dan biaya
Kelemahan:
media yang digunakan lebih banyak 500 1000 ml
Pengurutan terlalu keras dapat menyebabkan
kerusakan endometrium
Yang harus diingat adalah diperlukan antibiotik setelah
panen untuk mencegah infeksi uterus dan baon untuk
menutup uterus harus pas serta jumlah cairan yang
masuk hartus sama dengan yang keluar

Faktor yang mempengaruhi jumlah

ova yang terkoleksi
Ova tidak dapat ditangkap oleh fimbrae karena
ovari terlalu besar
Ova menghilang dalam saluran reproduksi
karena adanya perobahan hormon steroid
Adanya pembentukan KL tanpa ovulasi
Faktor keterampilan dan ketelitian
Embrio dari uterus menghasilkan CR lebih tinggi
dari di panen pada saluran telur dan embrio
dapat dibekukan
Gunakan pembuka service waktu flushing yaitu
servikal ekspander

6. Penilaian embrio dan evaluasi

embrio
Setelah didapatkan hasil bilasan yg ditampung
dalam botol atau gelas tabung , diamkan jam
supaya embrio mengendap, lalu buang cairan
bagian atas.
Lalu periksa dibawa mikroskop
Evaluasi embrio bedasarkan pada keutuhan dan
kekompakan sel
Faktor penentu keberhasilan TE adalah kualitas
embrio yg berhub dg pregnant rate.
Berbagai stadium perkembangan embrio dapat
dijumpai dari hasil pembilasan.

Beberapa morphologi stadia

perkembangan embrio
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Morula = tersusun 32 sel , dg blastomer yg sulit

dibedakan satu sama lain
Morula kompak = blastomer mrpk massa sel yg
kompak menempati 60 70 % ruang peri vitelin
Blastosisi awal = mrpkn embrio yg telah membentuk
ruangan yg berisi cairan dis. Blastocoel
Blastosis = perbedaan antara lap tropoblas dg massa
sel jelas
Blastosisi memanjang = diameter embrio 1.5 kali
bertambah besar dan zona pelusida menipis
Blastosisi sudah pecah = mrpk embrio yg sudah pecah
seluruhnya dari zona pelusida

Identifikasi embrio
Koleksi 3 hari setelah inseminasi berada
pada stadium 4 8 sel terdapat pada
saluran telur
Pada har ke 4 = pada stadium 8 16 sel
terdapat pada uterus
Pada hari ke 5/6 = pada stadia morula
terdiri dari 32 sel
Pada hari ke 7 8 = berada pada stadia
blastosis

Menentukan kualitas embrio

Ada beberapa faktor:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Bentuk
Warna
Jumlah sel
Kekompakan sel
Jumlah sel yang menonjol dan degenerasi
Jumlah dan ukuran vesikel

Kategori kualitas embrio

1.

2.

3.
4.

Sangat baik= embrio yang ideal berbentuk bulat,

simestris, dan sel blastomer seragam dalam warna
,ukuran dan tekstur
Baik= ada sedikit kelainan seperti blastomer sedikit
menonjol, bentuk sedikit irreguler dan terdapat
beberapa vesikel
Cukup = kelainan embrio lebih menonjol dan lebih
jelas dan beberapa sel mengalami degenerasi
Jelek = kelainan embrio berat , banyak ditemui
penonjolan blastomer, adanya sel yang mengalami
degenerasi, sel mempunyai ukuran yang berbeda
namun masih hidup

Penanganan embrio
1. Penyimpanan jangka pendek : secara in

vitro dan in vivo

1. In vitro = dg media berisi glukosa dan Na

pyruvat (PBS = pospat buffer solution) dan
FCS 20 % diletakkan dalam incubator dg
suhu 37 C selama 24 48 jam
2. In vivo = dengan memasukkan embrio yang
telah dimasukkan dalam straw atau media
agar kedalam uterus domba atau kelinci
selama 1 minggu

2. Penyimpnan jangka panjang

embrio beku dan embrio yang digunakan
adalah pada tahap morulla atau blastosisi
yang masih mempunyai zona pelusida.
Kriteria embrio yang dapat dibekukan
adalah adalah yang berkualitas sangat
baik atau grade A

7.Transfer embrio pada resipien

Embrio yang telah dievaluasi dapat lansung
ditransfer pada resipien berupa fresh embrio
dan diletakkan pada apex cornua resipien.
Metoda dapat dengan pembedahan maupun
tanpa pembedahan (saat ini)
Metoda bedah yaitu dg anstesi umun dan tidak
dilakukan lagi karena berisiko tinggi
Metoda tanpa pembedahan dg menggunakan
gu TE atau gun IB dan memerlukan alat
pembuka servik kemudian embrio di transfer
pada apex cornua resipien

Beberapa masalah dalam kegiatan

transfer embrio pada resipien
1. Kateter hahus melalui servik yang

tertutup
2. Deposisi embrio jauh pada apex kornua
3. Terjadi kelelahan tangan dan
keterampilan khusus

SEMEN BEKU
SEMEN BEKU
Adalah semen yang disimpan pada temperatur rendah.
Prinsip semen beku dapat meningkatkan kemampuan hidup sperma utk
membuahi ovum dg penambahan gliserol
Prinsip penambahan gliserol adalah sebagai krioprotektan utk melindungi
sperma dari kerusakan krn pembekuan
Proses pembuatan semen beku dapat dg menggunakan bahan pengecer
ssusu skim atau kuning dan gliseo sebagai krioprotektan
Penambahan gliserol 3 10 % dalam bahan pengencer, antibiotik dan
fruktosa sbg sumber energi.
Semen beku dapat disimpan 20 tahun dan 30 40 % sperma mati dalam
proses pembekuan dan waktu thawing
Penambahan gliserol adalah untuk;

Menghambat kerusakan sel secara mekanik dg cara gliserol masuk kedalam sel
menggantikan air dan electrolit
Untuk mencegah cold shock dg memberi adaptasi atau keseimbangan molekul
antara sel sel spermatozoa dan bahan pengencer

PROSEDUR PEMBEKUAN
SEMEN
1.
2.
3.

4.
5.

Evaluasi dan pengenceran semen

Penambahan gliserol 7 % untuk pengencer citrat
kuning telur dan 10 % untuk air susu
Eguilibrasi( is suatu periode yg diperlakukan
pada spema sebelum pembekuan untuk
menyesuaikan diri dg pengencer) pada temp 5
C selama 3 4 jam
Pembekuan untuk kemasan straw diatas N2 cair
, pellet CO2 atau dry ice
Penyimpanan semen beku pada goblet dan
canister dalam container yang berisi N2 cair
pada temperatur 196 C .

Skema pembuatan semen beku

1.
2.
3.
4.
5.
6.

semen + pengencer I pada temp 25 30 C

Letakan semen dalam lemari es 1 -2 jam pada
temp 3 5 C
Gliserolisasi semen + pengencer II pada
temp. 3 5 C
Masukan dalam straw dan equilibrasi selama 4
6 jam pada temp. 3 5 C
Pembekuan diatas N2 cair ( 2 3 cm
ditasnya)
Penyimpanan pada kontainer yang berisi N2
cair pada temperatur 196 C

Manfaat dan kerugian semen beku

Manfaat
Pemanfaatan pejantan unngul secara maximal
Mengatas hanbatan waktu dan jarak
Praktis dan murah dalam transpor
Efisiensi seleksi
Kerugian
-10 20 % semen dari pejantan tidak tahan pembekuan
- Biaya produksi mahal
- 20 80 % sperma mati pada proses pembekuan
- Membatasi pejantan yang dipakai yang akan
membatasi genetik suatu bangsa ternak

Semen cair
Semen cair adalah semen yang telah diencerkan dg
bahan pengencer dan dapat tahan sampai 3 4hari
pada temperatur 3 5 C . Penambahan antibiotik 500
1000 iu/ml untuk penisilin 0,5 gr untuk streptomicin.
Semen cair dapat disimpat dalam gelas ukur atau
dalam straw.
keuntungan semen cair
-jumlah sperma per dosisi lebih sedikit sehingga dapat
banyak melayani betina
- tingkat kesuburan 2 3 % lebih tinggi dari semen
beku
- teknik pengolahan lebih sederhana
- lebih mudah penanganan di lapangan

1.

Pembuatan semen beku

Hasil evaluasi = +++/D/80P/8CC
Jumlah sperma motil = 80/100 x 800 = 640 juta/cc
Dosis semen cair 10 juta sehingga dosis pengencer = 8x640/10 =
512 x IB
Jumlah bahan pengencer = 512 8 cc = 504 cc
Jumlah antibiotik penicillin = 640 x 500 iu = 320.000 jadi
penambahan penicillin = 320.000/150.000 = 2.13 cc
Untuk semen beku dosis = 25 juta
Dosis pengencer = 8 x 640 / 25 = 204.8 x IB
Jumlah pengencer = 204.8 8 = 196.8
Penambahan antibiotik 204.8 x 500 iu = 102400/150.00= 0,68cc
Spteptomicin = 204,8 x 0,5 mg = 102 ,4 jadi 102,4/ 250 = 0,409 mg

Kriopreservasi embrio
Kriopreservasi adalah preservasi dg menyimpan sel pada
temperatur yang sangat rendah
Pembekuan adalah merubah cairan menjadi beku
Krioprotektan adalah zat kimia non elektrolit yang berfungsi
mereduksi pengaruh letal dari proses kriopreservasi
Prinsip dari kriopreservasi : pengeluaran sbgn besar air dari sel
sebelum membeku intra seluler
Ada 2 macam krioprotektan :

Krioprotektan intra seluler adalah krioprotektan yang dapat keluar

masuk melalui membran sel dan biasa ukuran mol kecil ( gliserol,
DMSO = dimethylsulfoxida) , ethilen glucol dll
Krioprotektan ekstra seluler adalah krioprotektan yang tidak dapat
menembus membran sel dan bermolekul besar ( sukrosa, protein, lipo
protein, kuning telur, serum dan susu)

Kerusakan sel akibat krioprervasi

Kerusakan mekanis dg timbulnya pembentukan kristal
es intra seluler yang dapat mempengaruhi struktur sel
2. Adanya dehidrasi dari suspensi media baik intra
maupun ekstra seluler sehingga konsentrasi larutan
menjadi toksin dan letal
3. Perubahan dehidrasi kimia dan fisika diantara;
denaturasi, koagulasi dan kehingan sifat sifat
pengikatan air
4. Interaksi dari ketiga faktor diatas
Jika dehidrasi tidak terjadi akan terbentuk kristal es besar
intra seluler yang dapat merusak sel sel . Pada
keadaan tertentu pengeluaran air yg banyak dapat
merusak dan letal karena sel akan kekeringan
1.

Osmotis sel
PBS memp. Konsentrasi (osmolaritas) sekitar
300 mosm/kg yang seimbang dengan
konsentrasi molekul dalam sel misalnya protein
Rspon sel hewan terhadap PBS:
Isotonik = adalah konsentrasi sel dan larutan sama
sehingga sel tdk berubah
Hipotonik = apabila konsentrasi molekul intraseluler
lebih rendah maka sel akan mengkerut
Hipertonik= apabila konsentrasi molekul intra seluler
lebih tinggi sehingga air masuk kedalam sel dan sel
akan mengembang

Fungsi dari krioprotektan

Freezing , khususnya intraseluler freezing.
Membutuhkan krioprotektan karena mampu
menekan titik beku tidak saja 2 3 C lebih
rendah tetapi secara bertahap . Pembekuan
intraseluler terjadi pada suhu -25 sampai 35
C
2. Interaksi dg dinding sel yg dapat melindungi
dari kerusakan dg mengurangi dari kerapuhan
3. Mengurangi efek konsentrasi yang terlalu
tinggi karena dehidrasi akibat dari molekul
yang larut dalam campuran air dan
krioprotektan
1.

Prosedur pembekuan embrio

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Koleksi embrio dan isolasi embrio

Pencucian embrio
Klasifikasi embrio
Equilibrasi embrio 6 10 menit pada tempat yang
berisi medium dg gliserol
Penandaan container dan cane
Pemindahan embrio kedalam ampul gelas atau straw
yang berisi gliserol 0,2 ml dan 0,2 ml PBS dan di patri
Pengisian cane dg straw atau ampul
Pembekuan embrio dalam freezer automatik dengan
penurunan suhu 1C/ menit sampai 4 C
Penyimpanan embrio dalam kontainer pada temperatur
196 C

Keuntungan dan krugian

pembekuan embrio
Keuntungan
1. Embrio dapat disimpan dalam waktu tidak terbatas
2. Embrio dapat dikoleksi sepanjang tahun dan
ditransfer pada waktu musim kawin
3. Pelestarian plasma nutfah
4. Surplus embrio dapat disimpan
Kerugian:
1. Biaya mahal
2. Hanya embrio yang berkualitas A yang dapat
dibekukan
3. 10 % dari embrio setelah thawing akan rusak berat

In vitro fertilisasi (IFV)

IN VITRO = diluar tubuh
IN vitro fertilisasi= pembuahan diluar tubuh
Tujuan IVF pada
Kedokteran manusia untuk terapi infertilitas
yang dilanjutkan dengan TE
Pada peternakan untuk tes pejantan dan
untuk memanfaatkan ovarium dari RPH serta
produksi embrio dalam jumlah banyak

Proses IVF
1.

Maturasi oosit in vitro dapat dilakukan dg berbagai metoda

1.
Oosit dikeluarkan dari dalam folikeldan dipupuk secara in vitro
2.
Oosit dalam folikel dipupik in vitro
Cara maturasi adalah oosit diaspirasi atau diisap atau di slicing (disayat)
dari folikel yg berdiameter 1 5 mm . Proses pematangan oosit terdiri
dari 2 tahap yaitu periode pertumbuhan dan periode persiapan akhir
dari inti dan sitiplasma sebagai pranyasat dari fertilisasi. Medium
yang digunakan adalah TCM- 199 dan ditambah dengan FSH atau
PMSG. Lama wakti inkubasi adalah 24 jam pada temperatur 37 -39
C . Oosit yang matang ditandai dengan terbentuknya polar body I
Prosedur maturasi oosit:

Koleksi ovarium

Koleksi oosit

Evaluasi oosit

inkubasi

Evaluasi oosit
1. Oosit yang belum matang (immature

oocyte) terdiri dari 3 fase

1. Komplek dg kumulus oophorus dan korona
radiata yg kompak, oosit tdk jelas
2. Komplek dg kumulus oophorus yang
sedikit , korona radiata yg kompak oosit tdk
jelas
3. Komplek dg kumulus oophrus , korona
radiata kompat dan oosit tampak samar

2. Oosit matang (mature oocyte) terdiri dari 2 fase yg

merupakan kelanjutan dari pematanga:
- omplek dg korona radiata dan kumulus oophorus yg
longgar (expanded kumulus), sedikit berlendir
(musifikasi) oosit tampak jelas, tapi belum memiliki
benda kutub
- Komplek dengan korona radiata , kumulus oophorus yg
longgar, cukup lendir , oosit tampak jelas, dan memiliki
b.k Iatau metafase II
3. Post mature oosit = oosit dg corona radiata yg lepas,
sedikit oophorus, atau tampa kumulus, ada b.k.
4. Degenerasi oosit =korona radiata bervariasi , kumulus
lepas dan oosit degenerasi atau piknotis atau pengecilan

Faktor yang mempengaruhi

maturasi oosit in vitro
Mosphologi kumulus
2. Ukuran folikel
3. Stimulasi ovarium
4. Prosedur penanganan
Viabilitas oosit dipengarhi :
1.

Metoda koleksi oosit

Sumber oosit
Kualitas oosit
Koleksi dan transportasi ovarium dari RPH

Perkembangan pematangan inti

oosit
1. Stadium inti (GV) = inti dikelilingi lapisan
2.

3.
4.

yg pekat yang tidak terlihat jelas

GVBD=peleburan yaitu pemisahan dan
peleburan sitoplasma serta
nukleoplasma (4jam)
Metafase I = terjadi peleburan inti
sehingga tdk terlihat jelas (12 14 jam)
Metafase II= terdapat benda kutub II
atau stadium matang (10 24 jam)

2. Kapasitasi spermatozoa in vitro = adalh proses yg

dialami sperma shg mampu membuahi sel telur
perubahan yang terjadi pada waktu kapasitasi adalah :
1. proses perubahan dari membran sperma yg awalnya
bersifat stabil menjadi labil
2. pelenyapan inhibitor enzim acrosom
Untuk mendapatkan sperma yg telah kapasitasi ada 2 cara;
1, dg membilas alat reproduksi betina beberapa saat
ssudah dikawinkan
2. secara in vitro = dg jalan menginkubasi sperma dalam
medium inkubasi (BO = brackett oliphant) , mencakup
pencucian sperma utk memisahkan plasma semen dan
proses inkubasi selam 30 menit pada suhu 38 C

3. Fertilisasi ovum oleh sperma dg cara:

- oosit dicuci 3 x kemudian dimaskkan dalam
medium fertilisasi ( TALP = tyroode albumin
laktate pyruvat acid) pada cawan petridis 50ul
medium + 50 ul semen diinkubasi selama 24
jam pada suhu 38 C . Fertilisasi ditandai dg :
- penetrasi sperma pada ovum
- terbentuknya pronukleus jantandan betina

Mikromanipulasi embrio
Mencakup klonning, transgenik , ICSI dan suzi
Tujuan : untuk mengetahui atau evaluasi potensi
perkembangan dari satu buah blastomer
Hasil penelitian memberi informasi bahwa embrio (8 sel)
adalah totipoten dan mempunyai potensi untuk
menghasilkan keturunan yang lebih banyak dari sebuah
embrio
Hambatan : embrio dini tidak mampu hidup secara in vitro
tanpa zona pellusida yang utuh , sehngga teknik ini
dikembangkan dengan teknik agar embedding
Manipulasi embrio dilakukan dg cara beda mikro
(mikrosurgery) dan dari satu sel atau blastomer ditransfer
ke z.p. yang dibuang sitoplasma kmd dilapisi agar dan
ditransfer dalam oviduk domba dietrus

Metoda mikrosurgeri ini telah

menghasilkan anak kembar 2, 4 identik
pertama pada sapi dan babi serta
menghasilkan kembar 2 dari embrio yang
diperoleh pada hari ke 5 dari manusia
melalui teknik tanpa bedah

Klonning
Adalah sistim untuk menghailkan ternak yang
mempunyai susunan genetik sama
Ada bebeapa cara
1. Produksi kembar 2 melalui pembelahan embrio.
Prosedr pembelahan (bisection) dapat dengan
tanpa pembedahan pada embrio hari ke 5 atau ke 6
dan embrio paruh hasil splitting dapat segera
ditransfer dg menggunakan jarum mikro dari kaca
untuk membuka z.p dan satu buah pipet transfer
dari kaca untuk memindahkan massa sel embrio
dari zona.

Embrio tanpa z/p/ dibagi menggunakan mikro

scaple dan separoh dikeluarkan massanya
dengan pipet transfer . Hasil 64,2 % bunting
dengan angka kelahiran 66,6 %
Di colorado embrio paruh dengan embrio tetap
pada z.p. dengan menggunakan pisau yang di
lem pada suatu pipe kapiler dari kaca untuk
membagi embrio utuh. Suatu pipet gelas untuk
menstransfer embrio pada z.p. kosong
Hasil 20 embrio ditransfer dengan pembedahan
(14 embrio) dan 6 tanpa pembedahan pada
resipien. Tingkat kebuntingan 64 % dan 17 %.

Metoda sederhana -- pada tahap morulla atau blastosis

akhir
Prosedur jarum halus dari kaca untuk penetrasi dan
membagi 2 morulla / blastosis yang mempunyai zona
pellusida utuh atau blastosis akhir yang tidak mempunyai
zona pellusida kemudian ditransfer dan hasilnya 89 %
angka kebuntingan
Teknik pembelahan secara cepat tanpa mikromanipulasi
yaitu embrio utuh ditempalkan pada mikro drop dari
medium pada skol mikroskop dan sebuah pisau.
Ditempelkan pada sepasang hemostat untuk membagi
embrio. Hasil 98 % embrio utuh berhasil dibagi 2 dan
tingkat kebuntingan sama

2. Pembentukan hewan klonning

melalui transfer inti
Pertama diperkenalkan oleh Spearman (1938)
untuk mempelajari deferensiasi sel.ada 2
potensi penggunaan transfer inti:
1. Penggandaan dari ternak unggul atau embrio yang
dihasilkan dari perkawinan yang terseleksi
2. Kemampuan menghasilkan keturunan dari sel sel
yang dapat dipertahankan dalam kultur sebelum
digunakan untuk rekonstruksi embrio dan untuk
memodifkasi genetik.
Transfer inti melibatkan transfer materi genetik dari
sel sel donor (karyoplast) pada sebuah oosit atau
zigot yang dikeluarkan material genetk

Pengeluaran inti dngan jalan melewati membran

sitoplasma dibagian bawah polarbody I . Introduksi
material genetik donor dicapai dengan induksi sel yang
berfusi, tetapi teknik ini dibatasi oleh area kontak sel
donor dan resipien serta ukuran karyoplast.
Pengaturan siklus sel donor dan resipien

Siklus hidup proses dalam inti sel dibagi 4 fase

1. fase S yaitu peride DNA kromosom diduplikasi
2. fase G1 yaitu fase sebelum fase S yaitu saat inti mengandung
DNA dipoid
3. fase G2 yaitu periode inti mempunyai sebuah tetraploid atau
kandungan DNA
4. mitosis yaitu saat DNA inti dikondensasikan kedalam
kromosom dan disegregasi secara seimbang kedalam 2 sel
anak yang baru.


Permulaan mitosis dikontrol oleh aktivitas sitolasmic yang disebut dengan MPF (
maturating mitosis/miosis promoting faktor)

G0

G2
G1
S

Pengaruh siklus sel terhadap inti

yang ditransfer
Oosit M-II mengandung level MPF yang
tinggi .
Bila oosit MII digunakan , MPF mendorong
perubahan morfologi dalam inti sel donor
setelah fusi termasuk rusaknya selaput inti
(nuklear envelop breakdown ,NEBD) dan
kondensasi kromosom dini (prematur
chromosome condensation,PCC)

Pengaruh MPF terhadap

perkembangan embrio rekontruksi
1.

2.

Lansung NEBD dan PCC tergantung pada fase siklus

sel dari donor inti pada waktu transfer. Apabila inti
pada fase S didorong untuk mengalami PCC dengan
MPF ,kromatin --- tinggi abnormalitas. Sebaliknya bila
G1 dan G2 yang didorong untuk PCC kromatin akan
membentuk kromatid tunggal dan kromatid ganda dan
tidak memperlihatkan kerusakan sel
Tidak lansung seluruh inti ditransfer pada waktu
aktivasi bila level MPF tinggi mengalami NEBD yang
diikuti oleh kondensasi kromoson prematur. Selaput
inti kembali dibentuk dan sintesa DNA terjadi pada
seluruh inti. Diduga inti berada pada tahap G1 saat
ditransfer

Hewan transgenik
Merupakan teknologi yang menghasilkan ternak
yang mengalami perubahan genotip tertentu
Transgenik pertama pada mencit melalui
mikroinjeksi satu DNA rekombinan yang
dibentuk dari pronuklei zigot.
Melalui cara ini 1,5 % zygot mencit berkembang
menjadi hewan transgenik
Di AS menggunakan embrio sapi yang diinjeksi
dengan DNA hasil rendah hanya 0,2 % yang
berhasil ditransfer

Hewan transgenik akan memperlihatkan penotip yang

berbeda atau baru sebagai ekspresi dari molekul DNA
asing. Proses ini melibatkan injeksi atau pemasukan gen
asing kedalam sel ternak yang sedang mengalami
perkembangan
Teknologi transgenik memperluas pengetahuan secara
drastis terhadap regulasi gen dan komponen- komponen
Penerapan teknologi ini untuk meningkatkan produksi
dan pemanfaatan ternak
Pada saat ini tujuan
Untuk mengembangkan model dalam penelitian penyakit,donor
jaringan dll
Peningkatan ketahanan terhadap penyakit dan penampilan
pertumbuhan

Subzonal inseminasi (suzi) dan

intracytoplasmicsperm injection
(icsi)

Suzi dan ICSI adalah manipulasi mikro

yang ditujukan untuk meningkatkan atau
mengatasi hambatan fertilisasi baik pada
hewan maupun manusia
Tujuan pada ternak untuk meningkatkan
pemanfaatan klonning dan transgenik
Pada manusia untuk mengatasi infertiitas
dan telah menghasilkan 2000 anak

Subzonal inseminasi ( suzi)

Adalah penempatan satu sperma atau
lebih kedalam ruang vitelin
Cara ; pipet injeksi ditanamkan pada zona
dan berhenti dekat benda kutub I
Jumlah sperma sangat menentkan hasil
teknik ni
Pada mencit injeksi satu sperma yang
telah berkapasitasi tingkat fertilisasi
tinggi

Intra cytolasmic sperm injection

(ICSI)
Adal sperma atau komponen sperma
dapatlansung kedalam oosit
Pada sapi oosit yang matang in vitro di injeksi
dengan sperma beku yang telah mati dapat
menghasilkan anak setelah embrio ditransfer
pada resipien
Oosit diaktivasi dengan calsium ionphor
Telah berhasil pada domba lahir anak jantan
dari oosit yang diinjeksi dengan sperma yang
masih mudah