Kemajuan Terkini dalam Produksi Embrio Sapi pada IVF (In Vitro Fertilisasi) : Sejarah

dan Metode Reproduksi Bioteknologi

oleh
L. B. Ferre, M. E. Kjelland, L. B. Strobech, P. Hyttel, P. Mermillod dan P. J. Ross
Abstrak
Produksi embrio in vitro (IVF) dan teknologi terkaitnya pada ternak sapi telah menunjukkan
kemajuan signifikan dalam beberapa tahun terakhir, sebagian didorong oleh pemahaman yang
lebih baik mengenai potensi penuh dari alat-alat ini oleh pengguna akhir. Kombinasi antara IVP
dengan sexed semen (SS) dan seleksi genomik (GS) telah digunakan dengan sukses dan luas di
Amerika Utara, Amerika Selatan, dan Eropa. Keuntungan utama yang ditawarkan oleh teknologi-
teknologi ini meliputi jumlah embrio dan kehamilan yang lebih tinggi per satuan waktu, serta
rentang calon donor betina yang lebih luas untuk pengambilan ovosit (termasuk betina yang
sedang dalam siklus terbuka dan yang sedang hamil hingga 3 bulan), termasuk anak sapi
genomik dengan indeks tinggi, penggunaan jumlah sperma yang lebih sedikit untuk
menghasilkan embrio, dan peningkatan peluang untuk mendapatkan jenis kelamin keturunan
yang diinginkan. Namun, masih ada beberapa aspek dari produksi embrio in vitro yang belum
terpecahkan, yang membatasi penerapan teknologi ini secara lebih luas, termasuk kemungkinan
penurunan kesuburan akibat penggunaan SS, penurunan kualitas ovosit setelah pematangan
ovosit in vitro, dan tingkat ketahanan embrio terhadap pembekuan yang lebih rendah, yang
mengakibatkan penurunan tingkat keberhasilan kehamilan dibandingkan dengan embrio yang
dihasilkan secara in vivo. Meskipun demikian, hasil penelitian yang menjanjikan telah
dilaporkan, dan penelitian sedang dilakukan untuk mengatasi kekurangan yang ada saat ini.
Kombinasi GS, IVP, dan SS telah terbukti berhasil di bidang komersial di beberapa negara,
membantu praktisi dan produsen ternak sapi dalam meningkatkan performa reproduksi, efisiensi,
dan peningkatan genetik.

Pendahuluan
Kemajuan ilmiah dan teknologi yang dicapai selama beberapa dekade terakhir dalam reproduksi
hewan telah menghasilkan berbagai alat yang umumnya disebut sebagai teknologi reproduksi
terbantu (ART). Fokus utama dari alat-alat ini adalah untuk memaksimalkan jumlah keturunan
dari hewan dengan kualitas genetik yang unggul dan menyebarkan germplasma ke seluruh dunia
(Berglund, 2008). Selain itu, ART memungkinkan penggunaan donor dengan cacat anatomi yang
dapat dikompensasi dan kondisi sub-fertilitas, untuk melindungi germplasma dari spesies yang
terancam dan ras domestik, serta untuk mengurangi paparan dan penularan penyakit.
Sementara jumlah embrio yang dihasilkan dan ditransfer secara in vivo di seluruh dunia
cenderung stabil dalam beberapa tahun terakhir, transfer embrio yang berasal dan ditransfer dari
produksi embrio in vitro (IVF) terus tumbuh dengan laju pertumbuhan tahunan rata-rata sebesar
12% (Gambar 1a). Pada tahun 2016, dan untuk pertama kalinya dalam sejarah yang tercatat,
jumlah embrio IVF yang dapat berkembang melebihi jumlah embrio yang dapat ditransfer yang
dihasilkan secara in vivo, berdasarkan data yang dicatat oleh International Embryo Transfer
Society (IETS). Namun, peristiwa bersejarah ini hanya berdasarkan data yang dinyatakan yang
dikirimkan kepada IETS oleh partisipan sukarelawan, dan kemungkinan besar tidak mencakup
jumlah keseluruhan (yaitu produksi embrio yang dinyatakan dan tidak dinyatakan) embrio IVF
dan embrio yang dihasilkan secara in vivo di seluruh dunia; oleh karena itu, ada kemungkinan
bahwa peristiwa sebenarnya bisa terjadi bahkan lebih awal. Tren ini menunjukkan pergeseran di
kalangan produsen bibit unggul dari MOET tradisional menuju IVF (Gambar 1a). Menariknya,
pergeseran tersebut juga dikombinasikan dengan kecenderungan peningkatan efisiensi prosedur
IVP (Gambar 1b).

Menurut statistik produksi embrio tahunan yang disajikan oleh IETS dalam beberapa tahun
terakhir, lebih dari 400.000 embrio sapi IVF ditransfer di seluruh dunia (Gambar 1a). Dari total
embrio yang ditransfer, sekitar 80% di antaranya ditransfer dalam keadaan segar (Gambar 2). Hal
ini mencerminkan fakta bahwa embrio yang diproduksi in vitro memiliki ketahanan terhadap
pembekuan yang lebih rendah dibandingkan dengan embrio yang dihasilkan secara in vivo. Pada
akhir tahun 1990-an, jumlah embrio beku yang ditransfer (baik in vivo maupun IVP) hampir
sama dengan embrio segar (non-dibekukan). Kemudian, rasio embrio segar IVP yang ditransfer
meningkat, tetapi dalam beberapa tahun terakhir (2014 hingga 2016) terjadi peningkatan jumlah
transfer embrio beku yang berasal dari IVF, mungkin karena penggunaan media kultur yang
lebih canggih tanpa (atau dengan kadar serum yang rendah) dan/atau dengan penambahan bahan
tambahan yang mempromosikan kualitas embrio. Alasan lain yang mungkin di balik peningkatan
transfer embrio beku IVP adalah peningkatan efisiensi yang terkait dengan penggunaan kultur
bersama dalam IVP.
Menuju akhir tahun 1980-an, kombinasi teknik pengambilan ovum berpandu ultrasonografi
(Pieterse et al., 1988), biasanya disebut sebagai ultrasound-guided ovum pickup (OPU) (Ward et
al., 2000), dan IVP mulai tersedia. Beberapa pusat inseminasi buatan di Eropa menerapkan OPU-
IVP sebagai alat utama untuk menggandakan hewan dengan nilai genetik tinggi. Di Amerika
Serikat, kombinasi teknologi OPU-IVP diadopsi secara komersial pada akhir tahun 1990-an.
Pada saat itu, teknologi ini digunakan terutama untuk menghasilkan embrio dari betina yang
"bermasalah" yang dengan alasan yang berbeda tidak dapat menghasilkan embrio yang dapat
berkembang secara normal dengan MOET konvensional. Dalam kondisi tersebut, perkembangan
komersial teknologi ini lambat, sedangkan baru-baru ini, dan didorong oleh pengenalan semen
berjenis kelamin (SS) dan seleksi genomik (GS) embrio (Johnson, 1995; Welch and Johnson,
1999), aplikasi komersial IVP telah meningkat secara signifikan (Sirard, 2018). Hasil IVP terbaru
(Gonzalez-Marin et al., 2017) dan kenyataan bahwa SS dari banteng-banteng elit lebih mudah
diperoleh, keduanya berkontribusi pada terus meningkatnya penggunaan IVP di pasar ternak.

Salah satu faktor utama yang menyebabkan peningkatan penggunaan IVF adalah teknologi
"reverse sorting", yang melibatkan pencairan beberapa batang semen konvensional non-berjenis
kelamin, kemudian memisahkan sperma berjenis kelamin menggunakan flow cytometry, dan
langsung menggunakan sperma yang sudah dipisahkan tersebut untuk IVP (Morotti et al., 2014).
Metode ini, yang diperbaiki oleh Trans Ova Genetics, memungkinkan pemisahan jenis kelamin
pada hampir semua semen sapi yang disimpan dan dibekukan.

Perkembangan alat-alat genetik baru telah meningkatkan seleksi hewan melalui GS dan
memungkinkan peningkatan genetik yang cepat (Goddard et al., 2010). Kombinasi ART (MOET,
IVP) dan GS memaksimalkan peningkatan genetik pada ternak sapi (Gambar 3). Selain itu,
penggunaan biopsi dari embrio yang tidak terimplantasi atau amniosentesis dengan GS pada
heifer yang lebih muda telah meningkatkan tekanan seleksi genetik bahkan lebih jauh
(Kasinathan et al., 2015). Meskipun beberapa keterbatasan dari pendekatan ini telah ditemukan
(misalnya, biaya tambahan dan pertimbangan etis (Kasinathan et al., 2015)), sebuah penelitian
terbaru menunjukkan bahwa biopsi embrio tidak mempengaruhi viabilitas dan tingkat
keberhasilan kehamilan embrio IVP (de Sousa et al., 2017).
Embrio dapat dihasilkan melalui IVP dari heifer dan sapi betina dalam siklus terbuka serta betina
yang tidak merespons dengan baik terhadap perawatan superovulasi, memiliki kelainan pada
saluran reproduksi yang mengganggu transportasi gamet, atau berada dalam kondisi terminal
(usia, kesehatan, kecelakaan). Demikian pula, hewan yang sedang hamil pada trimester pertama
kehamilan, sapi pasca melahirkan (laktasi), dan anak sapi pra-pubertas dapat digunakan untuk
IVP, serta indung telur yang dikumpulkan di rumah pemotongan hewan (Galli et al., 2003).

Anak sapi pertama yang diperoleh secara eksklusif melalui IVP, yaitu pematangan in vitro (IVM)
dari ovum, fertilisasi in vitro (IVF), serta perkembangan embrio in vitro (IVD), dilaporkan pada
akhir tahun 1980-an (Goto et al., 1988). Kemajuan signifikan telah dicapai dalam pemahaman
tentang kebutuhan gamet/embrio dan metabolisme yang memungkinkan formulasi media budaya
yang lebih baik untuk mencapai produksi total yang lebih tinggi dan kualitas embrio yang lebih
baik (Hansen, 2006) serta mengurangi terjadinya sindrom keturunan besar (large offspring
syndrome, LOS) (Farin et al., 2001). Kemajuan besar dalam IVP saat ini bertujuan untuk
meningkatkan kinerja keseluruhan pada semua tahap: stimulasi ovarium, pengambilan ovum,
pematangan, fertilisasi, perkembangan embrio, pembekuan, transfer, dan pembentukan
kehamilan.
Perawatan ovarium dan pengambilan ovum
Ovum untuk IVP dapat diperoleh melalui (1) aspirasi folikel yang dipandu dengan ultrasonografi
dari hewan hidup atau melalui ovariectomy atau (2) aspirasi folikel pasca kematian (indung telur
yang diperoleh dari rumah pemotongan hewan). Dalam kedua skenario tersebut, ovum diambil
dari kumpulan folikel antral yang heterogen, dengan ukuran 2 hingga 8 mm, termasuk folikel
dari gelombang folikel yang tidak ovulasi dan ovulasi serta folikel dominan dan subordinat
dalam gelombang tersebut. Ovum di dalam folikel dominan yang besar sedang dalam proses
yang disebut prematurasi atau kapasitasi, mempersiapkan diri untuk pematangan akhir, fertilisasi,
dan perkembangan embrio (Hyttel et al., 1997).
Dalam kasus aspirasi folikel (Bols et al., 2005), mungkin memperoleh empat hingga lima ovum
(dengan tingkat kualitas 1 dan 2; (de Loos et al., 1989)) yang dapat digunakan per sesi donor
(Hasler, 1998) dari betina Bos taurus yang tidak distimulasi, sedangkan stimulasi dengan FSH
dapat meningkatkan tingkat pemulihan ovum menjadi 20 per sesi donor Holstein (Vieira et al.,
2016). Donor (terbuka, hamil, pra-pubertas) dapat menjalani aspirasi folikel dengan frekuensi
satu hingga dua kali seminggu, dengan atau tanpa stimulasi (Chaubal et al., 2007). Selama skema
OPU intensif (misalnya, dua kali seminggu), perlu memperhatikan hal-hal khusus seperti
kesejahteraan hewan, anestesi epidural berulang, integritas stroma ovarium, dan adhesi (McEvoy
et al., 2006). Akibatnya, lebih banyak embrio dapat dihasilkan dari donor yang distimulasi
(Chaubal et al., 2007). Upaya terbatas dilakukan untuk meningkatkan protokol sinkronisasi dan
stimulasi saat ini untuk donor OPU.

Pada sapi Bos indicus, penggunaan FSH sebelum OPU masih kontroversial. Beberapa penelitian
telah menunjukkan peningkatan jumlah total ovum yang dipulihkan, ovum yang layak, embrio
yang dihasilkan, dan tingkat konsepsi setelah transfer (Fernandes et al., 2014), sementara yang
lain berpendapat bahwa stimulasi FSH mengurangi tingkat pembelahan, blastosis, dan penetasan
(Monteiro et al., 2010). Penting untuk dicatat bahwa terdapat kasus-kasus pada Bos indicus di
mana stimulasi FSH sebelum OPU juga memberikan efek positif pada IVF dan tingkat
kehamilan yang dihasilkan (Cavalieri et al., 2017).
Namun, perlu dicatat bahwa umumnya dalam situasi di lapangan (pada peternakan), praktisi
tidak melakukan sinkronisasi dan stimulasi pada donor Bos indicus karena pertimbangan
efektivitas biaya, karena Bos indicus umumnya menghasilkan lebih banyak ovum per aspirasi
tanpa sinkronisasi maupun stimulasi dibandingkan dengan Bos taurus, yaitu 15,1 ± 1,9
dibandingkan dengan 7,8 ± 0,8, masing-masing (Rata-rata ± SD) (Fernandes et al., 2014).
Meskipun terdapat perbedaan signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok yang
disinkronisasi baik pada Bos indicus maupun Bos taurus, stimulasi FSH hanya efektif secara
signifikan pada donor Bos taurus (Fernandes et al., 2014), yang menyoroti perlunya
mempertimbangkan keberhasilan biologis dan efektivitas biaya sebagai faktor penentu dalam
menentukan metode yang digunakan.
Untuk memodifikasi kualitas ovum dalam folikel, diperlukan manipulasi dinamika dan fungsi
folikel melalui pengobatan hormonal (Merton et al., 2003) dan/atau pola makan (Webb et al.,
2004). Beberapa pendekatan telah diusulkan untuk meningkatkan jumlah folikel dan kualitas
ovum (yang diukur sebagai tingkat embrio yang dapat bertahan hidup) dalam program OPU.
Strategi-strategi tersebut meliputi: (1) stimulasi donor dengan gonadotropin (Sendag et al.,
2008), (2) pra-maturasi parsial in vivo, yang disebut "coasting" (Nivet et al., 2012), dan (3)
suplementasi makanan dengan konsentrat energi yang kaya akan asam lemak (Dunning et al.,
2014).
Perlu dicatat bahwa resolusi layar ultrasound dan karakteristik probe memiliki dampak besar
pada efisiensi pemulihan ovum (Bols et al., 2004) dan, mungkin yang lebih penting, dalam
mengurangi risiko kerusakan yang tidak perlu pada jaringan ovarium. Mesin ultrasound yang
lebih baru menunjukkan folikel dengan diameter kecil (2 hingga 3 mm) yang mungkin tidak
ideal untuk mengambil ovum, namun tetap cocok untuk memilih donor berdasarkan jumlah
folikel antral ovarium (Silva-Santos et al., 2014). Pemulihan kompleks ovum kumulus (COC)
sangat berkorelasi dengan produksi embrio dan jumlah kehamilan (Watanabe et al., 2017),
namun tidak berkorelasi dengan tingkat keberhasilan kehamilan (Feres et al., 2018). Fitur-fitur
ultrasonografi Doppler yang lebih baru memungkinkan evaluasi aliran darah folikel, yang dapat
digunakan untuk mencegah kontaminasi darah dalam tabung pengambilan.

Laparoscopic ovum pickup (LOPU) baru-baru ini menarik minat di kalangan perusahaan IVP
komersial sebagai alat yang layak untuk mengambil COC dari anak sapi berusia 2 hingga 6 bulan
(Baldassarre et al., 2018). Teknik ini, yang umumnya digunakan pada ternak kecil (Cognié et al.,
2003), dapat berkontribusi untuk mempercepat penyebaran genetika unggul, yang lebih lanjut
mendorong perbaikan genetik melalui hewan muda genomik terbaik.
Pematangan ovum
Pematangan ovum melibatkan perubahan inti serta sitoplasma dalam gamet yang sedang
berkembang. Pematangan inti ovum mengacu pada perkembangan meiosis dari prophase
pembelahan meiosis pertama hingga metafase pembelahan meiosis kedua (MII) pada saat
ovulasi. Bersamaan dengan pematangan inti, serangkaian perubahan dalam organel, protein, dan
transkrip terjadi dalam ovum yang membentuk pematangan sitoplasma ovum (Hyttel et al.,
1997). Meiosis berhenti pada tahap MII hingga terjadi pembuahan, ketika meiosis dilanjutkan
dan menyelesaikan segregasi badan polar kedua (Sirard, 2001).

Dalam kondisi in vitro, ovum biasanya akan menyelesaikan pematangan inti hingga mencapai
MII dalam waktu 20 hingga 24 jam, kemudian siap untuk dibuahi (Leibfried-Rutledge et al.,
1987). Bersamaan dengan pematangan inti, ovum juga menyelesaikan pematangan sitoplasma
yang meniru pematangan sitoplasma yang terjadi dalam kondisi in vivo, meskipun terdapat
perbedaan dalam migrasi yang tepat dari granula kortikal yang memiliki arti penting dalam
mencegah fertilisasi polispermi dalam kondisi in vitro (Hyttel et al., 1986). Sumber yang
heterogen dari ovum yang belum matang yang diambil dari folikel ovarium pada fase
pertumbuhan folikel yang berbeda dapat menyebabkan kemampuan perkembangan yang
terganggu akibat kelengkapan yang tidak tepat dari pematangan sitoplasma ovum (Mermillod et
al., 1999). Sekitar 85% hingga 90% dari ovum belum matang yang dikultur akan mencapai tahap
MII pada akhir IVM dalam kondisi yang tepat. Meskipun tingkat keberhasilan ini bisa dianggap
memuaskan, pematangan sitoplasma ovum dan akuisisi penuh dari kompetensi perkembangan
tidak selalu secara otomatis menyertai pematangan inti dan dapat menyebabkan kekurangan
dalam fertilisasi dan/atau perkembangan (Watson, 2007). Dalam hal ini, ovum yang matang
secara in vivo menghasilkan lebih banyak blastosis dibandingkan dengan ovum yang matang
secara IVM (Sirard dan Blondin, 1996). Kualitas/kompetensi ovum merupakan faktor utama
dalam menentukan tingkat perkembangan blastosis (Krisher, 2004). Meningkatkan penilaian
langsung terhadap pematangan inti dan sitoplasma dengan metode non-invasif dapat
memungkinkan seleksi ovum yang kompeten di masa depan (Fulka et al., 1998).
Garis besar penelitian utama dalam bidang ini adalah konsep prematuration in vitro, menjaga
ovum pada tahap vesikel germinal (GV) dalam kultur untuk memungkinkannya menyelesaikan
diferensiasinya sebelum meiosis dilanjutkan. Memang, meiosis yang dilanjutkan menginduksi
kondensasi kromosom dan pada gilirannya menghentikan transkripsi yang dapat menghambat
sintesis RNA pesan maternal (mRNA) yang akan dibutuhkan untuk perkembangan embrio
sebelum aktivasi genom embrio. Ovum sapi dapat dihentikan dari meiosis dengan inhibitor
spesifik dari Faktor Mendorong Fase M (MPF), yang terlibat dalam GVBD, kondensasi
kromosom, dan pembentukan spindel; namun, menghambat meiosis selama 24 hingga 48 jam
tidak meningkatkan kompetensi ovum (Mermillod et al., 2000). Baru-baru ini, konsep
pematangan ovum fisiologis yang dirangsang (SPOM) muncul sebagai pendekatan yang
menjanjikan untuk meningkatkan IVM (Albuz et al., 2010). Metode ini menggabungkan
penghambatan meiosis selama 12 jam dengan obat yang meningkatkan kadar cAMP ovum dan
stimulasi pematangan dengan FSH, menghasilkan pematangan yang lebih lambat (6 jam lebih
lama) dan peningkatan tingkat perkembangan dan kualitas setelah IVF. Meskipun metodologi ini
masih kontroversial (Guimarães et al., 2015), ini merupakan arah penelitian yang menjanjikan
untuk penelitian lebih lanjut.

Di dalam folikel, ovum dan sel somatik sekitarnya berinteraksi secara terus-menerus melalui
celah gap dan faktor-faktor yang ditransmisikan oleh cairan folikular (FF). Interaksi ini adalah
faktor penentu keberhasilan diferensiasi ovum, yang mengarah pada kompetensi perkembangan.
Banyak senyawa yang ditemukan dalam FF, termasuk faktor pertumbuhan yang diproduksi oleh
sel granulosa atau oleh ovum itu sendiri, telah dijelaskan (Rodgers dan Irving-Rodgers, 2010).
Baru-baru ini, vesikel ekstraseluler (EV), termasuk eksosom, telah dijelaskan dalam FF (Di
Pietro, 2016). EV ini berasal dari sel somatik dan ovum dan mengandung muatan yang beragam,
termasuk protein, mRNA, microRNA, dan lipid (Santonocito et al., 2014). Eksosom ini terlibat
dalam perlindungan serangan oksidatif (Saeed-Zidane et al., 2017), sinyal miRNA, yang
menginduksi modulasi transkripsi pada embrio awal (Gross et al., 2017), dan mengatur ekspansi
kumulus (Hung et al., 2015). Secara keseluruhan, penelitian lebih lanjut tentang eksosom FF
dapat memungkinkan peningkatan hasil IVP (da Silveira et al., 2017) dan membantu menentukan
penanda kualitas ovum.
Pembuahan
Setelah menyelesaikan IVM, ovum dicoinkubasi dengan spermatozoa selama 18 hingga 24 jam
dalam IVF. Interaksi spermatozoa-ovum dalam cawan pembuahan terjadi dalam mikro
lingkungan dengan volume 50 hingga 100 μl untuk jumlah rendah ovum donor OPU, dan
biasanya mikro lingkungan dengan volume >400 μl untuk ovum yang dikumpulkan secara
massal dari rumah pemotongan (Gordon, 2003). Biasanya, spermatozoa dicuci dan dipilih
menggunakan prosedur swim-up atau pemisahan gradien kepadatan untuk menghilangkan media
pembekuan, plasma semen, debris, dan spermatozoa mati, serta memilih fraksi yang lebih motil.
Spermatozoa juga harus diperlakukan dengan faktor kapasitasi agar memperoleh kemampuan
untuk menembus zona pellucida (ZP) ovum (Parrish et al., 1986). Jumlah minimum spermatozoa
yang dibutuhkan per ovum tidak terdefinisi dengan baik karena variasi yang besar antara banteng
dan ras, meskipun umumnya konsentrasi 1 hingga 2 juta spermatozoa ml−1 biasa digunakan
untuk IVF (Ward et al., 2002).

Oleh karena itu, jumlah besar ovum dapat dibuahi menggunakan semen beku konvensional
dibandingkan dengan semen yang dipilih berjenis kelamin dengan jumlah tradisional 2,1 juta
spermatozoa per pipet. Efisiensi pembuahan dapat dioptimalkan, bahkan pada konsentrasi
sperma yang lebih rendah dari <0,5 × 106/ml, dengan memilih banteng yang memiliki fertilitas
tinggi atau menggunakan beberapa banteng (diambil bersama; Lu dan Polge, 1992) dan/atau
menyesuaikan konsentrasi faktor kapasitasi, ukuran tetesan, dan kepadatan ovum (Van Soom et
al., 1991). Dalam beberapa kasus, seperti program IVP komersial, pemilihan banteng oleh staf
laboratorium tidak mungkin dilakukan atau setidaknya dibatasi oleh pilihan pelanggan. Terlepas
dari kenyataan ini, faktor utama yang perlu dipertimbangkan adalah rasio sperma yang dapat
bergerak terhadap ovum, yang bisa sekecil 600 : 1 (An et al., 2017) hingga 5000 : 1 (Tanghe et
al., 2000). Dalam kasus sperma berjenis kelamin, rasio sperma terhadap ovum harus sedikit lebih
tinggi, mulai dari setidaknya 600 hingga 1200 : 1 (Xu et al., 2006) hingga 1500 hingga 2250 : 1
(Lu dan Seidel, 2004). Sayangnya, informasi penting yang disebutkan di atas tidak dijelaskan
dengan jelas dalam artikel jurnal ilmiah.

Tingkat pembuahan, yang diukur sebagai tingkat pembelah pada 48 jam setelah inseminasi (dan
diasumsikan tidak terjadi partenogenesis), biasanya berkisar antara 70% hingga 85%.
Keuntungan utama IVF adalah bahwa hanya memerlukan jumlah kecil spermatozoa untuk
membuahi ovum yang dikumpulkan, yang setidaknya pada pandangan awal mendukung
penggunaan SS yang umumnya memiliki dosis sekitar 2,1 juta spermatozoa dibandingkan
dengan Sexed Ultra yang memiliki 4 juta spermatozoa per tabung. Awalnya, SS yang tersedia
secara komersial dari pusat AI digunakan. Baru-baru ini, dikembangkan prosedur yang disebut
reverse sorting of sperm (seperti yang dijelaskan sebelumnya) untuk menyortir semen beku
konvensional sebelum digunakan dalam IVF (de Graaf et al., 2007). Keberhasilan reverse sorting
ini ditunjukkan dalam program IVP donor dalam skala besar (Morotti et al., 2014). Kemajuan
teknologi ini memungkinkan produsen bibit untuk menghasilkan embrio berjenis kelamin
spesifik melalui IVP dari betina unggulan mereka dengan banteng dengan nilai genetik terbaik.
Tabel 1.
Tabel 1 merangkum perbedaan dan kesamaan antara reverse sorted dan SS konvensional. Saat
ini, reverse sorting hanya digunakan dalam IVP karena jumlah sperma berjenis kelamin yang
sedikit yang dapat dipulihkan (de Graaf et al., 2007).
Saat ini, jumlah literatur ilmiah yang terbatas telah diterbitkan mengenai penggunaan SS dalam
IVP. Data tersebut terutama menggambarkan performa dalam kondisi IVF biasa dan perbedaan
antara banteng (An et al., 2017). SS umumnya digunakan dalam kondisi dan protokol yang
serupa dengan semen konvensional, dan hal ini kemungkinan berkontribusi pada tingkat
pembelah dan perkembangan embrio yang rendah (Zhang et al., 2003). Oleh karena itu, penetrasi
zona pellucida ovum tampaknya menjadi hambatan utama saat menggunakan SS (Lu et al., 1999;
Lu dan Seidel, 2004). Penyebab potensial dari fungsionalitas terganggu ini mungkin adalah
kelangsungan hidup dan motilitas yang rendah setelah pembekuan, capacitation dan hiperaktivasi
yang terganggu, serta masalah dengan integritas akrosom dan interaksi pewarna fluoresen-DNA
(Garner, 2001).

Hanya sedikit laporan yang cukup ketat dalam membandingkan SS dengan semen konvensional,
dengan mempertimbangkan faktor seperti identitas banteng, ejakulat, konsentrasi sperma, dan
heparin (Liu et al., 2015), sedangkan artikel lain tidak memungkinkan perbandingan yang tepat
karena semen tidak berasal dari ejakulat yang sama (misalnya, membagi ejakulat dan
menggunakan sebagian untuk semen konvensional dan sebagian lainnya untuk SS) atau
informasi ini tidak jelas (An et al., 2017). Beberapa artikel yang secara khusus melakukan
perbandingan sperma dengan jenis kelamin yang sama dari banteng yang sama dilakukan oleh
Bermejo-Alvarez et al. (2010a, 2010b). Bermejo-Alvarez et al. (2010b) menemukan bahwa
variasi ekspresi gen dapat memainkan peran penting dalam perkembangan embrio awal yang
spesifik terhadap jenis kelamin, khususnya perbedaan transkripsi yang terjadi selama pra-
implantasi dan oleh karena itu tidak dapat dikaitkan dengan tindakan hormon spesifik jenis
kelamin. Bermejo-Alvarez et al. (2010a) mengungkapkan perbedaan kelimpahan mRNA antara
banteng, tetapi tidak antara sperma yang diurutkan berdasarkan jenis kelamin X dan Y, meskipun
perbedaan terkait jenis kelamin diamati antara blastosit jantan dan betina untuk tiga gen
(GSTM3, DNMT3A, dan PGRMC1).
Penggunaan SS dalam IVP telah menunjukkan hasil yang bervariasi (Lu et al., 1999; Zhang et
al., 2003; Blondin et al., 2009; Xu et al., 2009). Variabilitas tinggi ini dapat dijelaskan
berdasarkan protokol laboratorium yang berbeda dan kurangnya kondisi IVF yang terstandarisasi
untuk SS. Selama proses pemisahan menggunakan flow cytometry, sperma dikenai perlakuan
yang berbeda seperti pewarnaan DNA, efek pengenceran, gaya sentrifugasi, tekanan tinggi,
muatan listrik, emisi laser, dan pembekuan (Garner et al., 2013).
Penyebab penurunan kapasitas fungsional sperma yang telah dipisahkan menurut jenis kelamin
kemungkinan besar bersifat multifaktorial dan kumulatif. Akibatnya, kelangsungan hidup pasca-
pembekuan, integritas sperma, status akrosom, fungsi membran, pola pergerakan, kualitas DNA,
dan/atau akumulasi gangguan ("efek penambahan") dapat terpengaruh atau terganggu. Salah satu
karakteristik khas dari pemisahan sperma berdasarkan kromosom X dan Y menggunakan flow
cytometry adalah penurunan yang signifikan dalam motilitas pasca-pembekuan dan umur rata-
rata (Suh et al., 2005). Untuk mengompensasi atau mengurangi ketidakefisienan ini, berbagai
penyesuaian telah diuji coba (waktu koinkubasi gamet, dosis sperma, dan konsentrasi heparin;
Lu and Seidel, 2004; An et al., 2017). Namun, perbandingan antara sperma yang dipisahkan
menurut jenis kelamin dengan semen konvensional yang tidak dipisahkan mungkin tidak tepat
jika identitas ayah (dengan kesuburan terbukti) dan batch ejakulasi tidak dijelaskan dengan jelas
(Liu et al., 2015).

Sebelum fertilisasi, sperma perlu melewati saluran genital betina untuk mencapai oviduk. Studi
mikroendoskopi pada domba menunjukkan bahwa perjalanan ini sangat cepat (Druart et al.,
2009). Selama perjalanan menuju fertilisasi, sekresi oviduk mempersiapkan sperma, melindungi
kedua gamet dari ROS, memfasilitasi proses fertilisasi, dan menciptakan lingkungan mikro yang
sesuai untuk embrio tumbuh (Li and Winuthayanon, 2017). Sekresi oviduk telah diakui memiliki
kemampuan untuk mengatur fungsi sperma dan meningkatkan motilitas sperma, kapasitasi,
reaksi akrosom, dan interaksi pengikatan sperma-zona (Killian, 2011). Selain itu, sekresi oviduk
juga dapat berkontribusi dalam meningkatkan fertilisasi monospermi melalui modulasi ZP, yang
mempengaruhi interaksi sperma-oosit dan pada akhirnya, membantu mengendalikan polyspermi
(Mondéjar et al., 2013).

Setelah sperma mencapai pertemuan tuba-uterin, sperma akan terperangkap dan dilepaskan
secara bertahap untuk mencapai oosit di situs fertilisasi. Penggunaan model in vitro dari sel
epitel oviduk sapi (BOECs) yang dikultur sebagai monolayer menunjukkan bahwa sperma secara
spontan berikatan dengan sel-sel tersebut dan dilepaskan oleh progesteron, dan sperma yang
telah terikat dengan BOECs dan dilepaskan oleh aksi progesteron menunjukkan potensi
fertilisasi yang lebih tinggi daripada kontrol (Lamy et al., 2017). Analisis proteomik
perbandingan antara sperma terikat dan kontrol menunjukkan bahwa total 27 protein ditangkap
oleh sperma (Lamy et al., 2018). Salah satu penelitian, khususnya, menggunakan protein
pengikat heparin rekombinan, yaitu antigen yang terkait dengan kesuburan dan inhibitor jaringan
metalloproteinase tipe-2, untuk mencoba meningkatkan kesuburan sperma (Alvarez-Gallardo et
al., 2013). Penemuan menarik ini dapat membuka garis penelitian baru untuk meningkatkan
potensi fertilisasi spermatozoa, terutama untuk sperma yang berkualitas rendah seperti pada
banteng dengan kesuburan rendah namun memiliki minat genetik yang tinggi atau sperma yang
terpengaruh oleh pemisahan jenis kelamin.
Pengembangan embrio
Dalam teknik IVF, oosit yang telah dibuahi disubjekkan kepada budidaya in vitro (IVD) selama 7
hari hingga mencapai tahap blastosista. Secara umum, sekitar 20% hingga 40% zigosom
presumtif yang dibudidayakan akan mencapai tahap blastosista (Rizos et al., 2008). Setelah
mencapai tahap blastosista, transfer embrio dilakukan dengan prosedur yang serupa seperti
transfer embrio in vivo, atau embrio disimpan beku. Namun, hanya embrio IVP berkualitas
tinggi yang direkomendasikan untuk disimpan beku guna mencapai hasil kelangsungan hidup
pasca-pembekuan yang lebih tinggi secara keseluruhan, yang dapat membantu meningkatkan
tingkat kehamilan dalam protokol transfer embrio langsung. Metode pembekuan paling populer
untuk embrio IVP masih menggunakan vitrifikasi (Vajta, 2000), meskipun pembekuan perlahan
juga mulai mendapatkan popularitas kembali (Bruyere et al., 2012). Tren baru menunjukkan
bahwa pemilihan embrio 'terbaik' atau embrio yang paling dapat bertoleransi terhadap proses
pembekuan untuk transfer langsung dapat mencapai tingkat kehamilan tertinggi. Tingkat
konsumsi oksigen embrio secara individual, analisis konsumsi metabolit substrat kunci (piruvat,
glukosa, asam amino, dan lain-lain) dan produksi metabolit melalui metabolisme seluler
(misalnya, laktat) dapat menjadi standar emas (Donnay et al., 1999).
Perlu dicatat, teknik baru yang disebut high-resolution chromosome conformation capture (Hi-C)
sedang mengungkapkan beberapa wawasan tentang bagaimana struktur kromatin berubah dari
oosit ke embrio yang sedang membelah, dan apakah pronuklei terpisah, yang mewakili genom
paternal dan maternal, menunjukkan pola epigenetik normal pada tahap perkembangan yang
sesuai (Akst, 2017). Prosedur ini dapat membantu memahami di mana kegagalan dalam
perkembangan embrio terjadi, yaitu apakah berasal dari sisi ayah atau ibu, dan langkah-langkah
untuk memperbaikinya dapat dilakukan.

Pada awalnya, kultur embrio sapi tidak dilakukan in vitro tetapi di dalam oviduk beberapa
spesies (mencakup tikus, kelinci, domba, dan sapi, antara lain; Lazzari et al., 2010). Untuk
meniru kondisi oviduk, IVC pertama kali mencakup monolayer BOECs sebagai kultur bersama,
yang terbukti efektif dalam menghasilkan blastosista berkualitas tinggi yang dapat dibekukan
(Abe dan Hoshi, 1997). Pengenalan kultur bersama sebagai dukungan embrio bertujuan untuk (1)
mengatasi penahanan/berhentinya perkembangan embrio awal pada tahap 8 hingga 16 sel, (2)
meningkatkan tingkat pembentukan blastosista, dan (3) meningkatkan kualitas embrio dan
keberhasilan kriopreservasi (Orsi dan Reischl, 2007). Penggunaan media kondisional dari
BOECs dapat meniru efek kultur bersama, meningkatkan tingkat dan kualitas perkembangan
embrio (Eyestone dan First, 1989), dan bahkan media kondisional bebas serum dapat digunakan
dalam hal ini (Mermillod et al., 1993). Secara in vivo, cairan oviduk mengandung banyak
protein, termasuk faktor pertumbuhan, protein kejut panas, penangkap radikal bebas, dan enzim,
dan komposisi proteinnya berubah selama siklus estrus (Lamy et al., 2018). Selama kultur,
BOECs mengalami dediferensiasi dan mengubah profil ekspresi gen mereka (Schmaltz-Panneau
et al., 2015), misalnya, kehilangan ekspresi reseptor P4 dan glikoprotein khusus oviduk (OVGP)
yang kemungkinan menyebabkan perubahan dalam profil sekresi protein mereka dan membuat
mereka tidak dapat merespons secara tepat terhadap stimulasi hormonal. Cairan oviduk, serta
media kondisional BOEC, telah terbukti mengandung vesikel ekstraseluler (EVs), termasuk
sebagian besar eksosom (Alminana et al., 2017).

Mengingat tingkat kematangan dan pembelahan yang tinggi yang dicapai, tingkat perkembangan
embrio yang relatif rendah hingga mencapai tahap blastosista merupakan masalah (Merton et al.,
2003). Antara 20% dan 40% zigosom presumtif yang dibudidayakan akan mencapai tahap
blastosista (Lonergan et al., 2001) (Gambar 4). Fenomena ini mungkin disebabkan oleh
kematangan sitoplasma oosit yang tidak lengkap, kondisi budidaya yang tidak memadai yang
mengakibatkan aktivasi genom embrio terganggu, atau fragmen DNA (Sirard et al., 2006).
Meskipun kondisi pematangan dapat mempengaruhi kompetensi perkembangan oosit, Tesfaye et
al. (2009) menunjukkan bahwa perbedaan kapasitas perkembangan oosit setelah IVM
dibandingkan dengan pematangan in vivo disertai dengan perbedaan yang jelas dalam
kelimpahan transkrip pada sel-sel kumulus sekitarnya, dengan 64 gen yang diekspresikan secara
berbeda antara kedua kelompok tersebut. Secara khusus, gen-gen yang terkait dengan perluasan
kumulus dan regulasi pematangan oosit diekspresikan secara lebih tinggi pada sel-sel kumulus
yang berasal dari in vivo, sementara sel-sel kumulus yang terkait dengan oosit IVM mengandung
gen-gen yang terkait dengan respons terhadap stress Tesfaye et al. (2009) menunjukkan bahwa
perbedaan dalam kapasitas perkembangan oosit setelah IVM (pematangan in vitro) dibandingkan
dengan pematangan in vivo disertai dengan perbedaan yang jelas dalam kelimpahan transkrip
pada sel-sel kumulus sekitarnya, dengan 64 gen yang diekspresikan secara berbeda antara kedua
kelompok tersebut. Secara lebih khusus, gen-gen yang terkait dengan perluasan kumulus dan
regulasi pematangan oosit diekspresikan secara lebih tinggi pada sel-sel kumulus yang berasal
dari in vivo, sementara sel-sel kumulus yang terkait dengan oosit IVM mengandung gen-gen
yang terkait dengan respons terhadap stres (Tesfaye et al., 2009). Wawasan baru diperlukan
untuk menentukan kompetensi sebenarnya dari oosit dan faktor-faktor selanjutnya yang
mempengaruhi kompetensi perkembangan, seperti kemampuannya untuk menyatu dengan
sperma, pembentukan pronuklei, inisiasi pembelahan sel, kompaksi dan alokasi sel dalam
embrio, serta blastulasi. EV ini mampu menembus ZP dan diinternalisasi oleh sel-sel embrio.
Selain itu, suplementasi media cairan oviduk sintetik (SOF) yang digunakan untuk IVD
meningkatkan tingkat dan kualitas perkembangan embrio. Identifikasi faktor aktif dalam
eksosom dan penggunaan mereka dalam IVD atau penggunaan eksosom itu sendiri untuk
membantu perkembangan embrio dapat menjadi garis penelitian yang menarik untuk
meningkatkan kualitas embrio IVP.
Kondisi budaya dapat mempengaruhi kualitas embrio dan ketahanan terhadap pembekuan (Rizos
et al., 2002). Berbagai strategi telah digunakan untuk mengkompensasi mikro lingkungan
perkembangan embrio IVP yang saat ini suboptimal. Salah satu strategi paling populer
melibatkan penambahan suplemen seperti serum fetus bovin (FBS), pengganti serum, atau serum
albumin bovin (BSA). FBS, di atas konsentrasi tertentu (>5% v/v), dapat meningkatkan produksi
embrio, tetapi dikaitkan dengan penurunan ketahanan terhadap pembekuan (Rizos et al., 2003)
dan induksi LOS (Lazzari et al., 2002). Ketika zigot bovin dikulturkan di dalam oviduk domba
(Lazzari et al., 2010), kelinci (Ectors et al., 1993), mencit (Rizos et al., 2010), atau bahkan
oviduk homolog bovin (Gad et al., 2012), kualitas blastosista, ketahanan terhadap pembekuan,
aktivasi genom embrio, dan ekspresi gen mirip dengan yang berasal dari in vivo. Selain itu,
penggunaan BOECs menunjukkan efek positif pada perkembangan dan kualitas embrio
(Schmaltz-Panneau et al., 2015). Komposisi cairan oviduk (OF) sangat kompleks (Li dan
Winuthayanon, 2017) dan penambahan OF pada fase budidaya meningkatkan tingkat
perkembangan embrio dan kualitas blastosista yang dinilai melalui ketahanan terhadap
pembekuan, alokasi diferensial dari massa sel dalam dan sel trophektoderm, serta ekspresi gen
(Lopera-Vasquez et al., 2017).
Penggunaan FBS telah terbukti menyebabkan kelainan serius pada fetus/sapi muda yang secara
kolektif disebut LOS (Farin et al., 2001). Penggunaan FBS sebagai tambahan budidaya masih
kontroversial. Penambahan serum pada tingkat yang lebih dari 10% (v/v) dapat menyebabkan
LOS; namun, FBS tampaknya merangsang perkembangan embrio dari hari ke-4 hingga hari ke-5
budidaya (Thompson et al., 1998; Holm et al., 1999) bahkan pada konsentrasi yang lebih rendah
(<3% v/v). Saat ini, formulasi media bebas serum berdasarkan penggunaan pengganti serum atau
BSA dapat menghasilkan tingkat dan kualitas blastosista yang serupa atau bahkan lebih tinggi
dibandingkan dengan media yang menggunakan FBS (Stroebech et al., 2015).

Pentingnya media untuk produksi embrio in vitro

Dengan semakin banyaknya implementasi komersial produksi embrio bovin IVP di seluruh
dunia, fokus pada peningkatan hasil dan kualitas blastosista semakin meningkat. Selain itu, fokus
yang ditekankan pada pembatasan regulasi mengenai impor/ekspor embrio yang dikultur dalam
media mengandung serum berbasis hewan, karena risiko penyebaran patogen, telah
meningkatkan keinginan untuk menghilangkan serum dari media IVP.
Meskipun penggunaan komersial embrio IVP telah berkembang di seluruh dunia, masih ada
kebutuhan untuk meningkatkan hasil dan kualitas guna meningkatkan tingkat kehamilan dan
mencapai pembekuan dalam-direktur. Selain itu, terbatasnya pilihan media khusus formulasi
bebas serum untuk bovin yang tersedia secara komersial saat ini sesuai dengan standar
internasional dan regulasi yang ditetapkan oleh IETS (Stroebech et al., 2015). Perusahaan
Denmark, EmbryoTrans Biotech ApS (Haslev, Denmark), telah mengembangkan portofolio
lengkap media IVP dengan pengganti serum sintetis di mana semua langkah dari IVM melalui
IVF dan IVD hingga tahap blastosista dilakukan dalam media tanpa serum.
Sebagian besar laboratorium IVP bovin komersial dan penelitian masih menyiapkan media
budidaya mereka sendiri secara internal menggunakan larutan kultur sel mamalia yang tersedia
secara komersial, seperti Tissue Culture Medium 199 (TCM 199; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
Amerika Serikat), atau Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate (TALP; Parrish et al., 1986) dan SOF
(Holm et al., 1999) dengan penambahan zat tambahan. Secara umum, media budidaya bovin IVP
membutuhkan larutan garam seimbang (garam Earle untuk M199), natrium bikarbonat, asam
amino esensial dan non-esensial, L-glutamin, fosfatase, piruvat, antibiotik, vitamin, EDTA, gula
(fruktosa atau glukosa), serta faktor protektor lainnya (misalnya antioksidan) dan promotor
kinerja gamet/embrio atau nutrisi (Gardner, 2008).
Sebagai media untuk IVD embrio, SOF telah digunakan sebagai sistem media budidaya yang
paling umum. Namun, minat yang meningkat untuk melakukan budidaya sekuensial telah
berkembang di beberapa laboratorium bovin komersial. Konsep media sekuensial dirancang
khusus untuk memenuhi kebutuhan yang berubah pada embrio selama periode perkembangan ini
(Thompson dan Peterson, 2000) (Gambar 5). Sistem budidaya media sekuensial didasarkan pada
konsep bahwa embrio memiliki kebutuhan yang berbeda selama pertumbuhannya dan
kemampuan untuk mengolah glukosa diperoleh secara bertahap (Bavister, 1995). Di sisi lain,
sistem media monoculture mencakup satu formulasi dengan tujuan memastikan perkembangan
embrio hingga tahap blastosista. Dasar ilmiah di balik pendekatan ini adalah memungkinkan
embrio memilih (seperti memilih dari menu) nutrisi yang diperlukan untuk mendukung
perkembangan penuh (Gardner dan Lane, 2002). Kedua strategi, sistem media sekuensial dan
monoculture, bisa sama efisiennya (Macklon et al., 2002), di mana gangguan pH dan suhu yang
lebih sedikit dapat terjadi selama budidaya sistem monoculture (Swain, 2010). Keuntungan dari
meminimalkan manipulasi di luar inkubator dapat berkontribusi pada peningkatan pembentukan
blastosista dan bertindak sebagai faktor kompensasi. Produksi faktor-faktor yang bermanfaat
secara autokrin/parakrin oleh embrio yang berdekatan dan menjaga kondisi budidaya yang
konstan dapat berkontribusi pada peningkatan konsentrasi faktor-faktor promosi embrio
autokrin/parakrin tersebut dan meningkatkan kelangsungan hidup mereka (Gopichandran dan
Leese, 2006).
Beberapa media budidaya embrio bovin sekuensial telah disajikan dalam publikasi:
Early-SOF/Late-SOF (Thompson, 2000), SOFC1/SOFC2 (Gandhi et al., 2000), G1/G2 (Lane et
al., 2003), dan CDM-1/CDM-2 (Olson dan Seidel, 2000). Media sekuensial dua langkah dapat
melibatkan penambahan dan/atau pengurangan komponen-komponen tertentu dari formulasi
medium dasar (Thompson et al., 1998; Lane et al., 2003). Variasi lain dalam protokol media
sekuensial dua langkah ini adalah penggunaan dua media budidaya yang sepenuhnya berbeda,
yaitu masing-masing dengan komponen kimia unik, untuk setiap fase pertumbuhan
perkembangan (KSOM/SOF) (Nedambale et al., 2004).
Media budidaya embrio bovin formulasi tunggal (satu langkah) seperti CR1 (Rosenkrans dan
First, 1994), SOF (Tervit et al., 1972), BECM (Lim et al., 1999), KSOM (Liu dan Foote, 1995),
dan IVD101 (Abe dan Hoshi, 2003) biasanya hadir dalam dua versi: tanpa pembaruan (terus-
menerus; Holm et al., 1999) atau dengan pembaruan (terputus) setiap 48 jam untuk mencegah
akumulasi zat beracun (Moore et al., 2007). Gambar 5 menggambarkan aspek temporal yang
sering terkait dengan protokol media budidaya embrio satu langkah versus dua langkah. Media
budidaya embrio bovin "siap pakai" komersial dan "bebas serum" baru telah dirilis (Stroebech et
al., 2015) dan dapat berkontribusi pada sistem produksi yang lebih stabil, karena mengurangi
variasi dari satu batch ke batch medium yang dibuat di laboratorium. Kelebihan dan kekurangan
dari media monoculture tunggal dan formulasi media sekuensial disajikan dalam Tabel 2.
Inkubator benchtop modern saat ini telah beralih dari kapasitas volume besar (>150 l) menjadi
ruang kecil (<500 ml). Inkubator baru ini menawarkan kompartemen independen yang
dilengkapi dengan sensor suhu, CO2, dan O2 yang memungkinkan pengendalian total dari setiap
lingkungan secara terpisah dan memberikan waktu pemulihan yang lebih cepat (Kelly dan Cho,
2014). Selain itu, wawasan perkembangan embrio tentang tingkat perkembangan dan identifikasi
kelainan morfologis yang terjadi pada tahap-tahap perkembangan tertentu telah diperoleh
menggunakan sistem pemantauan budidaya embrio real-time dengan kamera terpasang di dalam
inkubator ruang kecil (Kovacs, 2014). Sistem seperti ini menggabungkan penampilan embrio
(morfologi) dan waktu pembagian awal embrio (kinetika) menjadi perangkat lunak komputer
terintegrasi untuk mengidentifikasi embrio yang dapat hidup dengan potensi implantasi yang
tinggi (Munevver et al., 2017). Platform budidaya embrio generasi berikutnya kemungkinan akan
didasarkan pada teknologi mikrofluidik, yang mengubah budidaya dari statis menjadi dinamis,
penambahan otomatis bahan kimia tertentu pada waktu yang telah dipilih sebelumnya, dan
memungkinkan perubahan bertahap/sebagian dalam formulasi medium serta menghindari
goncangan suhu dan pH (Wheeler dan Rubessa, 2017).
Dengan meningkatnya penggunaan skrining kromosom komprehensif dalam bidang IVF
manusia, pengembangan sistem biopsi blastosis yang efisien dan praktis diinginkan. Tentu saja,
lingkungan budidaya dan manipulasi embrio selama periode budidaya dapat mempengaruhi
kemampuan perkembangan dan kesuburan embrio. Karena perubahan kebutuhan embrio selama
pertumbuhan, penggunaan formulasi media khusus yang mirip dengan sekresi oviduk dapat
berkontribusi pada peningkatan kinerja hasil embrio. Dalam kondisi in vivo, embrio yang sedang
berkembang bermigrasi dari oviduk ke rongga rahim di mana komposisi cairan dan atmosfer gas
kemungkinan berbeda. Oleh karena itu, sistem budidaya statis mungkin tidak secara memadai
menciptakan lingkungan perkembangan embrio yang diperlukan. Sistem dinamis, di sisi lain,
memungkinkan perubahan bertahap, tepat, dan waktu-spesifik pada media budidaya,
mengembalikan nutrisi yang dikonsumsi, menyediakan nutrisi baru, dan menghilangkan limbah
dan hasil metabolisme beracun, menawarkan otomatisasi proses tertentu (denudasi), sambil
memfasilitasi penanganan gamet/embrio dasar dan mengurangi stres lingkungan (Wheeler dan
Rubessa, 2017).
Terdapat platform pengetahuan yang luar biasa tentang kebutuhan yang diperlukan pada
beberapa tahap perkembangan embrio untuk mencapai tingkat perkembangan yang optimal,
meskipun masih banyak yang dapat dipelajari dari sistem budidaya embrio yang memberikan
wawasan penting untuk mengembangkan media yang sepenuhnya terdefinisi dan dioptimalkan
(Baltz, 2013). Perangkat, platform, dan sistem dinamis yang baru dapat menawarkan jalan
menuju optimasi kondisi budidaya embrio, dengan upaya untuk memaksimalkan kompetensi
gamet, viabilitas, ketahanan beku, dan tingkat kehamilan (Zhao dan Fu, 2017). Kualitas embrio
yang dihasilkan secara in vitro masih lebih rendah dibandingkan dengan embrio yang dihasilkan
secara in vivo. Namun, budidaya zigot bovin yang dihasilkan secara in vitro di bawah kondisi in
vivo (oviduk domba atau sapi) mengembalikan kualitas mereka yang serupa dengan embrio yang
dihasilkan secara sepenuhnya in vivo. Sebaliknya, zigot bovin yang dihasilkan secara in vivo dan
dibudidayakan in vitro biasanya menghasilkan blastosis dengan kualitas yang lebih rendah
dibandingkan dengan blastosis yang sepenuhnya dibudidayakan in vivo.
Gamet dan embrio yang dapat bertahan memiliki profil molekuler unik dan teknologi 'omics',
termasuk transkriptomika, proteomika, dan metabolomika, dapat dianggap sebagai biomarker
potensial dan digunakan untuk pemilihan perkembangan embrio dan/atau kelangsungan hidup
embrio (Fontanesi, 2016). Selain itu, penggunaan analisis RNA ekstraseluler dari media
budidaya embrio juga terlihat sebagai teknologi pemilihan embrio yang menjanjikan (Kropp dan
Khatib, 2015). Kombinasi analisis metabolisme substrat energi yang canggih dengan pemantauan
embrio waktu nyata memungkinkan pengamatan dan pemilihan embrio yang berkelanjutan dan
non-invasif. Berbagai faktor prognostik (waktu pembelahan pertama, jumlah blastomer, waktu
kompaksi morula dan alokasi sel dalam, waktu pembentukan blastosel, henti perkembangan,
pembentukan blastosis) juga dapat membantu mengidentifikasi embrio dengan peluang tertinggi
untuk bertahan dalam kriopreservasi, serta untuk meningkatkan tingkat keberhasilan kehamilan.
Meskipun masih banyak yang harus dilakukan dalam hal investigasi dan validasi, beberapa
keuntungan muka dapat meningkatkan kinerja IVF/IVP karena pengurangan drastis paparan
udara pada cawan budidaya rutin untuk mencatat informasi spesifik (pembelahan, pembentukan
blastosis, penetasan) dan penghilangan evaluasi kualitas embrio morfologis yang subyektif
mengingat nilai prediktif kelangsungan hidup yang meragukan.
Teknologi menarik dan baru lainnya telah berhasil diterapkan terkait vitrifikasi dan pemulihan
cepat embrio zebrafish dan larva karang. Metode vitrifikasi baru ini mengatasi masalah
kriopreservasi dengan menggunakan nanorod emas (GNRs) untuk membantu proses pemulihan.
Khosla et al. (2017) memasukkan propilena glikol ke dalam embrio zebrafish bersama dengan
GNR, kemudian melakukan vitrifikasi dalam nitrogen cair. Mereka berhasil menunjukkan
kemampuan untuk cepat memulihkan embrio zebrafish (1,4 × 107°C/menit) dengan
mengarahkan pulsa laser 1064 nm selama 1 ms ke sampel. Baru-baru ini, prosedur serupa
dilakukan yang menghasilkan vitrifikasi dan kelangsungan hidup pasca-pemulihan pertama dari
larva karang (Daly et al., 2018). Sejauh pengetahuan kami, pendekatan vitrifikasi seperti ini
belum diterapkan pada ovosit dan embrio bovin, tetapi teknik ini dapat menjanjikan dalam
beberapa keadaan tertentu, misalnya, vitrifikasi ovosit tidak matang dari spesies domestik dan
liar yang sulit dikriopreservasi atau embrio klon.
Pra-persiapan folikel sebelum pengambilan ovosit melalui sinkronisasi dan stimulasi dapat
berkontribusi dalam mencapai tujuan akhir mencapai perkembangan blastosis 100% di bawah
kondisi in vitro standar (Nivet et al., 2012). Bukti ini juga menunjukkan bahwa meskipun
lingkungan budidaya suboptimal, sistem tidak menghambat kinerja zigot ketika kompetensi
ovosit awal tidak terganggu. Selain itu, pembentukan embrio lebih dipengaruhi oleh asal ovosit,
sementara kelangsungan hidup beku dan ekspresi gen dapat diubah oleh kondisi budidaya
terlepas dari asal ovosit (Lonergan et al., 2003).
Saat ini, embrio bovin yang berasal dari budidaya in vitro kurang kompeten dalam hal implantasi
dan keberhasilan kehamilan, serta lebih sensitif terhadap proses kriopreservasi dibandingkan
dengan embrio yang dibekukan secara in vivo (Nedambale et al., 2004). Setelah era genomik,
embrio dalam berbagai tahap perkembangan dapat dibandingkan dengan embrio in vivo untuk
menetapkan kelainan dalam pola ekspresi. Embrio in vitro khususnya sensitif terhadap kondisi
budidaya pada tahap empat sel dan morula (Gad et al., 2012). Meskipun demikian, kita harus
mengharapkan perbedaan ekspresi gen, metabolisme, kinerja, dan toleransi antara embrio yang
berasal dari budidaya in vitro dan embrio in vivo karena lingkungan in vitro tidak sama persis
dengan lingkungan in vivo. Perbedaan ini yang diamati antara embrio in vitro dan embrio in vivo
dapat dijelaskan sebagai respons adaptif terhadap lingkungan dan kondisi budidaya. Tentu saja,
efek epigenetik pada embrio sebagai konsekuensi dari kondisi budidaya memerlukan
penyesuaian (Wrenzycki, 2016). Pemilihan embrio sebelum transfer tetap menjadi analisis
fenotipe subyektif yang dilakukan oleh embriolog terampil. Oleh karena itu, diperlukan teknik
non-invasif baru untuk memilih embrio yang dapat bertahan guna memprediksi potensi
perkembangan in vitro dan keberhasilan implantasi (Van Soom et al., 2003). Oleh karena itu,
evaluasi daya tahan terhadap kriopreservasi ditambahkan sebagai parameter uji kelangsungan
hidup (Massip dan Leibo, 2002) bersama dengan banyak metode berbasis biomarker lainnya
untuk melengkapi penilaian morfologi tradisional (Rødgaard et al., 2015). Pendekatan baru,
seperti morfokinetika (Sugimura et al., 2017) dan teknik penapisan genomik canggih, dapat
menjadi rutin untuk pemilihan embrio di laboratorium IVP komersial. Di masa depan, teknologi
terkait CRISPRCas-9 dapat membantu dalam melakukan pengeditan genom yang presisi atau
pengeditan epigenom untuk aplikasi biomedis dan bioreaktor (Yum et al., 2018).
Kesimpulan
Masih ada beberapa kelemahan dalam IVP yang belum terselesaikan yang membatasi penerapan
teknologi ini secara lebih luas, termasuk penurunan kualitas ovosit setelah IVM, daya tahan
embrio terhadap kriopreservasi yang lebih rendah, dan penurunan tingkat keberhasilan
kehamilan. Komunikasi antara embrio dan lingkungan ibu mungkin merupakan target penelitian
penting untuk memahami dan menggunakan faktor-faktor ibu yang dapat secara positif mengatur
perkembangan embrio. Teknologi pemisahan sperma yang baru dan ditingkatkan telah
dilaporkan menghasilkan tingkat kesuburan dan konsepsi yang lebih baik dengan menggunakan
kecerdasan buatan dan potensialnya juga dalam IVP. Namun, diperlukan lebih banyak data untuk
mengkonsolidasikan penelitian yang menjanjikan ini. Kombinasi OPU, IVP, SS, dan GS telah
terbukti berhasil di bidang komersial di beberapa negara, sehingga memungkinkan praktisi dan
produsen ternak untuk meningkatkan kinerja reproduksi, efisiensi, dan keuntungan genetik.