Teknologi In Vitro Embryo Pada Ternak

In-vitro Embryo

Definisi kata In vitro berasal dari bahasa Latin, berarti “di dalam kaca”)

adalah istilah yang dipakai dalam biologi untuk menyebutkan kultur suatu sel,

jaringan, atau bagian organ tertentu di dalam laboratorium. Istilah ini dipakai

karena kebanyakan kultur artifisial ini dilakukan di dalam alat-alat laboratorium

yang terbuat dari kaca, seperti cawan petri, labu Erlenmeyer, tabung kultur, botol,

dan sebagainya. Sedangkan Embrio sebuah eukariota diploid multisel dalam tahap

paling awal dari perkembangan. Dalam organisme yang berkembang biak secara

seksual, ketika satu sel sperma membuahi ovum, hasilnya adalah satu sel yang

disebut zigot yang memiliki seluruh DNA dari kedua orang tuanya. Dalam

tumbuhan, hewan, dan beberapa protista, zigot akan mulai membelah oleh mitosis

untuk menghasilkan organisme multiselular. Hasil dari proses ini disebut embrio.

apabila kita lihat dari definisi diatas maka In vitro embryo Production

adalah proses produksi untuk menghasilkan atau pengembangbiakaan sel telur dan

spermatozoa menjadi zigot dan berkembang menjadi embryo pada kultur jaringan

diluar tubuh hewan. Secara ringkas teknologi fertilisasi in vitro merupakan

teknologi untuk produksi embrio pada lingkungan buatan (di luar tubuh). Ball &

Peters (2007) menyatakan dalam produksi embrio in vitro juga menawarkan

kemungkinan penyelidikan ilmiah masalah consepsi dan yang berhubungan

dengan kebuntingan. Teknik embriyo in vitro untuk menetapkan bahwa sapi

birahi berulang juga menunjukkan penyelesaian untuk penyimpangan dari kontrol

dalam produksi dan selanjutnya di vitro pengembangan oosit. Oosit yang

1
dikumpulkan akan berada di berbagai tahap kedewasaan dan sebagainya, untuk

memanfaatkan mereka, mereka harus matang dan dibuahi in vitro dan kemudian

dibiakkan sebelum transfer akhir ke penerima. Keberhasilan kebuntingan dari

sapi fertilisasi in vitro pertama kali dilaporkan oleh Brackett et al. (1982).

Proses Dan Tahapan Pada Produksi Embryo Secara In Vitro

Koleksi Oosit

Pada tahap awal produksi embryo in vitro adalah koleksi oosit dati sapi. Koleksi

oosit dari sapi dapat dilakukan dengan penyembelihan (pada RPH) dan dengan

koleksi oosit pada ternak hidup. Berikut ini penjelasan singkat proses

pengambilan Oosit pada sapi.

Koleksi Oosit Pada Ternak Pasca Penyembelihan

Aspirasi Oosit

Pengambilan oosit dengan cara aspirasi menggunakan berbagai peralalatan (pipet,

syrinx dan jarum, jarum aspirasi di bawah vacuum pressure) adalah cara yang

paling sering dilakukan pada ovarium sapi yang telah dipotong. Kekurangan dari

metode ini adalah bahwa oosit yang dikoleksi dari sekali ambil dengan penusukan

jarum hanyalah 30-60%. Folikel Sapi (2-8 mm) biasanya diaspirasi dengan 18-22

g dan 3-20 syrinx atau dengan 16-19 g jarum ditahan pada vacuum pump pada

tekanan 75-100mmHg. Dari hasil penelitian, aspirasi yang paling mudah dan

paling berhasil menggunakan jarum 17 g dan tekanan 55 mmHg. (Gordon, 2003).

Teknik Mengiris Ovarium (slicing Ovary)

Teknik slicing ini dapat dilakukan pada ovarium setelah dilakukan aspirasi atau

tidak. Beberapa laporan menyebutkan penggunaan slicing setelah aspirasi

meningkatkan hasil yang didapat dari aspirasi dan laporan lain juga menyebutkan

2
bahwa metode ini memberikan hasil yang lebih baik pada kambing dan domba.

Peneliti di Dublin melaporkan bahwa waktu yang digunakan untuk slicing adalah

3 kali lebih lama dari aspirasi. Di Denmark, Vajta et al (1996a) menyebutkan

bahwa jumlah oosit yang diambil dan jumlah blastosis yang dihasilkan dengan

pengambilan oosit secara slicing memberikan hasil 2 kali lipat daripada dengan

aspirasi. Peneliti menunjukkan bahwa slicing adalah metode yang paling baik

untuk memproduksi sejumlah besar embrio. Mengingat waktunya yang lama,

slicing memiliki kemungkinan untuk terkontaminasi sepanjang prosedur

berlangsung. Jumlah oosit yang berhasil diambil selama 10 menit dari ketiga cara

itu adalah 4,3;3,5;6,6 untuk diseksi, slicing, dan aspirasi (Gordon, 2003).

Diseksi Folikel (Pembelahan Folikel)

Gordon (2003) menjelaskan diseksi pada folikel yang utuh (2-8 mm diameternya)

dan rupturnya yang terkontrol digunakan oleh para pekerja Cambridge pada tahun

1980an sebagai elemen penting dalam artificial maturation technique pada domba.

Metode yang sama juga dilakukan pekerja sapi awal di Dublin yang juga memakai

prinsip pengambilan oosit dengan morfologi yang memiliki sel-sel kumulus utuh.

Keuntungan dari diseksi folikel adalah metode ini dapat mengidentifikasi follikel

non-atresic. Pekerja Cambridge mendeskripsikan criteria folikel yang dapat

diidentifikasi, yaitu: kenampakan misalnya keseragaman permukaan yang cerah,

tanda vaskularisasi yang luas, dan memiliki lapisan stratum granulosum di dalam

folikel. Sebaliknya, pada folikel atresia akan terllihat suram, abu-abu, gelap, dan

hanya terlihat sedikit tervaskularisasi. Pada metode ini, Cumulus Oocyte Complex

dikeluarkan dengan merupturkan folikel yang masih utuh pada medium diseksi.

Jika dibandingkan antara cara diseksi dengan aspirasi, cara diseksi oosit memiliki

3
hasil kualitas oosit yang lebih baik karena pada aspirasi terjadi kerusakan pada

kumulus oophorusnya. Di Itali, dilakukan perbandingan antara oosit yang diambil

dari ovarium yang telah dipotong dari organ awal dengan cara aspirasi dan diseksi

dan disimpulkan bahwa tingkat abnormalitas fertilitas lebih tinggi terjadi pada

oosit dengan cara aspirasi (19%) dibanding dengan diseksi (6%) (Dell’Aquilla et

al.,2003).

Awal bekerja pada in vitro produksi embrio melibatkan tujuan pengambilan oosit

dari ovarium dari ternak setelah penyembelihan. Bagaimanapun terdapat risiko

penyakit yang melekat dan ternak disembelih biasanya tidak secara genetic lebih

unggul. Jelas, itu hanya mungkin untuk panen setiap hewan sekali. Menggunakan

Penjemputan Ovum atau ovum pick up (OPU) ovum dapat dipanen berulang kali

dari sapi yang sama, berpotensi memberikan lebih banyak ovum. Delapan tahun

sapi telah menghasilkan 176 embrio selama 158 koleksi mingguan. Aspirasi

mungkin lebih baik daripada mingguan karena lebih cenderung mendahului

pengembangan folikel dominan yang dapat memiliki efek negatif pada hasil (Ball

dan Peters, 2005). Sebuah keuntungan lebih lanjut dari OPU adalah bahwa hal itu

dapat dilakukan selama tiga bulan pertama kehamilan dan juga pada prapubertas,

termasuk janin, hewan. Hasil umumnya lebih buruk dan lebih bervariasi dalam

pra-pubertas, sebagai lawan dewasa, sapi, tapi ada potensi untuk perbaikan

substansial dalam keuntungan genetik dengan nyata mengurangi interval generasi.

Sapi yang umurnya lebih dari 14 tahun mempunyai oosit yang lebih sedikit.

Temuan ini telah ditinjau oleh Boland et al. (2000). Peralatan yang digunakan

terdiri dari peralatan USG yang transduser memiliki panduan jarum built-in.

Setelah anestesi epidural dari donor, transduser dimasukkan ke dalam vagina dan

4
ovarium untuk disedot dipindahkan per rektum ke posisi hanya anterior fornix

vagina. Dengan demikian, folikel dapat dicitrakan dan panduan jarum yang

digunakan untuk melewati jarum echogenic melalui dinding vagina ke ovarium.

Folikel sasaran diposisikan dan disedot oleh berarti dari vakum yang

dikendalikan. Tingkat vakum digunakan merupakan kompromi antara kebutuhan

untuk mengambil oosit dan pada saat yang sama menjaga integritas melapisi sel

kumulus yang (Boland et al., 2000; McEvoyet al., 2002).

Pertanyaan telah diajukan tentang kemungkinan fisiologis yang

merugikan dan / atau konsekuensi kesejahteraan bagi sapi mengalami OPU

diulang. McEvoy et al. (2002) menyimpulkan bahwa fungsi ovarium tidak

terganggu setelah 13-16 tujuan pengambilan, dan bahwa setelah 16-20 koleksi

tidak ada bukti infeksi atau peradangan di tempat suntikan anestesi epidural

berhubungan dengan OPU. Beberapa kerusakan kecil dianggap berhubungan

dengan prosedur yang tidak sempurna, bukan frekuensi injeksi. Chastant-Maillard

et al. (2003) mempelajari stres yang berhubungan dengan parameter fisiologis

(kadar kortisol, sensitivitas adrenal, jumlah sel somatik darah dan susu) fungsi

ovarium dan morfologi pada sapi selama dan setelah OPU berulang. Sapi-sapi

dibandingkan dengan kontrol, yang ditangani dan diberikan suntikan epidural,

tetapi tidak mengalami tusukan vagina. Mereka menemukan tidak ada

konsekuensi yang merugikan kesejahteraan dari Prosedur OPU. Berikut ini

seperangkat alat koleksi oosit.

5
Fertilisasi Secara In Vitro

Proses fertilisasi pada produksi embryo secara in vitro diawali dengan kapasitasi

spermatozoa. pembuahan. Dalam produksi embrio, salah satu langkah pertama

adalah pemilihan sperma untuk digunakan dalam IVF. Praktek yang umum adalah

untuk memilih semen beku dan dicairkan berdasarkan suatu Metode pemisahan

Percoll; di Hungaria, Somfai Et al. (2002) menunjukkan bahwa sperma dengan

sebuah kelangsungan hidup yang lebih tinggi dan integritas akrosom bisa

diperoleh dengan pemisahan Percoll dibandingkan dengan metode ‘berenang-up’.

IVF adalah prosedur yang kompleks yang melibatkan oosit pematangan,

pemisahan sperma dan sperma kapasitasi. Sperma kapasitasi adalah modifikasi

sperma biokimia harus menjalani dalam saluran reproduksi wanita sebelum sel

dapat mengikat zona pelusida dan menjalani reaksi akrosom (AR). Kapasitasi

mungkin in vitro dalam ketiadaan saluran reproduksi cairan dan beberapa

senyawa yang dikenal untuk menginduksi in vitro kapasitasi yang paling umum

ini adalah glikosaminoglikan (GAG) heparin. Hal ini sesuai pendapat dari Ball &

Peters (2007) menyatakan pemupukan dilakukan dengan mengekspos oosit

matang untuk spermatozoa berkapasitas, baik segar atau beku-dicairkan dalam

media fertilisasi. Heparin adalah biasanya ditambahkan ke medium untuk

menginduksi kapasitasi sperma.

Mendes et al. (2003) menemukan bahwa heparin meningkatkan tingkat

kesuburan terlepas dari teknik pemisahan sperma meskipun pengamatan dari

industri IVF sapi yang menunjukkan bahwa heparin mungkin tidak diperlukan

untuk sapi cryopreserved sperma yang telah dipisahkan melalui Percoll gradien.

6
Lechniaket al. (2003) melaporkan bahwa pre-inkubasi sperma selama 24 jam

mengurangi pembentukan blastokista, tetapi secara signifikan mengubah rasio

jenis kelamin dalam mendukung betina.

Metode fertilisasi digambarkan sebagaui berikut :

Pendekatan proses fertilisasi in vitro : source : Gordon (2005)

Teknik Fertilisasi Sperma :

Teknik Injeksi Sperma Intra Sitoplasma (ICSI)

Teknik ini sangat sesuai jika diterapkan pada kasus sperma yang mutu dan

jumlahnya sangat minim. Jika pada teknik IVF konvensional membutuhkan 50

ribu-100 ribu sperma untuk membuahi sel telur, maka pada teknik ICSI hanya

membutuhkan satu sperma dengan kualitas bagus. Dengan bantuan pipet khusus,

sperma kemudian disuntikkan ke dalam sel telur. Untuk berbagai alasan, mungkin

ada kebutuhan untuk mengeksplorasi cara-cara baru untuk mencapai fertilisasi;

beberapa pendekatan yang mungkin adalah diilustrasikan dalam gambar diatas.

Hasil IVF, sering kali dengan hanya 15-30% dari oosit yang dibuahi, ICSI telah

digunakan dalam berurusan dengan oosit kuda. Berbagai pekerja telah

menunjukkan bahwa ICSI adalah mampu meningkatkan tingkat pemupukan

dibandingkan dengan IVF, dan beberapa anak kuda memiliki lahir dari IVM oosit

kuda dibuahi dengan injeksi sperma. Di Italia, penelitian telah menunjukkan

7
bahwa tingkat blastokista sekitar 30% dapat dicapai setelah ICSI IVM oosit kuda.

Menurut Squireset al. (2003), teknik ICSI menyediakan kemungkinan

memperoleh kehamilan dari kuda yang mungkin memiliki nomor sperma rendah

atau kualitas air mani yang buruk. Meskipun ICSI adalah metode pilihan untuk

pemupukan kuda oocytesin vitro, alasan untuk hal ini adalah tidak dipahami

dengan baik dan perkembangan embrio Harga tetap rendah.

Teknik Subzonal Sperma Intersection (SUZI)

Subzonal Sperm Intersection (SUZI). Teknik SUZI dilakukan dengan

menyemprotkan sperma ke sel telur dengan membuat celah pada dinding sel telur

terlebih dulu agar memudahkan kontak antara sperma dengan sel telur. Sedangkan

pada teknik SUZI, sperma disuntikkan secara langsung ke dalam sel telur. Hanya

saja dari sisi keberhasilan, kedua teknik ini dianggap masih belum memuaskan.

Pada teknik ini jumlah sperma yang dimasukan lebih dari satu sel spermatozoa.

Kultur Embryo In Vitro

Situmorang (1997) menyatakan kultur embryo dimulai setelah pembuahan

selama 18-24 jam pada medium fertilisasi TALP, zigot dikeluarkan dan

dimasukkan ke dalam larutan Bench dan vortex dilakukan selama 1 menit .

Pembiakan dilakukan dengan memasukkan masing-masing 4 zigot pada synthetic

oviduct fluid (Sof media) pada inkubator CO Z dengan 5% CO Z di udara, suhu

38 0 C selama 48 jam. Kemudian setiap 48 jam dilakukan penggantian medium

lama dengan medium yang baru. Perkembangan embrio dievaluasi setelah 6 hari

dari waktu fertilisasi (hari ke-7 setelah penampungan sel telur) dengan

menggunakan mikroskop.

8
Setelah dibuahi, embrio harus berbudaya ke tahap blastokista siap transfer embrio

non-bedah. Secara tradisional, yang disebut sistem pembiakan sudah digunakan,

di mana embrio berkembang tumbuh bersamaan dengan granulosa

berkembangbiak dan / atau sel cumulus. Rief et al. (2002) melaporkan

penggunaan sistem baru di mana embrio yang dibiakkan dengan sel epitel saluran

telur. Tampaknya, bagaimanapun, bahwa sistem pembiakan dengan serum yang

mengandung hormone alami dapat menginduksi neonatal dan masalah janin dan

ada upaya untuk menghasilkan media serum sintetis. Masalahnya adalah bahwa

blastokista sapi dikembangkan protein bebas menengah yang ditemukan

metabolik (Thompson & Peterson, 2000), dan berbagai pendekatan telah mencoba

untuk mengatasi hal ini. Lane et al. (2003) laporan penggunaan fisiologis sistem

media berurutan bebas serum yang menghasilkan blastosis sapi dengan harga

setara dengan kultur pembiakan. Selain itu, blastosis tersebut memiliki jumlah sel

setara atau meningkat dan inner cell pengembangan massal dan diproduksi tingkat

kehamilan setara setelah transfer embrio IVF kedua diproduksi segar dan beku

Embryo Hasil In Vitro Produksi : Gordon (2005)

9
ordon (2005) Menyatakan Hasil yang menggembirakan ditemukan menggunakan

media di mana komposisi berubah sesuai dengan tahap perkembangan embrio.

Data Disampaikan oleh Lane et al. (2003), untuk Misalnya, menggunakan

berbasis fisiologis, berurutan, sistem kultur bebas serum (G1.2 / G2.2),

menunjukkan kehamilan setara dan tingkat cryosurvival dengan yang dicapai

dengan sistem pembiakan tradisional BRL. Media G1.2 / G2.2 telah digunakan

untuk pembiakan embrio dari banyak spesies, waktu perubahan menengah dari

G1.2. untuk G2.2 bervariasi sesuai dengan jenis:

65-76 jam pasca-inseminasi pada manusia, 72 jam pasca-inseminasi pada babi dan

96 jam pasca-inseminasi pada sapi. Media ini didasarkan pada sintetis cairan

oviductal, dengan porsi G2.2 mengandung konsentrasi glukosa yang lebih tinggi

dari G1.2. Para penulis tidak menemukan perbedaan dalam perkembangan embrio

antara perubahan media pada 72 atau 96 jam pasca-inseminasi. Media sekuensial

ISM1 / ISM2 (Medicult, Copenhagen) juga telah digunakan berhasil; sebuah studi

yang dilaporkan oleh Heyman et al. (2003b) di Perancis menilai potensial untuk

pengembangan jangka penuh IVP blastokista dikembangkan dalam ini berurutan

Media. Dari sejumlah transfer, tidak ada kerugian janin diamati, tidak ada contoh

LOS dan semua betis lahir selamat 1 bulan pada kelompok ISM dibandingkan

dengan 80% hidup dalam kontrol dikembangkan dalam embryo kultur.

Permasalahan Pada Produksi Embryo Secara In Vitro

Ada masalah yang terkait dengan in vitro produksi embrio. Keberhasilan rendah

Harga membatasi kontribusi bahwa prosedur ini dapat membuat perbaikan

genetic. Masalah spesifik termasuk insiden tinggi polispermia selama fertilisasi in

vitro (misalnya, Mizushima & Fukui, 2001). Ada juga signifikan pasca-hari 35

10
kematian janin. Thompson & Peterson (2000) menemukan bahwa banyak dari ini

kerugian disebabkan kegagalan pembangunan allantoic normal dalam konsepsi.

Masalah kesejahteraan potensial yang khusus berkaitan dengan OPU telah

dirujuk untuk, dan tidak muncul untuk menjadi perhatian besar. Tentu banyak

perhatian yang lebih besar adalah berpengaruh pada keturunan yang benar-benar

dibawa ke sisi sini memang ada masalah kesejahteraan. Paling serius adalah

kelahiran anak sapi yang luar biasa besar yang dihasilkan dari dalam produksi

embrio in vitro. Terkait dengan hal ini memiliki laporan tentang kesulitan

bernapas, keengganan untuk menyusu dan kematian perinatal tiba-tiba. Itu Alasan

untuk ini masih belum jelas, tapi masalahnya tampaknya terkait dengan Janin per

se bukan plasenta. Sejumlah faktor telah terlibat. Banyak dari ini terkait dengan

prosedur kultur in vitro (misalnya, Byrne et al., 2002), dan lain-lain termasuk

transfer embrio asynchronous dan ibu paparan urea tinggi diets. Literature telah

dilakukan untuk kemungkinan seks diubah rasio dalam kondisi tertentu

pembiakan selama produksi embrio in vitro, tapi secara keseluruhan ada sedikit

bukti penyimpangan yang signifikan dari rasio yang diharapkan.

Kesimpulan

erdasarkan Pembahasan diatas dapat disimpulkan bahwa :

1. Embryo dapat diproduksi secara In Vivo dan In Vitro.

2. Pada produksi embryo secara in vitro tahap prosesnya antara lain : tahap

koleksi oosit, tahap maturasi oosit, tahap fertilisasi, dan tahap kultur

embryo.

11
 3. In vitro Embryo merupakan kemajuan teknologi di bidang reproduksi yang

sangat canggih dan mamapu mengatasi problem peternakan di dunia,

walaupun masih terdapat beberapa kelemahan dan problem.

Daftar Referensi

1. Adifa, N. S, P. Astuti, dan D. T. Widayati. 2010. Pengaruh Penambahan

Chorionic Gonadotrophin Pada Medium Maturasi Terhadap Kemampuan

Maturasi, Fertilisasi, Dan Perkembangan Embrio Secara In Vitrokambing

Peranakan Ettawa. Buletin Peternakan ISSN 0126-4400 Vol.34(1): 8-15.

2. Balai Embryo Tranfer Cipelang. 2015. Panen Embryo. Bogor.

www. betcipelang.info. [diakses 9 April 2015].

3. Ball, P. J. H, & A. R. Peters. 2007. Reproduction In Cattle Third Edition.

Blacwell Publishing Ltd. UK.

4. Besenfelder , Havlicek V., Brem G., 2012. In: Embyo Technology,

Constantine the Philosopher University in Nitra, Faculty of Natural

Sciences.

5. Boediono A. 2005. Produksi embrio kembar identik melalui bedah mikro

pada embrio kambing hasil in vitro. Jurnal Veteriner 6(2): 3946.

6. Boland, M.P. (2002) Impact of currrent management practices on embryo

survival in the modern dairy cow.Cattle Practice10, 337–347.

7. Boland, M.P., Lonergan, P. & Sreenan, J.M. (2000) In Fertility in the

High-Producing Dairy Cow (ed. M.G. Diskin). British Society of Animal

Science Occasional Publication,26, 263–275.

12
8. Bosted, 2015. Developed With Clinic for Obstetrick and Andrologi Of

Large and Small Animal. Univ Giessen. www. Karstorz.com .[diakses 9

April 2015].

9. Brackett, B.G., D. Basquet, H.L. Boice, W.J. Donawick, J.F. Evans And

M.A Dressel. 1982. Normal development foUowing in vitro fertilization in

the cow. Biology of Reproduction 27: 147-158.

10. Byrne, A.T., Southgate, J., Brison, D.R. & Leese, H.J. (2002) Molecular

Reproduction and Development,62, 489–495

11. Cech, S., Havlicek, V., Lopatarova, M., Lorincova, L., Zahradnikova, J.

and Dolezel, R. (2003) Repeated ovum pick-up in stimulated pregnant

dairy cows.Reproduction in Domestic Animals 38, 349–350 (Abstract).

12. Chastant-Maillard, S., Quinton, H., Lauffenburger, J., Cordonnier-Lefort,

N., Richard, C., Marchal, J., Mormede, P. & Renard, J.P. (2003)

Reproduction,125, 555–563.

13. Choi, S.H. S.R Choe, C Y Choe, 2010. BIB

Text. http://www.google.com/patents/WO2011145818A2?cl=en#backwar

d citations. [diakses 9 April 2015].

14. Dell’Aquila, M.E., Albrizio, M., Maritato, F., Minoia, P. and Hinrichs, K.

(2003) Meiotic competence of equine oocytes and pronucleus formation

after intracytoplasmic sperm injection (ICSI) as related to granulosa cell

apoptosis. Biology of Reproduction68, 2065–2072.

15. Flohr SF, Wulster-Radcliffe MC, Lewis GS. 1999. Technical note:

Development of a transcervical oocyte recovery procedure for sheep. J

Anim Sci 77:2583-2586.

13
16. Gordon, Ian. 2005. Reproductive Technologies in Farm Animals. CABI

Publishing; Wallingford UK.

17. Gordon,Ian R. 2003. Laboratory Production of Cattle Embryos. CABI

Publishing; Wallingford UK.

18. Heyman, Y., Richard, C., Lavergney, Y., Menezo, Y. and Vignon, X.

(2003b) Outcome of pregnancies after transfer of bovine IVP embryos

cultured in the serum free sequential media, ISM1/ISM2. Proceedings 19th

Meeting European Embryo Transfer Association (Rostock), p. 160.

19. Lane, M., Gardner, D.K., Hasler, M.J. and Hasler, J.F. (2003) Use of

G1.2/G2.2 media for commercial bovine embryo culture: equivalent

development and pregnancy rates compared to co-culture.

Theriogenology60, 407–419.

20. LDA laparoscopic repair – 2013 U.S. workshop.

www. swissvet.com.[diakses 9 April 2015].

21. Lechniak, D., Strabel, T., Bousquet, D. & King, A.W. (2003)

Reproduction in Domestic Animals,38, 224–227.

22. Lechniak, D., Strabel, T., Bousquet, D. & King, A.W. (2003)

Reproduction in Domestic Animals,38, 224–227.

23. McEvoy, T.G., Thompson, H., Dolman, D.F., Watt, R.G., Reis, A. &

Staines, M.E. (2002) Veterinary Record,151, 653–658.

24. Mendes, J.O., Burns, P.D., De La Torre-Sanchez, J.F. & Seidel, G.E.

(2003) Theriogenology,60, 331–340.

25. Mendes, J.O.B. Jr, Burns, P.D., De la Torre-Sanchez, J.F. and Seidel, G.E.

Jr (2003) Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with

14
 four bovine sperm preparation protocols. Theriogenology60, 331–340.

Merks, J.W.M., Cucro-Steverink, D.

26. Merton, J.S., de Roos, A.P.W., Mullaart, E., de Ruigh, L., Kaal, L., Vos,

P.L.A.M. and Dieleman, S.J. (2003) Factors affecting oocyte quality and

quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle

breeding industry. Theriogenology59, 651–674.

27. Mizushima, S. & Fukui, Y. (2001) Theriogenology,55, 1431–1445.

28. Pieterse, M.C., Vos, P.L.A.M., Kruip, T.A.M., Wurth, Y.A., Van

Beneden, T.H, Willemse, A.H. & Taverne, M.A.M. (1991)

Theriogenology,35, 19–24.

29. Putro, P.P. 1993. Petunjuk Laboratorium Fertilisasi In Vitro. Pusat Antar

Universitas Bioteknologi UGM. Yogyakarta. pp.10-19.

30. Rief, S., Sinowatz, F., Stojkovic, M., Einspanier, R., Wolf, E. & Prelle, K.

(2002) Reproduction,124, 543–556.

31. Setiadi, M. A, I.Supriatna dan A. Boediono. 2007. Laparoscopic Ovum

Pick-Up For In Vitro Embryo Production And Embryo Transfer In

Sheep. Jurnal llmu Pertanian Indonesia.

32. Situmorang, P., E. Triwulaningsih, A. Lubis, N. Hidayati, And T. Sugiarti

. 1998 . Effects of the addition of hormone inmaturation medium for in

vitro production of embryo (IVP) . Jurnal Ilmu Ternak dan Yeteriner 3 (1)

: 22-26.

33. Situmorang, P dan E. Triwulaningsih. 2004. Aplikasi dan inovasi

teknologi transfer embrio (TE) untuk pengembangan sapi

potong. Lokakarya Nasional Sapi Potong. pp. 95-105.

15
34. Somfai, T., Bodo, S., Nagy, S., Papp, A.B., Ivancsics, J., Baranyai, B.,

Gocza, E. and Kovacs, A. (2002) Effect of swim-up and Percoll treatment

on viability and acrosome integrity of frozen–thawed bull

spermatozoa.Reproduction in Domestic Animals37, 285–290.

35. Squires, E.L., Carnevale, E.M., McCue, P.M. and Bruemmer, J.E. (2003)

Embryo technologies in the horse.Theriogenology59, 151–170.

36. Thompson, J.G. & Peterson, A.J. (2000) Human Reproduction,15(Suppl.

5), 59–67.

37. Vajta, G., Lewis, I.M., Trounson, A.O., Purup, S., Maddox-Hyttel, P.,

Schmidt, M., Pedersen, I.G., Greve, T. and Callesen, H. (2003) Handmade

somatic cell cloning in cattle: analysis of factors contributing to high

efficiencyin vitro.Biology of Reproduction68, 571–578.

16