SNI 01-2332.

1-2006
Standar Nasional Indonesia
Cara uji mikrobiologi - Bagian 1: Penentuan coliform dan Escherichia coli pada p
roduk perikanan
ICS 67.120.30
Badan Standardisasi Nasional

SNI 01-2332.1-2006
Daftar isi
Daftar isi .....................................................................
...................................................... Prakata .................
................................................................................
........................... 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ruang lingkup ..............
................................................................................
.............. Istilah dan definisi ............................................
........................................................... Prinsip ............
................................................................................
............................ Peralatan .........................................
.......................................................................... Media
dan pereaksi ..................................................................
................................. Kondisi pengujian ............................
.......................................................................... Prepa
rasi contoh ....................................................................
.................................... Prosedur ..................................
................................................................................
.. Interpretasi hasil ..........................................................
.............................................. Pelaporan .......................
................................................................................
.......... Keamanan dan keselamatan kerja (K3) .................................
.................................
i ii 1 1 2 2 2 3 3 3 5 6 6 7 9 10 11 14 16 17
Lampiran A (informatif) Angka paling memungkinkan/APM dengan seri tabung pengenc
eran ...........................................................................
......................................... Lampiran B (normatif) Indeks APM denga
n tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif dari 3 seri tab
ung pengenceran .................................................... Lampiran C
(normatif) Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi ha
sil positif dari 5 seri tabung pengenceran .....................................
.............. Lampiran D (normatif) Pembuatan media ...........................
............................................ Lampiran E (normatif) Pembuatan per
eaksi ................................................................... Lampir
an F (informatif) Skema penentuan coliform dan Escherichia coli ................
........ Bibliografi ...........................................................
...............................................................
Tabel 1 Tabel 2
Berat contoh yang diambil yang akan diuji ......................................
.............. Interpretasi hasil ..............................................
.............................................
3 5 8 9 10
Tabel A.1 Cara pemilihan kombinasi seri tabung pengenceran APM dengan 5 seri tab
ung pengenceran ................................................................
..................... Tabel B.1 Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk
berbagai kombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2
dan 10 3 ............ Tabel C.1 Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk
berbagai kombinasi hasil positif dari 5 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2
dan 10 3 ............
i

Prakata
Dalam rangka memberikan jaminan mutu dan keamanan pangan terhadap komoditas yang
akan dipasarkan di dalam dan luar negeri, maka perlu disusun suatu Standar Nasi
onal Indonesia (SNI) metode uji yang dapat memenuhi jaminan tersebut. SNI 01-233
2.1-2006 ini merupakan revisi dan mengganti SNI 01-2332-1991 Standar Metode peng
ujian mikrobiologi-Produk perikanan penentuan Escherichia coli yang dirumuskan o
leh Panitia Teknis Perikanan melalui rapat-rapat teknis, rapat prakonsensus dan
rapat konsensus nasional pada tanggal 18 Maret 2005 di Jakarta. Dihadiri oleh wa
kil-wakil produsen, konsumen, asosiasi, lembaga penelitian, perguruan tinggi dan
instansi terkait sebagai upaya untuk meningkatkan jaminan mutu dan keamanan pan
gan. Berkaitan dengan penyusunan Standar Nasional Indonesia ini, maka aturan-atu
ran yang dijadikan dasar atau pedoman adalah: 1 2 3 Peraturan Pemerintah No. 69
tahun 1999 tentang Label dan Iklan Pangan. Keputusan Menteri Kelautan dan Perika
nan RI. No. KEP. 01/MEN/2002 tentang Sistem Manajemen Mutu Terpadu Hasil Perikan
an. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI. No. KEP. 06/MEN/2002 tentang Pe
rsyaratan dan Tata Cara Pemeriksaan Mutu Hasil Perikanan yang Masuk ke Wilayah R
epublik Indonesia. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI. No. KEP. 21/MEN/
2004 tentang Sistem Pengawasan dan Pengendalian Mutu Hasil Perikanan untuk Pasar
Uni Eropa.
4
ii

SNI 01-2332.1-2006
Cara uji mikrobiologi - Bagian 1: Penentuan coliform dan Escherichia coli pada p
roduk perikanan
1
Ruang lingkup
Standar ini digunakan untuk menentukan bakteri indikator sanitasi (Coliform dan
Escherichia coli) pada produk perikanan.
2
Istilah dan definisi
2.1 coliform kelompok bakteri yang digunakan sebagai indikator adanya polusi kot
oran dan kondisi sanitasi yang tidak baik 2.2 faecal coliform kelompok bakteri f
akultatif aerob, gram negatif tidak membentuk spora, berbentuk batang pendek, ma
mpu memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas serta tumbuh pada suhu 450C +
0,5oC selama sekurang-kurangnya 24 jam 2.3 E. coli bakteri gram negatif yang ber
bentuk batang pendek atau coccus, tidak membentuk spora 2.4 inkubasi pengkondisi
an mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang biak sesuai dengan suhu dan waktu
yang diperlukan 2.5 kekerangan semua jenis (spesies) dari kekerangan antara lain
, Oyster (Pinctada sp), kepah (Meritrix meritrix), tiram (Crassotrea cuculata),
simping (Common minolowpen), remis dan kijing baik yang hidup ataupun telah terl
epas dari kulitnya, segar atau beku, utuh atau berupa bagian 2.6 media nutrisi d
alam bentuk padat atau cair untuk tempat pertumbuhan mikroorganisme 2.7 metode a
ngka paling memungkinkan /APM metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan meng
gunakan medium cair dalam tabung reaksi, pada umumnya setiap pengenceran 3 seri
atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahapan pendekatan s
ecara statistik 2.8 mikroorganisma kelompok organisma yang berukuran kecil dan h
anya dapat dilihat di bawah mikroskop
1 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
2.9 produk perikanan ikan termasuk biota perairan lainnya yang ditangani dan/ata
u diolah untuk dijadikan produk akhir, umumnya berupa ikan segar, ikan beku dan
olahan lainnya yang digunakan untuk konsumsi manusia 2.10 koloni terduga (suspec
ted colonies) koloni-koloni pada media agar selektif yang memberikan ciri-ciri E
scherichia coli yang khas. Koloni ini harus dikonfirmasi untuk meyakinkan benar
tidaknya Escherichia coli
3
Prinsip
Menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan
jumlah tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
4 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j)
Peralatan waterbath bertutup dengan sirkulasi 45oC 0,5oC; inkubator 35oC 1oC; bl
ender beserta jar yang dapat disterilisasi atau stomacher; botol pengencer; tabu
ng durham; cawan petri ukuran 15 mm x 90 mm; tabung reaksi ukuran 16 mm x 150 mm
dan 13 mm x 100 mm; timbangan dengan ketelitian 0,0001 g; mikroskop; pipet atau
pippetor 1ml, 5 ml dan 10 ml.
5 a) b) c) d) e) f) g) h) i) j) k) l) m)
Media dan pereaksi Brilliant Green Lactose Bile (BGLB), 2 % Broth (D.1); Lauryl
Tryptose Broth (LTB) (D.2); EC Broth (D.3); Levines Eosin Methylen Blue (L-EMB )
agar (D.4); Tryptone (Tryptophane) Broth (TB) ( D.5); MR-VP Broth (D.6); Simmon
Citrate Agar (D. 7); Plate Count Agar (D.8); Larutan Butterfields Phosphate Buffe
red (E.1); Pereaksi Kovacs (E.2); Pereaksi VP (E.3); Indikator MR (E.4); Pereaks
i pewarnaan gram (E.5).
CATATAN Pembuatan media diuraikan dalam Lampiran D dan pembuatan pereaksi diurai
kan dalam Lampiran E
2 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
6
Kondisi pengujian
Pengujian contoh kekerangan menggunakan 5 seri tabung pengencer sedangkan untuk
produk perikanan lainnya menggunakan 3 seri tabung pengencer.
7
Preparasi contoh
Dengan menerapkan teknik aseptis, contoh diambil secara acak dan dipotong kecilkecil hingga berat masing-masing contoh yang akan diuji sesuai ketentuan pada Ta
bel 1. Contoh beku dilelehkan pada saat akan dianalisa dan pelelehan dilakukan s
elama 18 jam pada suhu sekitar 2C 5C atau suhu di bawah 45C dan tidak lebih dari 15
menit. Tabel 1 Berat contoh yang diambil yang akan diuji Berat contoh yang akan
diuji 100 g atau 100 ml 300 g atau 300 ml 500 g atau 500 ml
Berat contoh < 1 kg atau 1 l 1 kg atau 1 l - 4,5 kg atau 4,5 l > 4,5 kg atau 4,5
l
8
Prosedur
8 .1 Persiapan contoh a) Untuk contoh dengan berat lebih kecil atau sama dengan
1 kg atau 1 l sampai dengan 4,5 kg atau 4,5 l timbang contoh padat sebanyak 25 g
atau contoh cair sebanyak 25 ml dari contoh yang akan diuji , kemudian masukkan
dalam wadah atau plastik steril dan tambahkan 225 ml larutan Butterfields Phosph
ate Buffered b) Untuk contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg atau 4,5 l tim
bang contoh padat sebanyak 50 g atau contoh cair sebanyak 50 ml , kemudian masuk
kan dalam wadah atau plastik sterildan tambahkan 450 ml larutan Butterfields Phos
phate Buffered, c) Homogenkan selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan de
ngan pengenceran 101. 8.2 8.2.1 a) Tahap analisa Uji pendugaan coliform (Presump
tive coliform)
Siapkan pengenceran 102 dengan cara melarutkan 1 ml larutan 101 ke dalam 9 ml la
rutan pengencer Butterfields Phosphate Buffered. Lakukan pengenceran selanjutnya
sesuai dengan pendugaan kepadatan populasi contoh. Pada setiap pengenceran dilak
ukan pengocokan minimal 25 kali. Pindahkan dengan menggunakan pipet steril, seba
nyak 1 ml larutan dari setiap pengenceran ke dalam 3 seri atau 5 seri tabung lau
ryl tryptose Broth (LTB) yang berisi tabung durham. Inkubasi tabung-tabung terse
but selama 48 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Perhatikan gas yang terbentuk setela
h inkubasi 24 jam dan inkubasikan kembali tabungtabung negatif selama 24 jam. Ta
bung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham.
3 dari 17
b)
c)

SNI 01-2332.1-2006
d)
Lakukan Uji penegasan coliform untuk tabung-tabung positif. Uji penegasan coliform
(confirmed coliform)
8.2.2 a)
Inokulasikan tabung-tabung LTB yang positif ke tabung-tabung BGLB Broth yang ber
isi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi BGLB Broth yang telah
diinokulasi selama 48 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Periksa tabung-tabung BGLB ya
ng menghasilkan gas selama 48 jam 2 jam pada suhu 35oC 1oC. Tabung positif ditand
ai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Tentukan nilai angka paling mem
ungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung BGLB yang positif dengan menggu
nakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya sebagai APM/g coliform Uj
i pendugaan Escherichia coli (faecal coliform, presumptive Escherichia coli)
b)
c)
8.2.3 a)
Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang
berisi tabung durham dengan menggunakan jarum ose,. Inkubasi EC Broth dalam wate
rbath sirkulasi selama 48 jam 2 jam pada suhu 45oC 0,5oC. Waterbath harus dalam
keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada d
alam tabung yang akan diinkubasi. Periksa tabung-tabung EC Broth yang menghasilk
an gas selama 24 jam 2 jam, jika negatif inkubasikan kembali sampai 48 jam 2 jam
. Tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham. Tentukan
nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung-tabung EC yang
positif dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Nyatakan nilainya se
bagai APM/g faecal coliform. Uji penegasan Escherichia coli (confirmed Escherichia
coli)
b)
c)
8.2.4 a)
Dari tabung-tabung EC Broth yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke L
EMB agar. Inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC + 1oC. Koloni Escherichia
coli terduga memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam pada bagian tengah
dengan atau tanpa hijau metalik. Ambil lebih dari satu koloni (typical) Escheric
hia coli dari masing-masing cawan LEMB dan goreskan ke media PCA miring dengan m
enggunakan jarum tanam. Inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC+ 1oC. Jika k
oloni yang khas (typical ) tidak ada, pindahkan 1 atau lebih koloni yang tidak k
has (typical) Escherichia coli ke media PCA miring. Uji morfologi
b)
c)
d)
8.2.5
Lakukan uji morfologi dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap koloni Escheri

chia coli terduga. Biakan diambil dari PCA yang telah diinkubasi selama 24 jam (
butir 8.2.4b). Dengan menggunakan mikroskop, bakteri Escherichia coli termasuk b
akteri gram negatif, berbentuk batang pendek atau coccus.
4 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
8.2.6 8.2.6.1
Uji biokimia Produksi indol ( I )
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring (butir 8.2.4b) ke dalam tryptone Broth inkuba
si selama 24 jam 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Uji Indol dilakukan dengan menambahk
an 0,2 ml 0,3 ml pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pad
a lapisan bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning. 8.2.
6.2 Uji voges proskauer (VP)
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring ke dalam MRVP Broth. Inkubasi selama 48 jam
2
jam pada suhu 35oC+1oC. Pindahkan sebanyak 1 ml dari setiap MRVP Broth yang tum
buh ke tabung reaksi ukuran 13 mm x 100 mm steril dan tambahkan 0,6 ml larutan a
lpha naphtol dan 0,2 ml 40 % KOH, kocok, tambahkan sedikit kristal kreatin untuk
mempercepat reaksi. Kocok kembali dan diamkan selama 2 jam. Reaksi positif jika
terbentuk warna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby). 8.2.6.3 Uji
methyl red (MR)
Inkubasikan kembali MRVP Broth di atas (butir 8.2.6.2) selama 48 jam 2 jam pada
suhu 35oC+1oC. Tambahkan 5 tetes indikator Methyl red pada setiap MRVP Broth. Re
aksi positif jika terbentuk warna merah dan negatif jika terbentuk warna kuning.
8.2.6.4 Uji sitrat (C)
Goreskan 1 ose dari PCA miring (butir 8.2.4b) ke permukaan simmon citrat agar. I
nkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35oC + 1oC. Reaksi positif jika terjadi
pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif jika tidak ada
pertumbuhan dan media tetap hijau. 8.2.7 Produksi gas dari laktosa
Inokulasikan 1 ose dari PCA miring (butir 8.2.4b) kedalam LTB. Inkubasi selama 4
8 jam 2 jam pada suhu 35oC + 1oC reaksi positif jika menghasilkan gas pada tabun
g durham.
9
Interpretasi hasil Tabel 2 Interpretasi hasil Biotipe 2 + + Gram negatif, bentuk
batang pendek tidak berspora
Kriteria Gas pada tabung LTB Indol MR VP Citrat Uji Morfologi
Biotipe 1 + + + Gram negatif, bentuk batang pendek tidak berspora
5 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
10
Pelaporan
Berdasarkan interpretasi hasil di atas (pasal 9), nyatakan coliform dan Escheric
hia coli dalam APM/g dengan menggunakan Angka Paling Memungkinkan (APM). Apabila
pengujian menggunakan 3 seri tabung pengenceran gunakan tabel B.1 pada lampiran
B dan apabila pengujian menggunakan 5 seri tabung pengenceran gunakan tabel C.1
pasal Lampiran C.
11
Keamanan dan keselamatan kerja (K3)
Untuk menjaga keamanan dan keselamatan kerja selama melakukan analisa maka perlu
diperhatikan hal-hal sebagai berikut: a) Cuci tangan sebelum dan sesudah melaku
kan analisa; b) Gunakan jas lab selama melakukan analisa; c) Bersihkan meja kerj
a sebelum dan sesudah melakukan analisa; d) Bersihkan segera contoh yang tercece
r dan mengandung bakteri dengan menggunakan bahan desinfektan; e) Media yang sud
ah digunakan disterilkan terlebih dahulu sebelum dibuang.
6 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran A (informatif) Angka paling memungkinkan/APM dengan seri tabung pengenc
eran
A.1
Latar belakang
Metoda untuk menduga jumlah bakteri dalam suatu produk, dapat menggunakan metoda
hitungan mikroskopis, metoda hitungan cawan dan penentuan angka paling memungki
nkan (APM). Organisme yang mati maupun hidup dapat dihitung dengan metoda hitung
an mikroskopis, akan tetapi pada APM hanya organisma hidup yang dapat dihitung.
Metoda APM adalah metoda untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medi
um cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 a
tau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan seca
ra statisitik. Tabung positif ditunjukkan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan ga
s. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut : a) b) c) d) Bakteri
dalam contoh menyebar secara random; Bakteri dalam contoh tidak berkelompok ata
u cluster, tetapi saling terpisah; Organisma yang terdapat dalam contoh dapat tu
mbuh dalam medium selama inkubasi; Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, sepert
i media dan waktu inkubasi.
Di dalam penggunaan seri tabung pengenceran tingkat pengenceran yang diperlukan
didasarkan pada pendugaan populasi bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang bai
k adalah jika pada pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak
menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada pengenceran
lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil uji negatif (ti
dak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi bakteri yang ada d
alam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkan sampai diperoleh tingkat
pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai APM maksimum yang dapat dihitung. M
etoda pengenceran yang paling mudah adalah dengan melakukan pengenceran 10 kali
lipat dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung pengenceran. Metoda APM digunakan
untuk menduga organisma dalam jumlah sedikit (kurang dari 100/g) terutama susu,
air dan makanan yang mempunyai partikel-partikel lain yang mungkin mengganggu ke
akurasian perhitungan. Kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh cukup untu
k memberikan hasil yang signifikan dan umumnya terdapat dalam Tabel APM, sedangk
an kombinasi yang tidak mungkin diabaikan. Tabel APM mempunyai tingkat kepercaya
an 95 %. Jika kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh tidak termasuk dala
m tabel APM maka contoh yang asli harus dilakukan pengujian kembali. Dan jika in
i tidak dapat dilakukan, maka analis harus membandingkan dengan tabel APM yang l
ain untuk menghitung nilai APM berdasarkan hasil yang diperoleh. A.2 Cara pemili
han kombinasi tabung positif pada 3 dan 5 seri tabung pengenceran dalam tabel AP
M Penentuan APM dihitung berdasarkan jumlah seri tabung positif pada beberapa pe
ngenceran yang digunakan yang didasarkan pada 3 atau 5 seri tabung pengenceran y
ang digunakan. Kombinasi yang diambil adalah 3 tingkat pengenceran dengan kaidah
sebagai berikut:
7 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Kasus 1 a) b)
Seluruh tabung pada seri tabung pengenceran (10-1, 10-2, dst) menunjukkan reaksi
positif
Pilih tingkat pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan
2 pengenceran berikutnya, seperti contoh a dan b (Tabel A). Jika pada tingkat p
engenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif (tingkat pengence
ran 103 menghasilkan 1 tabung positif) maka tingkat pengenceran tersebut tingkat
pengenceran tertinggi yang dipilih, seperti pada contoh c (Tabel A). Jika pada
tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung negatif (tingkat) pengenceran 1
03) tetapi tingkat pengenceran berikutnya menghasilkan tabung positif (tingkat p
engenceran 104 menghasilkan 1 tabung positif) maka yang dinyatakan tabung positi
f adalah tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh d (Tabel A). Jika pa
da tingkat pengenceran tertinggi (104) masih terdapat tabung positif, maka pilih
tingkat pengenceran sebelumnya seperti pada contoh e (Tabel A). Tidak ada satup
un dari seri pengenceran yang menghasilkan seluruh tabung positif
c)
d)
Kasus 2 a) b)
Lihat pada contoh f (Tabel A), jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan ta
bung positif (102) maka pilih 2 tingkat pengenceran sebelumnya. Jika pada pengen
ceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif (pengenceran 103 mengh
asilkan 1 tabung positif) maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat peng
enceran sebelumnya seperti pada Tabel C (contoh g). Cara pemilihan kombinasi ser
i tabung pengenceran APM dengan 5 seri tabung engenceran 100 5 4 5 5 5 0 4 Tingk
at pengenceran 101 102 103 5 1 0 5 1 0 4 4 1 4 4 0 5 5 5 0 1 0 4 1 1 104 0 0 0 1
2 0 0 Kombinasi tabung positif 5-1-0 5-1-0 4-4-1 4-4-1 5-5-2 0-0-1 4-4-2 APM/g
33 33 40 40 5400 0,18 4,7
Tabel A.1
Contoh a b c d e f g
8 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran B (normatif) Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai k
ombinasi hasil positif dari 3 seri tabung pengenceran
Tabel B.1
Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif
dari 3 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2 dan 10 3 APM/ g <3,0 3,0 3,0 6,1
6,2 9,4 3,6 7,2 11 7,4 11 11 15 16 9,2 14 20 15 20 27 Tk kepercayaan Bawah 0,15
0,15 1,2 1,2 3,6 0,17 1,3 3,6 1,3 3,6 3,6 4,5 4,5 1,4 3,6 4,5 3,7 4,5 8,7 Atas
9,5 9,6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 10 2 2 2 2 2 3 3 3
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Tab positif
1
Tab positif 10 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2
1
10 0 0 1 1 2 3 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1
2
10 0 1 0 1 0 0 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2
3
10 2 2 2 3 3 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
2
10 0 1 2 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
3
APM/ g 21 28 35 29 36 23 38 64 43 74 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1100
Tk kepercayaan Bawah 4,5 8,7 8,7 8,7 8,7 4,6 8,7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90
180 420 Atas 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1000 1000 20
00 4100 -SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edi
tion, 1998
9 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran C (normatif) Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai k
ombinasi hasil positif dari 5 seri tabung pengenceran
Tabel C.1
Indeks APM dengan tingkat kepercayaan 95% untuk berbagai kombinasi hasil positif
dari 5 seri tabung pada pengenceran 10 1, 10 2 dan 10 3 10 3
0 1 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0
1 4 0 1 2 3 4 5 APM/g <2,0 1,8 1,8 3,6 3,7 5,5 5,6 2,0 4,0 6,0 4,0 6,1 8,1 6,1 8
,2 8,3 10 11 4,5 6,8 9,1 6,8 9,2 12 9,3 12 14 12 14 15 7,8 11 13 11 14 17 14 17
20 17 21 210 130 170 220 280 350 430 Tk kepercayan Bawah Atas 6.8 6,8 0,09 6,9 0
,09 10 0,7 10 0,7 15 1,8 15 1,8 10 0,1 10 0,7 15 1,8 12 0,7 15 1,8 22 3,4 15 1,8
22 3,4 22 3,4 22 3,5 22 3,5 15 0,79 15 1,8 22 3,4 17 1,8 22 3,4 26 4,1 22 3,4 2
6 4,1 36 5,9 26 4,1 36 5,9 36 5,9 22 2,1 23 3,5 35 5,6 26 3,5 36 5,6 36 6,0 36 5
,7 40 6,8 40 6,8 40 6,8 40 6,8 400 70 400 36 400 58 440 70 710 100 710 100 1100
150 Tab positif
Tab positif
10 1
0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
3 5 5 5 5 5 5 5
10 2
0 0 1 1 2 2 3 0 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3
3 3 4 4 4 4 4 4
10 1
3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
5 5 5 5 5 5 5
10 2
3 4 4 5 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3
3 5 5 5 5 5 5
10 3
2 0 1 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 1 2 2 0 1 2 0 1 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2
3 0 1 2 3 4 5
APM/g 24 21 24 25 13 17 21 25 17 21 26 31 22 26 32 38 27 33 39 34 40 47 41 48 23
31 43 58 33 46 63 84 49 70 94 120 150 79 110 140 180 240 350 540 920 1600 >1600
Tk kepercayaan Bawah Atas 70 9,8 40 6,8 70 9,8 70 9,8 35 4,1 36 5,9 40 6,8 70 9,
8 40 6,0 42 6,8 70 9,8 70 10 50 6,8 70 9,8 70 10 100 14 70 9,9 70 10 100 14 100
14 100 14 120 15 100 14 120 15 70 6,8 70 10 100 14 150 22 100 10 120 14 150 22 2
20 34 150 15 170 22 230 34 250 36 400 58 250 22 250 34 400 52 400 70 710 70 1100
100 1700 150 2600 220 4600 400 -700
SUMBER : Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual. 8th edi
tion, 1998
10 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran D (normatif) Pembuatan media
D.1
Brilliant green Lactose Bile Broth 10 g 10 g 20 g 0,0133 g 1 liter
Peptone Lactose Oxgall Brilliant green Aquades
Larutkan Peptone dan Lactose dalam 500 ml Aquades. Tambahkan 20 gram Oxgall dala
m 200 ml Aquades. Atur pH 7,0-7,5. Aduk dan tambahkan Aquades hingga 975 ml. Atu
r pH 7,4 tambahkan 13,3 ml 0,1 % Brilliant green. Tepatkan hingga 1 liter. Pipet
ke dalam tabungtabung yang berisi tabung durham. Sterilisasi selama 15 menit pa
da suhu 121oC. Media ini tersedia secara komersial. D.2 Lauryl Tryptose Broth 20
g 5g 2,75 g 2,75 g 5g 0,1 g 1 liter
Tryptose atau trypticase Lactose K2HPO4 KH2 PO4 NaCl Sodium lauryl sulfate Aquad
es
Campur bahan bahan tersebut diatas dan pipet 9 ml ke dalam tabung ukuran 20 mm x
150 mm yang berisi tabung durham ukuran 10 mm x 75 mm. Sterilisasi selama 15 me
nit pada suhu 121oC, pH media 6,8 0,2 . Media ini tersedia secara komersial. D.3
EC Broth 20 g 31,5 g 5g 4g 1,5 g 5g 1 liter
Trypticase atau tryptose Bile salt No. Lactose K2HPO4 KH2 PO4 Na Cl Aquades
Campur bahan-bahan tersebut diatas dan pipet 9 ml ke dalam tabung ukuran 20 mm x
150 mm yang berisi tabung durham ukuran 10 x 75 mm. Sterilisasi selama 15 menit
pada suhu 121oC . Media ini tersedia secara komersial.
11 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
D.4
Levines Eosin Methylen Blue (L-EMB) agar 10 g 10 g 2g 15 g 0,4 g 0,065 g 1 liter
Peptone Lactose KH2 PO4 Bacto agar Eosin Methylen blue Aquades
Aduk hingga larut Peptone, KH2 PO4 dan agar kedalam 1 liter Aquades. Ambil 100 m
l atau 200 ml campuran tertsebut dan sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC
. Sebelum digunakan lelehkan masing-masing 100 ml dan tambahkan 5 ml larutan ste
ril Lactose 20 % dan 2 ml larutan eosin 2 % serta 4,3 ml larutan methylene blue
0,15 %, didihkan kembali hingga 1 liter. Ambil 100 ml atau 200 ml dan sterilisas
i selama 15 menit pada suhu 121oC. Media ini tersedia secara komersial. D.5 Tryp
tone Broth, 1 % Tryptone atau trypticase Aquades 10 g 1 liter
Larutkan bahan tersebut dan pipet 5 ml ke dalam tabung ukuran 16 mm x 150 mm. St
erilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. Media ini tersedia secara komersial.
D.6 MRVP Broth
Medium 1 Buffered Peptone water powder Glucose KH2 PO4 Aquades Medium 2 Pancreat
ic digest casein Peptic digest dari jaringan hewan Dextrode Potasium phosphate A
quades
7g 5g 5g 1 liter
3,5 g 3,5 g 5g 5g 1 liter
Larutkan bahan-bahan tersebut dalam Aquades. Pipet 10 ml ke dalam tabung ukuran
16 mm x 150 mm. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 118oC -121oC. Media ini te
rsedia secara komersial. D.7 Simmons Citrate Agar 2g 5g 1g 1g 0,2 g 0,08 g 15 g
1 liter
Sodium Citrate Na Cl K2HPO4 NH4H2PO4 Mg SO4 Bromthymol blue Bacto agar Aquades
12 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Aduk dan didihkan 1 menit-2 menit sampai seluruh agar larut. Pipet ke dalam tabu
ng ukuran 16 mm x 150 mm. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 118oC-121oC. Seb
elum beku miringkan tabung hingga memperoleh agar miring 4 cm - 5 cm dan agar te
gak 2 cm - 3 cm. Media ini tersedia secara komersial. D.8 Plate Count Agar 5g 22
,5 g 1g 15 g 1 liter
Tryptone Yeast extract Dextrose Bacto agar Aquades
Panaskan seluruh bahan tersebut hingga mendidih. Sterilisasi selama 15 menit pad
a suhu 121o C. Media ini tersedia secara komersial.
13 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran E (normatif) Pembuatan pereaksi
E.1
Larutan Butterfields Phosphate Buffered
Larutan stok: KH2PO4 Aqudes
34 g 500 ml
Atur pH 7.2 dengan 1 N NaOH. Tepatkan volume larutan tersebut hingga 1 liter den
gan penambahan Aquades. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. Simpan dala
m refrigerator. Larutan kerja : Pipet 10 ml larutan stok dan tepatkan hingga 1li
ter dengan penambahan Aquades. Sterilisasi selama 15 menit pada suhu 121oC. E.2
Pereaksi Kovacs 5g 75 ml 25 ml
p-Dimethylaminobenzaldehyde Amyl alcohol H Cl (concentrate)
Larutkan p-Dimethylaminobenzaldehyde dalam amyl alcohol. Pelan-pelan tambahkan H
Cl. Simpan pada suhu 4oC. Untuk uji Indol tambahkan 0,2 ml - 0,3 ml ke dalam kul
tur bakteri dalam tryptone Broth. Warna merah pada permukaan lapisan menunjukkan
reaksi positif. E.3 Pereaksi VP
Larutan 1 Alpha naphtol Alcohol Larutan 2 KOH4 Aquades
5g 100 ml
0,1 g 100 ml
Cara uji VP : Pindahkan 1 ml kultur setelah inkubasi 48 jam dan tambahkan 0,6 ml
larutan 1 dan 0,2 ml larutan 2. Aduk, untuk mempercepat reaksi tambahkan sediki
t kreatin. Simpan pada suhu ruang selama 4 jam. Reaksi positif jika terbentuk wa
rna merah muda eosin sampai merah mirah delima (ruby). E.4 Indikator Methyl red
0,1 g 300 ml
Methyl red Ethanol 95%
Larutkan Methyl red dalam Ethanol dan tepatkan dengan Aquades hingga 500 ml
14 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
E.5
Pereaksi Pewarnaan Gram
Huckers Crystal violet Larutan A Crystal violet Ethyl alcohol, 95 % Larutan B Amm
onium oxalat Aquades
2g 20 ml
0,8 g 80 ml
Campur larutan A dan B. Simpan selama 24 jam dan saring dengan kertas saring Gra
ms Iodine Iodine Potassium Iodine Aquades
1g 2g 300 ml
Masukkan KJ dalam mortar, tambahkan Iodine dan gerus dengan alat penggiling sela
ma 5 detik -10 detik. Tambahakan 1 ml air dan gerus kemudian tambahkan 5 ml. Tam
bahkan lagi 10 ml dan gerus. Tuang larutan ini dalam botol pereaksi. Bilas morta
r dan alat penggilingnya dan tambahkan air hingga volume 300 ml. Huckers counters
tain (larutan stok) Safranin O Ethanol, 95 % 2,5 g 100 ml
Larutan kerja : larutkan 10 ml larutan stok ke dalam 90 ml Aquades. E. 6 Prosedu
r Pewarnaan Gram
Buat usapan bakteri yang akan diwarnai diatas gelas preparat. Usahakan usapan ya
ng dibuat setipis mungkin. Fiksasi gelas preparat tersebut dengan melewatkan mel
alui api burner. Warna film selama 1 menit dengan larutan Huckers Crystal violet
dan cuci sebentar dengan air. Bubuhkan larutan gram Iodine selama 1 menit. Cuci
dengan air mengalir. Lakukan dekolorisasi (penghilangan warna) dengan Ethanol 95
% hingga seluruh warna biru hilang (kira-kira 30 detik). Cuci kembali dengan ai
r mengalir. Bubuhkan larutan huckers counterstain (safranin) selama 1 menit dan c
uci kembali dengan air mengalir, keringkan dan periksa di bawah mikroskop.
15 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Lampiran F (informatif) Skema penentuan Coliform dan Escherichia coli
Skema Penentuan Coliform dan Escherichia coli
HOMOGENASI 25 g/25 ml contoh dalam 225 ml BFP atau 50 g/50 ml contoh dalam 450 m
l, selama 2-3 menit 1 ml 1 ml
10
1
U U U
9 ml BFP 1 ml 9 ml LTB
101
U 102
1 ml 1 ml 103
102 9 ml LTB
U U U
103
Inkubaasi 48 jam + 2 jam 35C 1C
Tabung - tabung yang positif LTB
U
9 ml BFP
U
UU U
9 ml LTB Confirmed Coliform
U
EC Broth Inkubasi 48 jam + 2 jam, 45 0 0,5 C di water bath Hitung faecal colifor
m APM/g ( Tabel APM) 0 C+
U
BGLB Inkubasi 48 jam + 2 jam, 35 Oc 1 Hitung Coliform APM) APM/g ( 0 C
LEMB Agar Inkubasi 18 jam - 24 jam, 0 o 35 C 1 C
UJI BIOKIMIA (REAKSI
IMViC)
Confirmed
KOLONI terduga E.coli ( hitam pada bagian atau tengah dengan
E. coli
U
TB
U
MRVP

Tabel

U
SITRAT Hitung E. coli APM /g ( Tabel APM)
U
PCA miring Inkubasi 18 jam 24jam 0 o 35

1 C

Produksi gas dari laktosa

tanpa hijau metalik )
UjiMORFOLOGI : GRAM ( bentuk berspora batang pendek
- ), tidak
16 dari 17

SNI 01-2332.1-2006
Bibliografi
Association of Official Analytical Chemistry (AOAC), 2000, Official Methods of A
nalysis, 17th Food and Drug Administration, Bacteriological Analytical Manual. 8
th Edition, 1998. Official Chemical Method, 1979. Fish Inspection Branch Fisheri
es And Ocean Canada.
17 dari 17