LABORATORIUM INSTRUMENTASI ANALITIK

SEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2013-2014

PRAKTIKUM KROMATOGRAFI
Modul

: Kromatografi Kilat

Pembimbing : Ibu Endang Widiastuti

Praktikum

: 30 Mei 2014

Penyerahan

: 6 Juni 2014

(Laporan)
Oleh:
Kelompok

: VI

Nama

Kelas

1. Fauzia Dwi Putri,

NIM 121431010

2. Riska Purwanti,

NIM 121431021

3. Tanty,

NIM 121431026

: 2A

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG
2014

I.

TUJUAN
- Memahami prinsip kromatografi kilat (KKi) dan melakukan pemisahan dengan metoda Kki
- Mampu melakukan pemisahan dan mengidentifikasi sampel dengan metoda KKi

II.

DASAR TEORI

2.1 Prinsip
Flash kromatografi merupakan kromatografi yang teratur dengan tekanan rendah (pada
umumnya < 20 psi) digunakan sebagai kekuatan bagi elusi bahan pelarut melalui suatu ruangan
atau kolom yang lebih cepat. Ini menghasilkan kualitas yang sedang, tetapi pemisahan
berlangsung cepat (10-15 menit). Pemisahan ini tidak sesuai untuk pemisahan suatu campuran
yang terdiri dari macam-macam zat, tetapi sangat baik untuk memisahkan sedikit reaktan dari
komponen utama dalam sintesa organik. Tergantung dari ukuran kolom, berapa gram sample
dapat dilapisi dalam satu waktu. Metode ini dikembangkan oleh Still, W.C., Khan, M., dan Mitra,
A (J. Org. Chem., 43 (14), 2923, 1987). Terdapat suatu pengaturan umum untuk tekanan-tekanan
yang lebih kecil dari 20 psi dengan control (pengawasan) manual pada aliran dan terdapat
pengaturan tekanan-tekanan yang lebih besar 50 psi dengan suatu ukuran tekanan yang mengikat
untuk mengukur aliran. Dari kolom-kolomnya adalah panjangnya 30 sampai 45 cm, perubahan
persediaan dari 250 ml ke 3000 ml dan untuk unit-unit dengan telanan yang lebih besar
disediakan martel epoksi untuk keselamatan. Pembungkus kolom biasanya silica gel. Komponenkomponen ini biasanya dijaga oleh pengapit atau disekrup bersama-sama. Setidak-tidaknya
pemisahan ini harus dilakukan dibelakang pelindung keselamatan. Gelas atau kaca frits tidak
digunakan pada alas kolom karena terlalu banyak volume yang macet di bawahnya. Serat kaca
dan pasir tidak digunakan sebagai pengganti.
2.2 Teknik
2.2.1 Pembungkus Kolom
Sebagian besar pembungkus kolom adalah silika gel. Still menemukan ukuran partikel
terbaik yaitu 40-63 mata jala. Pemisahan diberi tanda sebagai penerimaan waktu (r) dibagi
dengan luas puncak (w).

2.2.2

Metode Pembungkus Kering

Metode dari Still untuk sebuah kolom dengan diameter 2 cm. Penambahan 40-63

mata jala silica gel untuk suatu kedalaman 14-15 dalam sebuah penambahan tunggal. Dengan
stopclock membuka kolom tersebut dengan perlahan-lahan ditepuk dengan tegak lurus pada
suatu puncak untuk mengatur letak puncak. Penambahan 2 mm pada 50-100 mata jala pasir pada
puncak pada alas flat gel. Kolom tersebut diapit untuk memekan pembungkus dan pengelusian.
Bahan pelarut secara hati-hati dituangkan diatas pasir untuk mengisi kolom tersebut dengan
penuh. Katup jarum pengontrol arus tersebut dibuka semua pada jarak tersebut, disesuaikan
dengan kerapatan pada puncak kolom dan dilindungi dengan karet penyambung yang kuat. Klep
garis udara yang utama yang mendorong kearah pengontrol arus dibuka sedikit dan sebuah jari
yang ditempatkan secara tepat diatas karet tersebut. Ini akan menyebabkan tekanan di atas alas
adsorben menaikkan dengan cepat dan menekan silica gel tersebut sebagai solven dipaksa
dengan cepat membungkus kolom tersebut. Hal ini penting untuk menjaga tekanan sampai
semua yang ada di udara dilepas dan bagian yang lebih rendah dari kolom tersebut diam, dengan
cara lain kolom tersebut akan pecah dan harus dibungkus kembali.
2.2.3 Pembungkus Basah
Dalam metode ini silica gel dibuat dalam suatu noda dan dituangkan ke dalam
kolomdengan cara membuka jalan keluar. Tekanan dipasang untuk mempertahankan bahan
pelarut yang keluar lewat bagian bawah dan juga membungkus kolom tersebut dengan rapat
tanpa adanya pengikatan udara. Tekanan tersebut dilepaskan, stopcock ditutup, sample
ditambahkan kemudian diikuti dengan prosedur elusi yang tetap.
2.2.4 Pompa
Untuk kebanyakkan aplikasi, udara dari sebuah penekanan angin digunakan, dan
suatupompa tidaklah diperlukkan. Ini mingkin dari sebuah silinder udara. Bagaimanapun, untuk
tujuan pemisahan yang hanya memiliki dana yang minim, dua pelengkap penekan rendah telah
diuji.Tekanan pompa yang lebih rendah adalah suatu pengaturan balon ganda. Suatu balon besar
ditempatkan di dalam balon lain, ditutup dan dikaitkan dengan puncak kolom. Tekanan-tekanan
pada 2-3 p.s.i dicapai. Tekanan tersebut tetap bagus karena volume balon tersebut lebih besar

dari pada volume bahan pelarut yang digunakan. Untuk tekanan yang lebih tinggi, tergantung
dari luas dan bahkan lebih dari suatu laju arus.
2.2.5 Penekan Gas Udara
Penekan udara digunakan secara normal kecuali jika campuran merupakan udara/oksigen
yang sensitive. Kemudian penekan nitrogen digunakan. Gas-gas ini ditekan oleh pompa yang
mempunyai segel minyak, sehingga gas selalu berisi uap air minyak dalam jumlah yang kecil.
Sebuah perangkap antara persediaan dan kolom tersebut dapat digunakan. Tetapi hanya
digunakan jika diinginkan kemudian dihasilkan produk yang sangat tinggi. Dengan perlindingan
system sesederhana mungkin.
2.2.6 Penambahan Sampel
Tujuan pengontrolan arus adalah untuk mengurangi tekanan gas berikutnya yang
diperlukan adalah laju arus bahan yang sesuai dan untuk membebaskan gas yang berlebih keluar
melalui suatu lubang angin. Pengontrol komersil memberikan lima pengontrol kendali dan dapat
bergantian sesuai dengan keperluan untuk perbedaan luas-luas kolom dan berubah-ubah dalam
viskositas pada bahan-bahan pelarut. Bagaimanapun, jika sebuah system sederhana diperlukan
pemisahan yang rutin untuk itu diperlukan pengontrol arus.
2.2.7 Elusi Bahan Pelarut
Pengalaman telah menunjukkan bahwa pemisahan terbaik berlangsung jika diinginkan
komponen yang mempunyai suatu Rf 0.35 pada suatu silica gel lapis tipis dan tidak murni pada
kurang lebih 0.15 Rf ml. system bahan pelarut yang telah ditemukan untuk bekerja dengan
baik meliputi 10-50 % campuran etil asetat / 30-600C dengan petroleum eter atau dengan
heksan.
2.2.8 Pengumpulan dan Deteksi
Sampel lewat dengan sedemikian cepat sehingga harus ditemukan sebuah cara yang
mudah untuk mengumpulkan fraksi-fraksi yang ada..Aliran sampel dapat dipantau dengan
menggunakan detektor uv dan fraksi-fraksi target yang telah diperoleh. Yang telah terbukti
berhasil adalah penggunaan rak tabung uji yang memuat beberapa tabung uji berukuran 20150

mm dan pengumpulan satu fraksi ke dalam setiap tabung tersebut. Ketika dilakukan
kromatografi, fraksi-fraksi yang mengandung senyawa yang diinginkan akan teridentifikasi dan
derajat pemisahan yang dicapai pun diketahui.
2.3 Aplikasi Flash Chromatography
Kromatografi Kolom Kering Tehnik kromatografi kolom kering ini tidak lain merupakan
modifikasi dengan memanfaatkan keunggulan-keunggulan "Flash chromatography" yaitu
pemisahan yang baik dan cepat. Modifikasi yang dilakukan pada prinsipnya memikirkan bahan
yang lebih murah,peralatan yang lebih sederhana dan lebih praktis. Ada dua perbedaan yang
mendasar, pertama tehnik ini menggunakan sistem pengisapan (suction) untuk mempercepat
proses elusi menggantikan sistem penekanan dengan gas. Oleh karena itu proses ini sering
disebut dengan kromatografi cairan vakum ( Vacuum Liquid Chromatography-VLC).
Flash chromatography memisahkan senyawa organik pada pKa tinggi dengan
menggunakan kolom Teledyne Iscos specialty RediSep. Komponen organik dapat berinteraksi
dengan permukaan senyawa silanol pada kromatografi Flash normal. Interaksi ini menyebabkan
timbulnya goresan puncak tidak tajam, yang akan menyebabkan penumpukan (overlapping)
fraksi selama proses pemisahan pada kromatografi. Untuk memperbaiki resolusi pada pemisahan
senyawa organik atau asam organik, para ahli kimia membuat suau tipe dengan menambahkan
fase gerak yang telah di modifikasi untuk mengurangi goresan puncak. Penambahan sample
dapat menjadi sebuah masalah. Pada kromatografi jenis ini perlu ditempatkan sample di tempat
yang setipis mungkin. Mempermudah penambahan sample dapat menggunakan corong
penambahan sample, dimana sebuah corong dengan tangkai panjang dan teratur, dengan
pembengkokkan pada ujung-ujung tangkai corong dan dengan lobang 4 mm disamping bagian
bawah dinding kolom. Agar ketika sample mencapai puncak atas kolom tidak terjadi gangguan
pada puncaknya.
Kontrol Arus Mempertajam puncak. Triethylamine atau ammonium hydroxide adalah
bahan modifikasi tambahan untuk fase gerak. Teledyne ISCO menawarkan beberapa kolom Redi
Sep khusus yang tersedia untuk flash kromatografi agar lebih efisien dalam pemisahan pada pKa
tinggi dari senyawa organik. Dengan menggunakan kolom tersebut dapat meminimalkan waktu
pemisahan dengan meningkatkan resolusi pemisahan.

III.

DATA PENGAMATAN
Gambar

Keterangan
Eluen dengan berbagai perbandingan.
Perbandingan antara Metanol dan
Diklorometan. Mulai dari 50:0; 40:10; 30:20;
20:30; 10:40; 50:0.

Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom

saat eluen pertama dimasukkan yaitu DCM
100% atau 50 mL Diklorometan. Belum
terjadi pemisahan pada sampel.
Gambar sebelah kanan adalah eluen yang
telah dilewatkan kedalam kolom.
Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom
saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM dan
Metanol dengan perbandingan 40 : 10. Telah
terjadi pemisahan warna dalam kolom.
Gambar sebelah kanan adalah eluen yang
telah dilewatkan kedalam kolom. Eluen jadi
berwarna merah muda, bercampur dengan
warna biru.
Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom
saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM :
Metanol dengan perbandingan 30 : 20. Hanya
tinggal warna biru dari sampel yang terdapat
dalam kolom.
Gambar sebelah kanan adalah eluen yang
telah dilewatkan kedalam kolom. Eluen
berwarna biru muda.
Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom
saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM :

Metanol dengan perbandingan 20 : 30. Sudah

tidak ada lagi warna yang terdapat dalam
kolom.
Gambar sebelah kanan adalah eluen yang
telah dilewatkan kedalam kolom. Tidak
terjadi perubahan warna.

Eluen ke 5 dengan perbandingan DCM dan

Metanol 10 :40, tidak mengalami perubahan
warna setelah dilewatkan dalam kolom.
Karena sampel sudah terbawa oleh fasa
gerak.

Eluen ke 6 dengan perbandingan DCM dan

Metanol 0 :50, tidak mengalami perubahan
warna setelah dilewatkan dalam kolom.
Karena sampel sudah terbawa oleh fasa
gerak.

a. Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Rhodamin B dengan Spektrofotometri

Visible
Panjang gelombang (nm)
380
400
420
440
460
480
500
510
540
550
560 (
)

Transmitan (%T)
87,8
81,3
83,2
91,1
87,5
70,0
37,3
18,8
4,10
3,60
2,30

Absorbansi (A)
0,057
0,090
0,080
0,040
0,058
0,155
0,428
0,726
1,387
1,444
1,638

570
580

9,10
45,5

1,041
0,342

maks

Kurva panjang gelombang maksimum Rhodamin B

1.600
1.400
1.200
1.000
absorbansi 0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
350

400

450

500

550

600

panjang gelombang (nm)

Dengan Spektrofotometri UV-Vis Shimadzu

(DCM: MeOH) 50:50 adalah 560 nm.

maks

Rhodamin B dengan komposisi eluen

b. Pengukuran

Panjang

Gelombang

Maksimum

Methylene

Blue

dengan

Spektrofotometri Visible
Panjang gelombang (nm)
400
420
440
460
480
500
520
540
560
570
580 (
)

Transmitan (%T)
94,7
97,5
98,1
97,8
97,2
93,6
88,2
80,4
77,7
76,5
69,2

Absorbansi (A)
0,024
0,011
0,008
0,010
0,012
0,029
0,055
0,095
0,110
0,116
0,160

600
620

70,0
74,6

0,155
0,127

maks

Kurva panjang gelombang maksimum Methylene Blue

0.160
0.140
0.120
0.100
Absorbansi

0.080
0.060
0.040
0.020
0.000
350

400

450

500

550

600

650

panjang gelombang (nm)

Dengan Spektrofotometri UV-Vis Shimadzu

(DCM: MeOH) 50:50 adalah 580 nm.

maks

Methylene Blue dengan komposisi eluen

c. Pengukuran absorbansi sampel

Komposisi Eluen

maks

Rhodamin B

(560 nm)
%T
A
96,7
0,16
4,2
1,426
90
0,046
96,8
0,014
98,7
0,008
99,1
0,001

(DCM : Metanol)
50 : 0
40 : 10
30 : 20
20 : 30
10 : 40
0 : 50

maks

Methylene Blue

(580 nm)
%T
A
100
0
23,5
0,648
87,6
0,058
97,3
0,011
97,3
0,09
98,7
0,03

Kurva Pengukuran Absorbansi Sampel

1.6
1.4
1.2
1
Adsorbansi

0.8
A560

0.6

A580

0.4
0.2
0
0

10

20

30

40

Komposisi DCM

IV.

PEMBAHASAN

50

60

Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk memahami prinsip kromatografi kilat serta
melakukan pemisahan dan identifikasi terhadap sampel dengan metoda KKi. Kromatografi kilat
adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari suatu campuran dalam
jumlah tertentu berdasarkan afinitas sampel terhadap fasa gerak maupun fasa diam yang berada
pada kolom dengan penambahan tekanan dari luar ( pompa ) untuk menekan fasa gerak, oleh
karena itu kecepatan aliran dari fasa gerak yang melalui fasa diam tidak hanya dipengaruhi oleh
gaya grafitasisaja, melainkan dipengaruhi juga oleh besarnya tekanan dari pompa. Sama halnya
dengan kromatografi kolom, prinsip kerja pemisahan senyawa pada kromatografi kilat pun
didasarkan pada afinitas sampel terhadap fasa gerak dan fasa diamnya. Sampel yang mempunyai
afinitas besar terhadap fasa diam akan secara selektif tertahan sedangkan yang afinitasnya paling
kecil akan mengikuti aliran pelarut.
Metode pemisahan dengan kromatografi kolom kilat ini, kolom yang digunakan adalah
kolom yang terbuat dari kaca dengan pompa dan labu penampung fasa gerak diatasnya,
sedangkan fasa diam yang digunakan adalah silika gel karena silika gel memiliki tekstur dan
struktur yang lebih kompak serta teratur, dan fasa gerak yang digunakan adalah Methanol dan
DCM dengan komposisi DCM : Mathanol berturut-turut 50%:0%, 40%:10%, 30%:20%,
20%:30%, 10%:40%, dan 0%:50%. Fasa gerak akan membawa campuran komponen keluar dari
kolom. Karena afinitas komponen dalam sampel terhadap fasa gerak maupun fasa diam berbedabeda sehingga terjadi pemisahan komponen dalam campuran. Komponen yang terpisah
merupakan pita-pita dalam fasa diam, dan masing-masing pita didorong keluar kolom dengan
penambahan fasa gerak.
Meoda yang digunakan untuk memasukan silika gel kedalam kolom adalah metoda
basah. Dalam metode basah ini, silika gel yang akan digunakan sebagai fasa diam terlebih dahulu
disuspensikan dengan fasa gerak yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom
melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit agar tidak terdapat rongga udara
dalam silika gel yang akan mengganggu proses pemisahan sampel. Karena jika terdapat rongga
dalam kolom, maka total jarak yang ditempuh oleh sampel dari awal sampai akhir akan berbedabeda sehingga pemisahan tidak dapat berjalan dengan maksimal dan juga dapat mempengaruhi
kecepatan pemisahan. Kemudian, eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel

mapat eluen dibiarkan mengalir hingga ketinggian eluen 2 cm diatas permukaan silika gel agar
silika gel tersebut tidak kering dan mengeras.
Pada praktikum kali ini, sampel yang digunakan dalah percampuran antara metilen biru
1% dan rhodamin B 0,5% dengan perbandingan antara metilen biru dan rhodamin B adalah 5:1.
Sebelum dimasukan, terlebih dahulu sampel dicampurkan dengan silika gel hingga berbentuk
pasta, barulah sampel dimasukan kedalam kolom tepat diatas fasa diam yang digunakan. Setelah
sampel dimasukan dalam kolom, barulah sampel tersebut didorong keluar sampel dan dipisahkan
menjadi fraksi-fraksi dengan menggunakan fasa gerak yang dibantu oleh pompa agar pergerakan
dan pemisahan sampel dapat lebih cepat. Penambahan fasa gerak ini dilakukan secara perlahan
melalui dinding kolom agar tidak terbentuk rongga pada kolom yang akan menghambat proses
pemisahan fraksi-fraksi sampel dalam kolom.
Pemisahan fraksi-fraksi pada sampel dengan menggunakan kromatografi kilat,
didasarkan pada afinitas sampel terhadap fasa diam dan fasa geraknya. Afinitas ini dipengaruhi
oleh kepolaran dari sampel, fasa diam dan fasa gerak tersebut. Agar fraksi tertentu turun, maka
kepolaran dari fasa gerak harus ditingkatkan dari non polar sampai polar, hal ini dikarenakan
didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya. Untuk meningkatkan
kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran pelarut. Sebelum fraksi itu turun dan keluar
dari kolom, kita akan melihat pita-pita warna pada kolom kromatografi.
Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, terlihat bahwa sampel terpisah menjadi 2
warna yakni pink (rhodamin B) dan biru ( metilen biru). Terpisahnya kedua warna tersebut
terjadi saat penambahan eluen yang pertama dengan perbandingan DCM:metanol ( 50:0 ),
sedangkan pada penambahan eluen yang kedua dengan perbandingan DCM:metanol (40:10),
warna pink (rhodamin B) dan biru (metilen biru)

keluar dari kolom dengan warna pink

(rhodamin B) keluar terlebih dulu kemudian disusul oleh warna biru (metilen biru). Hal tersebut
menunjukan bahwa metilen biru memiliki sifat yang lebih polar dibandingkan dengan rhodamin
B. Sehingga metilen biru memiliki afinitas yang lebih besar dengan silika gel (fasa diam) yang
bersifat polar juga, oleh karena itu metilen biru lebih lama tertahan dalam kolom. Sedangkan
rhodamin B, memiliki afinitas yang lebih tinggi dengan eluen yang digunakan dibandingkan
dengan afinitasnya terhadap silika gel (fasa diam) sehingga dapat keluar kolom lebih dulu. Hal

tersebut disebabkan perbandingan

eluen yang digunakan lebih banyak mengandung DCM,

dimana DCM ini merupakan larutan yang memiliki kepolaran rendah, sehingga eluen DCM :
metanol ( 40 : 10 ) ini pun memiliki kepolaran yang rendah pula atau bahkan cenderung bersifat
non polar.
Setelah semua eluen dilewatkan kedalam kolom, maka hasil dari setiap eluen tersebut
diukur

dengan

menggunakan

alat

spektrofotometri

Visible

untuk

mengetahui

membandingkan nilai absorbansi terhadap kepekatan warna yang dihasilkan.

dan

Panjang

gelombang yang digunakan dalam pengukuran dengan spektrofotometri ini adalah panjang
gelombang maksimum dari rhodamin B dan metilen biru yang telah didapatkan dari percobaan
sebelumnya, yakni 560 nm untuk rhodamin B dan 580 untuk metilen biru. Panjang gelombang
tersebut tidak jauh berbeda dengan panjang gelombang maksimum rhodamin B dan metilen biru
berdasarkan literatur yakni 544 nm dan 586 nm.
Dari data pengamatan dapat diketahui bahwa adsorbansi teringgi yang didapat pada
lamda 560 nm dan 580 nm adalah adsorbansi eluen yang kedua yakni 1,426 pada lamda 560 nm
dan 0,648 pada lamda 580 nm hal ini sesuai karena sampel yang diukur berwarna keunguan yang
merupakan percampuran dari warna merah (Rhodamin B) dan biru (metil biru). Akan tetapi
dapat dilihat bahwa adsorbansi pada lamda 560 nm lebih besar dibandingkan adsorbansi pada
580 nm, hal tersebut dikarenakan warna yang dominan pada eluen yang kedua ini adalah merah
(Rhodamin B), itu membuktikan bahwa lamda 560 nm ini merupakan lamda maksimum untuk
rhodamin B sehingga pada panjang gelombang tersebut, rhodamin B dapat terserap secara
maksimal. Adsorbansi yang besar untuk eluen yang kedua ini menunjukan bahwa sampel paling
banyak keluar dari kolom ketika diberi eluen yang kedua. Sedangkan adsorbansi eluen yang
berikutnya semakin kecil, hal tersebut dikarenakan sampel yang keluar dari kolom setiap
penambahan eluen berikutnya sudah semakin sedikit bahkan mendekati habis pada penambahan
eluen yang terakhir, ditunjukan dengan nilai adsorbansi yang sangat kecil, yaitu 0,001 pada
lamda 560 nm dan 0,03 pada lamda 580 nm.

V.

KESIMPULAN
1. Sampel terdiri dari senyawa yang memiliki kepolaran berbeda.
2. Metilen blue merupakan senyawa yang bersifat lebih polar daripada Rhodamin B.
3. Pemisahan dengan menggunakan kromatgrafi kilat dipengaruhi oleh dorongan/tekanan
dari pompa yang digunakan.
4. Semakin tinggi tekanan maka kecepatan laju alir eluen dan proses
pemisahan semakin cepat

VI.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2013.Pelarut. http://id.wikipedia.org/wiki/Pelarut [diakses pada tanggal 3 Juni 2014]

Firmansyah,

Bayu.

2010.

Kromatogravi

Vakum

Cair

(KVC).

http://www.bayufirmansyah.com/2010/08/kromatografi-vakum-cairkvc.html
[ diakses pada tanggal 4 Juni 2014]