HPLC

Slide 1.

Hplc dan uplc sama sama liquid kromatografi. Liquid kromatografi maksutnya adalah menggunakan
fase gerak cair yang bergerak melewati kolom dan terdapat fase diam yaitu ada pada kolom (kolom
kromatografi) atau pada bagian atas kaca (tin layer kromatografi). Kolom berbentuk silinder atau
tabung yg terdapat zat atau material yang sebagai fase diam. Jika liquid kromatografi maka cairan
akan beregrak melewati kolom. Fase geraknya bisa menggunakan air standar kromatografi atau
menggunakan air aquabides yaitu air yang didestilasi 2 kali atau aquabidestilata atau juga bisa
menggunakan pelarut organic polar/nonpolar yang tergantung dengan kolomnya. Fase gerak etanol,
methanol dan asetonitril (polar) dengan fase diamnya c18 (nonpolar) maka disebut system reverse
phase (RP hplc). Jika menggunakan kolom silika (polar) dan fase geraknya heksana (nonpolar) maka
disebut normal phase (NPHPLC). Fase diam seperti c18 yang cair akan di ikat oleh silika yang
berfungsi sebagai pendukung material. Yang membedakan UHPLC dengan HPLC adalah material
pendukungnya lebih kecil atau lebih padat pada UHPLC shg diperlukan ultra high performance atau
tekanan yang lebih tinggi karena kolomnya lebih mampat atau kurang dari 3micron.

Slide 2.

(1) Solvent reservoir berisi dengan liquid atau pelarut dan jg ada bagian section terdapat pori2 untuk
menyaring benda2 pengotor yang akan menyedot pelarut msk ke dlm pompa dgn max 400 bar (2).
Section harus terendam cairan agar tidak tersedot udara karena HPLC tidak boleh ada udara
sehingga tidak bisa terbaca. (3) mixing chamber untuk mencampur fase gerak jika yang digunakan
lebih dari 1. (4) injector yang akan membawa sampel bersama2 fase gerak ke kolom yang memiliki
ukuran kolom 3-10micron dan bisa menggunakan diam silika atau c18 cair yang diikatkan diatas
permukaan silika. Selongsong kolom terbuat dari stainless steil/logam yg mudah gampang berkarat.
Jika menggunakan c18 maka akan dibasuh dengan aseton nitril 100%/ methanol agar tidak rusak
kolomnya pada saat selesai menggunakannya. Asetonnitril/ metanol (nonpolar), hexana 100%
(polar). Setelah dari kolom maka masuk kedalam detector. Dari detector ke solvent trash. Sheetmen
untuk spesifikasi kolom. Fse gerak masuk lwt in fase kolom dan keluar dari outnya fase kolom.
Pekerjaan analitik yaitu hanya akan menganalisis kromatogram dan mengkuantifikasi kadar senyawa
yg dianalisis, pekerjaan preparative tdk hanya menganalisis tetapi juga mengambil kembali yang dari
kolom (menampung) senyawa yang diinginkan. Dilakukan untuk mempunyai standar sendiri dengan
mengeringkannya sehingga bisa digunakan kembali.

Slide 3

Isokratik = memakai 1 jenis solvent. Solvent ditarik ke dalam pompa, lalu masuk ke dalam injector
lalu masuk ke kolom dan detector dan terbaca computer lalu solventnya bisa dibuang atau
digunakan lagi. Gradient: menggunakan 2 macam solvent dan kedua macam solvent dibuat gradient
yaitu komposisinya berbeda. Jika pada 0 menit konsnetrasinya isopropanol 70% dan konsentrasi
asetonitril 30% lalu pada menit 2 konsentrasinya berubah. Jika gradient harus menggunakan pompa
sistemnya binary pump/ binary pen. Quartary pump.

Slide 4

Kolom berada diluar berrati samplenya menggunakan suhu ruang.

Slide 5

Ms merupakan general detector dan bisa analisis simultan yaitu berbagai jenis senyawa dalam satu
waktu. Suhu kolom pada HPLC yang tinggi yaitu 80˚C. UHPLC sampai 1000 bar-1200 bar tekananya.

Slide 6

Perbedaan HPLC dan UHPLC adalah ukuran diameter kolom pada UHPLC adalah kurang dari 3 micron
dan tekananya lebih tinggi yaitu 1000-1200 bar/800-1000 bar. Menggunakan ukuran kolom yang
kecil sehingga resolusinya lebih baik sehingga 1 senyawa lebih mudah dipisahkan dgn senyawa lain,
sehingga puncaknya lebih runcing dan mendekati garis lurus. Jumlah teoritical plate numbernya jauh
lebih banyak yaitu mencapai diatas 10000 kalo HPLC 5000-10000. Pemisahannya bisa terjadi karena
memiliki teoritical plate numbernya yang banyak jadi semakin banyak piringan maka semakin mudah
senyawanya terpisah. Piringannya tidak terlihat, banyak layer2 yang membentuk keseimbangan yg
akan membuat suatu senyawa yg satu lebih cepat dan yg satu lebih lambat sehingga mudah
terpisah.

Slide 7

Tabel ini untuk liquid kromatografi yg menggunakan oven kromatografi ukuran partikel bukan untuk
HPLC. Ini untuk preparasi sampel jk sampelnya banyak zat pengotornya. Ukuran pori 125 untuk berat
molekul dibawah 2000. Ukuran yang BM diatas 5000 maka menggunakan ukuran pori 300.

Slide 8

Detector bisa menggunalan uv-vis, fluorescence, refractive index, atau electrochemical. Detector uv
vis scr umum untuk senyawa2 yg memiliki ikatan rangkap atau senyawa yg memiliki gugus cincin
aromatic, analisis kompleks senyawa yg bisa memberikan warna dan ion-ion yang dikompleks mjd
senyawa berwarna. Fluorescence untuk senyawa yg bisa ber fluorescence yaitu senyawa yg memiliki
cicin benzene lebih dari satu, beberapa kontaminan seperti aflatoxin. refractive index merupakan
detector yang umum tetapi berbeda dengan MS, jika MS general tapi sangat sensitive tetapi jika
refractive index general detector kurang sensitive jd senyawa yg dianalisis harus dalam kadar jumlah
yg banyak yaitu (%) bukan dalam ppm, ppb. Electrochemical untuk senyawa2 fenolik yang bisa
bermuatan seperti asam organic

Slide 9

HPLC mudah diaplikasikan pada senyawa volatile, non volatile, senyawa kecil/ besar. UHPLC lebih
sensitive dan memiliki sistemnya yg sama dgn HPLC. Pada UHPLC menggunakan asam format 0,1%
difase gerak untuk membuat puncaknya lebih runcing.

Slide 10
Aplikasi HPLC untuk preparative, separasi kimia, pemurnian dan identifikasi senyawa.

Slide 11

Pekrjaan analitik menggunakan kolom yg lebih kecil diamternya 0,5 cm. pekerjaan semi preparative
dan analisis jiga bisa diameternya sekitar 1 cm. tetapi untuk analisis jika kolomnya 1 cm maka tidak
bisa untuk sampel yg sedikit minimal 100microliter shg mudah dideteksi oleh detector. Preparative
diameternya lebih dari 1 cm. pekerjaan industry diameter kolomnya sampe 5 cm. ukuran partikelnya
adalah 5micron.

Slide 12

Kromatogram yaitu hubungan dengan respon detector dengan waktu retensi. Waktu retensi ada 1
puncak yg tdk ditahan oleh kolom yg dapat digunakan untuk menghitung rongga didlm kolom supaya
jika ingin membilas kolom kita tau volume kolomnya. Analat usahakan ada dibagian akhir.
Theobromine dan caffein bisa dianalisis dengan uv pada panjang gelombang 280nm. Puncaknya
tumpul berrati HPLC memiliki diameter partikel sekitar 10 micron jika runcing ukurannya partikelnya
5micron. Kenapa puncaknya tumpul karena piringan teoritisnya itu kurang dari 10000 sehingga
menghasilkan puncaknya tumpul

Slide 13

Analit usahakan ada dibelakang.

Slide 14

Kuantifikasi analisis HPLC menggunakan kurva standar. Kurva standar dibuat dengan beberapa
konsentrasi yg diinjek kedalam HPLC. HPLC ada proses derivatisasi yg bertujuan agar senyawa yg
tidak bisa dideteksi menjadi bisa di deteksi. Senyawa yg tidak mempunyai ikatan rangkap bisa
dikompleks dg senyawa yg bisa menyerap di panjang gelombang UV VIS. Terkadang hasilnya
memberikan hasil samping reaksi, hasil reaksinya karena ada perekasi yg jumlahnya sama jadi ada
puncak yg tingginya sama tetapi hasil reaksinya berbeda-beda tergantung dr konsentrasi analitnya.
Semakin tinggi konsentrasi maka puncaknya semakin tinggi. Luas area linier dengan konsentrasinya.

Slide 15

Luas area dengan konsentrasi maka kurvanya lurus. Kurvanya dipake buat kuantifikasi.

Slide 16

Kuantifikasi dengan perbandingan luas area yaitu dengan menggunakan satu larutan standar dan
dengan konsentrasi larutan standar aja. Jadi jk sampel di injeksi memiliki luas area 10 kali dr standar
maka konsentrasinya adalah 10 kali dr standar juga. Lebih kasar perhitungannya atau kurang akurat.

Slide 17

HPLC bisa menentukan berat molekul yang dari molekul besar seperti protein, pati, amilosa,
amilopektin, enzim, dll. Berat molekul 2000 KDa berarti 2 juta BMnya. Kolom yang dipake tdk bisa
silika dan C18 hanya sampai 10 rb saja, jika sampe 100 ribu menggunakan kolom filtrasi gel
contohnya adalah superpose 6 gel filtration coloum atau sepadex 5. Analisis BM dgn HPLC bisa dari
BM kecil sampai besar yaitu ratusan ribu sampe jutaan. Untuk BM jutaan bisa kuantitatif yaitu bisa
mengetahui kadarnya tapi juga bisa penentuan BM. Tetapi memerlukan standar berbagai macam
senyawa dgn BMnya yg berbeda. Waktu retensi menandai BM berapa bisa muncul di waktu
retensinya. Gel filtration pemisahannya berdasarkan perbedaan ukuran molekul atau BM. Pada gel
ini yang muncul pertama kali adalah yg memiliki BM tinggi lalu ke BM rendah. Jika puncaknya berada
di 2 BM yg berbeda maka bisa ditentukan dengan membuat kurva yaitu hubungan antara BM
dengan waktu retensi. Waktu retensi pada puncaknya di plotnya ke kurvanya. CP=carboxy peptidase.

Slide 18

i.d = inner diameter/ internal diameter. Biasanya menggunakan maks 200bar. Jika di ada yg nyumbat
dan kita set pada tekanan yg rendah maka HPLC akan otomatis mati dan tdk merusak kolom,
sedangkan jk diset pada tekanan tinggi maka kolom akan rusak yaitu berongga (kosoong).

Slide 19

Void volume= volume rongga diantara partikel2nya. Panduan untuk mengetahui pembilasan kolom
yang minimal 10X volume kolom shg kita tau brp volume yg harus dilewatnkan jika laju alirnya 1 ml/
menit berrati berapa menit karna kita tau volumenya 10X kan jadi 17,5 ml. jika laju alirnya
1ml/menit berarti dilwtkan selama 17,5 menit minimal baru kolomnya bisa dipakai. Kolom sebelum
digunakan harus dibilas atau dikondisikan (conditioning) dengan fase gerak yg digunakan dan perlu
meinjek pelarut tanpa analatnya untuk mengetahui base linenya yang tidak boleh ada puncaknya.
Jika ada puncak maka dpt disimpulkan bahwa kolom yg kotor atau pelarut yg kotor. Jika ada puncak
maka itu bkn sampel yg diujikan .

Slide 20
HPLC suhu biasanya dogunakan 60 derajat

Slide 21

Degassing tambahan dari intrumen HPLC jk ada degaser yg akan mengusir udara shg tdk msk
kedalam HPLC. Botol diisi pelarut section yg terbuat dari stainlees steel atau logam atau telfon yg
terbuat dari plastik. Fase gerak umumnya sudah disaring dengan membran 0,22-0,45 micron dan
harus dilakukan degassing dialat ultrasonik shg bisa dipake. Ultrasonik seperti water bath ini akna
membuat getaran suara shg jk ada gas yg didalamnya akan keluar prosesnya sampe 10-20 menit jk
terlalu lama maka akan menyebabkan panas.

Slide 22

Jika ada udara maka puncaknya kromatogram akan tinggi2 dan membuat mengira itu puncak
senyawa padahal puncak udara karena menurunkan background.

Slide 23

Binary pum (2 head)

Slide 24

Laju alir constant 1 ml/menit atau dengan tekanan konstan. Tekanan konstan akan membuat laju
alirnya naik turun. Laju alir konstan akan membuat tekananya yg naik turun. Pada umumnya
menggunakan laju aliran konstan karena lebih producible.

Slide 25

Pompa= jantungnya HPLC. HPLC bisa sistemnya berbeda2 karena penggunaan kolom dan fase
geraknya. Kolom separose menggunakan kolom gelas tdk menggunakan stainless steal.

Slide 26

Kolom filtrasi gel teknaanya 30 bar jadi bisa menggunakan HPLC, jarang menggunakan UHPLC
menggunakan kolom filtrasi gel

Slide 27

Manual tanpa loop= menggunakan cairan yg pas dengan injek, jika 20 micro maka yg masuk akan 20
mikro

Loop= logam semacam tabung yg sudah di tera volumenya dipasang di injector HPLC

Jadi jika menggunakan loop maka yg diinjek itu minimal 2-3 X volume loop, jika kita volume loop 20
microL maka yg diloud 40microL lalu yg masuk akan 20 microL dan sisanya dibuang kewadah
buanagn dibelakang injector
Otomatis= menggunakan robot akan injek mengambil cairan. Maka robot akan membilas searing
otomatis

Slide 28

Selongsong kolom bisa trebuat dari stainless steal, mika dan kaca

Packing material=solid material didlm kolom

Silika ukurannya bisa kecil sampai dibawah 3 micrin atau 3-10 micron. 250-300 bar

Resin (sintetik plastic) tidak bisa kecil ukurannya diatas 20 micron. Resin digunakan untuk
kromatografi filtrasi gel. Bisa untuk permease gel dan ion exchange kromatografi. Tekananya tidak
bisa tinggi yaitu 100-200 bar.

Air/buffer fase geraknya disebut dengan filtrasi gel

Menggunakan agarose atau sephadex adalah menggunakan fase geraknya etanol maka disebut
kerjanya permease gel. Tidak tahan tekanan tinggi yaitu paling tinggi sampe 30 bar/300 psi. untuk
molekul besar yaitu diatas 10KDa.

Slide 29

Kolom yg panjang yg kebih baik karena memiliki lempeng teoritis yg lebih banyak. Ukuran partikel yg
lebih kecil maka piringan teoriticalnya lebih banyak karena lebih mampat. Kolom yg lbh panjang akan
memperbesar jumlah pirangan teiritis, semakin besar jumlah piringan teoritisnya maka efeisensi
kolomnya semkain tinggi atau kapasitas kolom semkain tinggi. Ukuran partikel kolom semakin kecil
maka efisiensinya semkain tinggi.

Slide 30

Kolom umunya terbuat dari staibless steal tp tidak tahan air.

Slide 31

Menggunakan guard coloum agar kolom utamanya tidak kotor karena kolom utama lebih mahal.
Kolom guard ini lbh pendek

Slide 32

Detector HPLC dan UHPLC sama sistemnya. Laju alir UHPLC tidak setinggi HPLC. HPLC 1ml/menit kalo
UHPLC 0,2 ml/menit paling tinggi 0,5 ml/ menit. Solute= mendetektor adanya analat kalo ada analat
kecil maka puncaknya kecil jk besar maka puncaknya besar. Kalo solute base linenya mendekati nol.

Kalo bulk detector merespon pada fase geraknya jika ada fase gerak lewat maka sudah ada
responnya. Jika ada solute/analat maka pada saat detik itu maka fase geraknya berkurang karena
adanya analat. Nah jadi detektornya merespon dari kurangnya fase geraknya. Kromatogramya
puncaknya jika ada fase geraknya base linenya sudah tinggi sudah ada diatas bukan dibawah.jika ada
solute atau analite makanya puncaknya turun atau kebawah (membaca kromatogramnya terbalik).
Sudah dilengkapi dg alat shg sudah tegak membacanya tdk terbalik lagi.

Slide 33

Detector dulu atau bulk ini semakin kebawah maka semakin tinggi intensitasnya.

Solute lebih sensitive karena ada sedikit saja langsung terbaca, jika bulk harus tinggi solutenya jika
sedikit tidak terdeteksi (kurang sensitive) 100-3000 ppm.

Detektor UV-VIS= menganalisis senyawa dengan ikatan rangkap minimal 1 atau punya cincin
aromatik. Gula tidak bisa dianalisis dgn UV-VIS jika ingin bisa maka perlu di derivatisasi direaksikan
dengan pereaksi DNS sehingga menjadi berwarna merah. Senyawa harus bisa menyerap dipanjang
gelombang UV/Visible

Uv-vis= variable wavelength MWD (dibanyak panjang gelombang dalam satu waktu) bisa secara
simultan. Bisa paling kecil 0,05 ppm/ 50ppb

Uv-VIS= detektor DAD/PDAD (photodiode array) tidak satu2 diset panjang gelombangnya tetapi di
setnya adalah range panjang gelombang dari UV sampai visible. Setiap detik mescaning absorbansi.
Jadi jika selesai kita bisa memanggil kromatogramnya dipanjang gelombang yg kita inginkan
termasuk kita bisa membuat kromatogramnya secara 3D. jadi kromatogramnya hubungannya
dengan waktu retensi, panjang gelombang dan intensitas sinyal. Deetektor uv-vis paling canggih.
Bisa menentukan senyawa diberbagai panjang gelombang, di waktu retensi sekian dan bisa
memastikan senyawa beta karoten yg muncul diwaktu itu apakah benar dengan mengecek di
spektrum uv-visnya jadi bisa mencocokannya spektrum uv-vis dari standar dengan spektrum uv-vis
dengan sampel kita. Bisa 2D/3D. identifikasinya tdk hanya dengan waktu retensi tetapi bisa juga
dengan spektrum uv-vis sehingga keyakinanya lebih tinggi. Lebih sensitif drpd detektor biasa, bisa
menganalisis sampai 5 ppb/ 0,005 ppm bisa sampai heterosiklik amin adalah kontaminan. Jika uv-vis
biasa yaitu satu panjang gelombang hanya sampai 0,1 ppm.

Jiks eletrochemical detektor= biasanya senyawa yg mudah mengion seperti asam organik, asam
amino atau bisa mengalirkan aliran listrik.

Jika flourescence= senyawanya harus bisa ber flourescence, biasanya asam amino karena ada
as.amino yg asamnya sedikit. Jika ingin dianaliss dg flourescence maka harus direaksikan dg pereaksi
OPA yg bisa ber flourescence maka as. Amino akan berikatan dg OPA di bagian N di gugus amino
diujung Nnya. Baru bisa dianaisis dg flourescence detektor. Reaksi as.amino dengan OPA disebut
derivatisasi di HPLC.
Slide 34

Pada 214 nm ini puncaknya tinggi2nya karena ikatan peptida bisa dideteksi di 214 nm semuanya

Tetapi jika 280 nm terdeteksi kecil karena trdpt as.amino yang memiliki gugus aromatik. Hal ini bisa
memprediksi asam amino aromatik apa tidak. Fenil alanin terdeteksi kecil.

Slide 35

Pada UV menggunakan lampu deuteurium (kontinu) pada visible menggunakan lampu

tungsten/wolfram (kontinu).

Slide 36

Hati2 memilih panjang gelombang uv karena pelarut organic memiliki panjang gelombang snediri
atau UV cut offnya sendiri. Jika peptide dianalisis pada panjang gelombang 214 nm, maka jangan
menggunakan etanol yg memiliki UV-cut off 210 nm. Pilihlah pelarut organic yang memiliki UV cut
off yg jauh dr sample yang dianalisis.

Slide 37

Detector refractive indeks= detektoenya sendiri akan merespon pada pelarutnya

Slide 38

Solute property detector= kita bisa aplikasikan HPLC nya dengan system gradien bisa dan juga
isokratik bisa. Gradien= menggunakan fase gerak bertingkat komposisinya setiap waktu

Bulk property detector= hanya bisa satu jenis fase gerak tidak bisa dibuat gradien

Detector yg paling sering digunakan pada analisis adalah UV-VIS, fluorescence dan RI (Refraktor
indeks)

Slide 39

Meningkatkan deteksi bisa menggunakan PITC yang akan menderivat peptida. Dengan mereaksikan
dengan PITC maka pada panjang gelombang 280 semuanya akan terdeteksi dengan puncak yg lebih
tinggi2
Slide 40

Metode primer

Dalam analisis menggunakan HPLC adalah menggunakan reversed phase. Lalu jika tidak terbaca
menggunakan ion lalu pilihan ketiga adalah normal phase. Heksana dan toluene mudah menguap
dan iritan ke pekerjanya ini adalah fase geraknya normal phase.

Pilihan reversed phase adalah jika analat bisa larut dalam fase geraknya.

Jika senyawa mudah mengion seperti asam organic masih bisa menggunakan fase diam C18 dgn fase
gerak air/buffer (ION-Pair). Harus mennggunakan ion-pair reagent didlm fase gerak yg bertujuan
agar senyawa2 bermuatan mjd tidak bermuatan agar bisa dianalisis dengan C18.

Jika tidak berhasil dapat menggunakan normal phase.

Slide 41

Metode sekunder

Menggunakan IEC-HPLC yaitu dengan kolom resin pertukaran ion

Atau menggunakan gel filtrasi atau menggunakan HPLC afinitas

Slide 42

Reversed phase nonpolar

Octadecyl = C18 terdapat nempel di permukaan terluar (nonpolar dan cair)

Octyl = C8

Dimethyl = C2

Normal phase polar

Cyanopropyl=terdapat CN yg berinteraksi dg analat

Aminopropyl= terdapat NH2 yg berinteraksi dg analat

Slide 43

Factor kapasitas= analat muncul di menit berapa dan jika di bagi dengan waktu retensi dr puncak yg
tidak ditahan oleh kolom tuh kira2 Knya itu 5X atau berapa kali. Jangan terlalu panjang maka analisis
terlalu panjang
Slide 44

N=jumlah piringan teoritis. Semakin tinggi N/teoritical number maka semakin bagus maka
puncaknya semakin runcing

Slide 45

Fase gerak komposisinyaberbeda maka pemisahannya juga berbeda. Untyk senyawa2 yg hidrofobik

Slide 46

Lebih hidrofobik maka lebih kebelakang puncaknya

Slide 47

Umumnya C18 biasanya digunakan PH 2-8

Pemekatan harus sampe kering karena jika ingin ditambahkan pelarut fase gerak maka kita atau
volume tepatnya.

GC
Slide 1

Menggunakan fase diam dan gerak. Fase diam bisa berupa padatan dan cairan. Jika menggunakan
ppek kolom/kolom jejal maka yg disebut fase diam padat artinya padatan yg terletak di dlm kolom
dan padatannya tidak dilapisi oleh cairan di permukaan butiran padatannya ex: silika/ arang aktif.
Fase diamnya cairannya menggunakan peak kolom maka cairrannya dilapiskan pada permukaan
padatannya dan dimasukan kedalam kolom. Cairan yg melapisi didinding kolom hanya kolom kapiler.
Kolom kapiler bisa menggunakan fase diam solid dengan cara padatannya dilapisi ke dinding dalam
dr kolom kapiler. Namun ada juga yg memakai fase diam cairan pada kolom kapiler yang akan
melapisi cairan ke permukaan butiran halus seperti silika kemudian baru butiran halus seperti silika
akan ditempelkan ke dinding dalam kolom kapiler. Butiran tersebut sebagai supporting material
(bahan pendukung).

Slide 2

GC dikenal dalam 2 macam yaitu GSC (padatan) dan GLC (liquid). GSC sangat terbatas hanya untuk
mendeteksi komposisi gas ex: gas pada kemasan/kaleng tertentu. Hamper setiap analisis
menggunakan GLC karena lebih powerful dan lebih baik pemisahannya. Lebih banyak dipakai adalah
liquid langsung dilapisi kedalam dinding kolom (liquid coated on the wall). Hal ini karena lebih baik
pemisahannya dan kemungkinan lebih murah.

Perbedaan HPLC dg GC yaitu pada GC menggunakan fase gerak gas. Sistemya berbeda sehingga
senyawa yg dianalisis harus volatile/ mudah menguap. HPLC fase geraknya mempengaruhi
pemisahnnya. GC fase gerak gass hanya sebagai carrier saja yaitu hanya sebgaai gas pembawa yg
akan membawa sampel masuk kedalam kolom dan keluar ke detector dan tidak perlu diganti2.
Syaratnya fase geraknya hanya harus compatible dengan detektornya.
Slide 3

Analisis GC untuk lemak jenus /tidak jenuh (komposisi asam lemak)

Asam lemak, trigliserida, kolesterol/sterol perlu di derivatisasi karena tidak mudah menguap maka
perlu direaksikan agar menjadi volatile. Hasil dr derivatisasi harus stabil dengan suhu yg tinggi yaitu
sekitar 200 derajat. Senyawa yg bisa dianalisis adalah senyawa yg memiliki BM kecil yaitu dibawah
1000.

Alcohol dan senyawa flavour sudah mudah menguap dan stabil pada suhu tinggi yaitu diatas 200 ˚C
tidak terurai.

Senyawa yg dianalsisi dg GC larutan sampel akhir sebelum diinjek disarankan didlm pelarut nonpolar
atau semi polar. Sebab jk dlm pelarut polar maka akan mudah melarutnya senyawa yg banyak sekali
didalam makanan kita sehingga bagian injector akan mudah kotor dengan senyawa2 yg tdk mudah
menguap. Derivatisasi adalah senyawa target saja. Pelarut semi polar ex: dietil eter dan aseton,
nonpolar ex: heksana, heptana, itoluena.

Slide 4

Prinsip analisis GC adalah

-preparasi sampel yang diawali dg tahap ekstraksi yaitu dengan destilasi dan dengan solvent.
Ekstraksi dg pelarut dibagi menjadi 2 yaitu LLE (liquid2 ekstraction) dan SPE (solid phase ekstraction).
SPE mirip dg kromatografi menggunakan fase diam solid dengan menggunakan kolom terbuka yg
biasanya untuk preparasi sampel menggunakan kolom kecil yg panjangnya hanya 10 cm. tahap
homogenisasi ditahap awal sebelum sampel ditimbang. Untuk preparasi sampel yg ingin
dikuantifikasi perlu standar internal (tidak hanyak eksplorasi). Standar internal dipilih dari senyawa
yg tidak terdapat didlm sampel dan harus ditentukan senyawa yg mirip seperti yg ada disampel
tetapi tidak ada didlm sampel. Standar internal harus cocok dan ikut teranalisis dg senyawa yg kita
analisis. Jika sampel di reaksikan maka standar internal juga harus ikut bereaksi hamper sama
mengalami dg sampel. Senyawa flavour menggunakan standar internal 1,4 diklorobenzena, karena
senyawa benzene bayak didlm komponen flavour dan 1,4 dikloro tidak ada disampel. Contoh pada
analisis minyak adalah menggunakan standar internal asam margarat. 1,4diklorobenzena mudah
menguap. Standar internal tergantung dr analatnya. Setelah itu baru di ekstraksi

-isolasi komponen

Setelah diekstraksi dilakukan isolasi komponen. Isolasi komponen adalah di ekstrak lagi misalnya
senyawa flavour yg telah diektraksi dg methanol maka akan diekstrak lg dg senyawa dietil eter.
Methanol dan dietileter tidak bercampur maka hal ini disebut LLE. Isolasi komponen bisa dilakukan
setelah hasil destilasi yg minyak atsiri bercampur dengan air maka di ekstraksi lagi dg dietil eter dan
kemudian dietil eternya diambil

-konsentrasi tahap pemekatan

Pemekatan karena pada GC hanya memerlukan sampel yg sangat sedikit yaitu 1microL atau 2 paling
tinggi. Sampel yg volumenya 1microL maka akan menguap semunaya sehingga cukup untuk kolom
panjangnya 30-60 meter. Pemekatan dilakukan jika sampelnya masih encer atau pelarutnya masih
kebanyakan yg menyebabkan kurang terdeteksi yaitu puncaknya kecil2. Jadi perlu pemekatan
dengan evaporasi dg rotary evaporation atau dengan mendiamkannya didalam ruangan asam yg ada
exhausternya. Hal ini dilakukan jk tdk ingin ada pemanasan, menggunakan rotary evaporator ada
pemanasannya sekitar 40˚C. Pemekatan tidak boleh sampe kering karena senyawa yg telah diisolasi
akan menguap juga bersama dengan pelarut. Senyawa volatile mudah larut dalam pelarut semi polar
atau nonpolar.

-GC analisis

Setelah selesai sampel diperoleh 1ml dan akan diinjeksi sebanyak 1microL. Sebelum diinjeksi
direaksinyan dengan natrium sulfat anhydrous karena sampel tdk boleh mengandung air. Tidak
perlu disaring dengan membrane seperti HPLC karena sudah tidak mengandung partikel.

Slide 5

Preparasi sampel

Sampel dihaluskan dulu baru ditimbang

Perlu diperhtaikan aktifitas enzim, pertumbuuhan mikroba dan reaksi kimia.

Slide 6

Tahap persiapan sampel bisa dengan simple (ektraksi pelarut/destilasi/headspace) atau bisa
kompleks yaitu direaksikan dengan saponifikasi dan metilasi.

Analisis senyawa flavour bertahap ektrasi solvent, LLE, dilanjutkan dengan SPE lalu diinjek

Slide 7

Metode headspace sering digunakna untuk senyawa flavour yg berhubungan dg makanan. Karena
senyawa ini mudah menguap. Bahan yg mudah menguap diudara adalah arang aktif. Yg menguap
adalah senyawa volatile dan air maka akan ikut terserap. Jika ingin diambil senyawanya aromanya
maka perlu dikeringkan dulu hasil penyerapannya pada charcoal kemudian di ektrak dengan heksana
yg banyak dan kemudian dipekatkan.

Bisa menggunakan cryogenic trap yaitu trapnya menggunakan co2 cair tetapi alatnya mahal

Slide 8

Sampel dimasukkan ke wadah tertutup lalu dihembukan udara yg tdk mudah bereaksi dg sampel
seperti gas nitrogen sehingga setiap saat udaranya dr dalam permukaan sampel akan terdorong ke
dlm wadah lain yg berisi watertrap yg mudah menyerap air seperti h2so4 pekat. Flavornya ada
dipermukaan h2so4, udara dipermukaan ini akan ditarik kedalam arang aktif. Aranaag aktif diambil
lalu dilarutkan dg heksana lalu dipekatkan dan diinjeksi ke GC

Slide 9

Teknik headspace bisa dg cara spme (solid phase mikro ektraksion)/ disebut direct methode yg
sudah di set dg GC. Ada juga SPME yg dilaksanakan terpisah kemudian baru nanti dibawa ke GC.
Dengan SPME maka sampel yg diperlukan tidak banyak yaitu paling banyak 30 gram. Bagian yg
menyerap sbg absorben berbentuk seperti rambut yaitu campuran dari carbon dan grafit. Setelah
menyerap beberapa jam, bagian absorbennya dibawa ke injector GC (jika terpisah SPME).

Slide 10

Cara ektraksi dengan destilasi yaitu untuk senyawa yg memiliki banyak senyawa volatile seperti
minyak atsiri. Destilasi memiliki berbagai macam metode seperti
Destilasi uap= steam destilation

Destilasi vakum = destilasi dg bantuan vakum shg titik didihnya menjadi berkurang atau tdk lebih dr
100˚C

Destilasi yg dipandu dg ektrasi langsung (SDE simultan destilation ekstraction). Akan memiliki 2
tabung yg satu untuk sampel dan air yg satunya lagi tempat pelarut yg akan menangkap uap hasil
rebusan dari sampel. Pelarut juga dipanaskan tetapi tidak sepanas sampel. Dipanaskan hingga
mendidih. Pelarut akan menguap dan sampel dan air akan menguap dan bertemu dikondensor.
Nanti akan turun sbg tetesan, pelarut akan masuk ke botol pelarut dan sampel akan masuk ke botol
sampel. Maka yg diambil adalah botol yg bersama pelarut. Maka tidak perlu LLE lagi. Kekurangannya
adalah karena ada tahap perebusan maka kemungkinan sampel akan berubah atau rusak karena
panas.

Ada juga sampel yg basah sehingga hanya didiamkan saja.

Slide 11

Ekstraksi bisa menggunakan methanol, etanol, dan air, lalu dilanjutkan dengan ekstrak dietileter
atau heksana dengan system LLE.

Slide 12 SPE

Maka setelah diekstrak maka dilewatkan dg SPE. SPE semacam kolom terbuka didlmnya ada solid
material yg akan menyerap pigmen2 atau pengotor yg ada dihasil ektraksi. Maka yg lepas senyawa2
kecil senyawa2 molekul kecil yg mudah menguap shg tidak berwarna. Dipakai SPE jk diperlukan.

Slide 12 Derivatisasi

Dilakukan jika senyawa yg diektrak tdk bersifat volatile seperti minyak. Diderivatisasi atau
direaksikan tergantung dr senyawanya apa. Misalnya pada gula, sterol, dan asam amino biasanya
akan di sililasi. Sililasi adalah direaksikan dg reagen yang ada silannya seperti BSTFA, BSA, dll
menjadikan senyawa silil yg mudah menguap, glukosa terikat dg silil. Untuk senyawa asam lemak yg
memiliki gugus asam karboksilat bisa diesterifikasi atau di metilasi. Asam amino juga bisa di
esterifikasi dengan BF3 metanol menjadi ester metilnya. Trigliserida, wax ester, fofolipid juga bisa
tetapi harus diputus dulu ikatan esternya baru direaksikan dengan BF3 metanol. Sodium methoxide
lebih murah daripada BF3 metanol, bisa berlangsung pada suhu ruang tdk perlu dipanaskan, dan bisa
bereaksi dg ester. Sodium methoxide hanya bereaksi dengan ester tidak degan asam karboksilat
bebas. Jadi jk ingin menggunakan sodium ini sampel harus dlm bentuk esternya, jadi seperti
trigliserida, wax ester, fosfolipid, dan kolesterol ester bisa langsung di reaksikan. Tetapi jika
meggunakan sodium ini tidak bisa menggunakan standar internal asam margarat, karena asam
margarat asam karboksilatnya bebas maka tidak bereaksi dg sodium mjd ester metil. Jadi sodium ini
hanya bereaksi mjd ester metil asam lemak kalo dg senyawa ester.

Kemarin menggunakan BF3 metanol karena dpt bereaksi dg asam akrboksilat bebas, harus
diperhatikan reaksi derivatisasi. Terkadang kita tdk bisa melakukan analisis senyawa tertentu dg GC
walaupun BMnya kecil/kurang dr 1000 yg tdk mudah menguap, karena kita tidak tau senyawa apa yg
cocok untuk mederivatisasi menjadikan senyawa volatile sehingga tidak bisa di analisis.

Pereaksi sililasi sering dipilih untuk senyawa yg belum diketahui pereaksi derivatisasinya untuk
menjadikannya volatile.

Senyawa alkoholik dan penolik dengan pereaksi asetik anhydride/pyridine

Senyawa polar seperti akrilamida dan monokloropropandiol meskipun tdk mudah menguap, maka
perlu diderivatisasi dg alkylboronic acid.

Slide 13

Bagian GC

- Gas supply dan regulator sebagai fase gerak atau carrier gas
- Injeksi port
- Oven
- Kolom, kolom akan berada di dlm oven
- Detector FID tdk hanya fase gerak gas tabungnya, tapi ada juga tabung untuk menyala api
didkt detektornya yaitu tabung berisi 02 dan N2

Slide 14

Supply gas system tergantung dr detektornya. FID menggunakan fase gerak helium, argon yg
merupakan gas mulia. Detector FID juga bisa menggunakann nitrogen.

FPD mirip FID, tetapi FPD ada flame dan ionisasinya dibantu dengan cahaya atau UV. FPD tidak
menggunakan argon

ECD untuk senyawa memiliki ke elektrogenatifan didlm strukturnya yg tinggi seperti senyawa
pestisida ex: organoklorin bisa menggunakan argon+ metana 5%.

Detector yg paling general ada 2 TCD dg FID. TCD bisa digunakan untuk analisis senyawa organic dan
anorganik (gas Co2, N2) biasanya menggunakan kolom GSC. FID hanya untuk senyawa2 hidrokarbon
senyawa anorganik tidak terdeteksi.

Antosianin harus diderivatisasi terlebih dahulu.

FPD dan ECD harus punya atom tertentu

Slide 15

Sebagai carrier gas menggunakan laju alir gas 1-25mL/min. kemaren menggunakan helium di 1-
25mL/min dan juga nitrogen di atas 1-25 mL/min. nitrogen berfungsi sbg make up gas yg akan
medorong gas helium mjd cepat masuk ke kolom. Untuk fase gerak gas u/k mendapatkan puncak
deteksi tinggi menggunakan gas hydrogen, tapi gas ini mudah berekasi dg oksigen sehingga akan
mudah meledak gas hydrogen mudah membentuk artefact hidrogenasi pd senyawa asam lemak dan
flavour

Slide 16

Injector harus syringe harus tajam berbeda dg HPLC yg tumpul. Hal ini karena harus menembus
septum yg berupa seal karet shg sampel yg jumlahnya 1 mivroL, masuk kedalam injector sudah
dilengkapi dg heated blok/blok pemanas. Begitu masuk ke injector maka gas tidak akan keluar lagi
karena ada septumnya. HPLC tidak perlu syringe runcing karena untuk memuat sampel saja

Slide 17

Injection port suhunya harus diatas 100˚C diatur paling rendah sm dengan suhu analisis atau suhu
sm dgn kolom paling tinggi sehingga semua sampel menguap dan tidak tertinggal di injector. Pada
syringe injector hanya 1-3 microL. Injector berbeda dlm sampel berbentuk gas, syringe ada 2 macam
yaitu larutannya liquid dan sampel dalam bentuk gas seperti pada sampel gas kemasan tertentu
sampel gas bisa diambil dg syringe. Syringe yg digunakan u/k mengambil sampel gas ini adalah gas
tight syringe khusus. Syringe ini memiliki volume besar yg bisa digenggam. Berbeda dg syringe liquid
yg lebih kecil. Menganalisis komposisi gas ex: CO2 dr minuman karbonasi harus menggunakan
detector TCD. Jika ingin mengambil gas CO2 pd headspace kemasan maka menggunakan gas tight
syringe. Menggunakan kolom GSC, detector TCD untuk sampel gas. Analisis pangan umumnya
sampelnya liquid.

Volume injeksi 1-3microL dalam larutan. Jika gas bisa sampe 10-30 mL.

Slide 18

System injector berada didlm blok metal yg dipanaskan pada suhu 100˚C. jika suhu injeksi 170 ˚C
maka suhu kolom yg paling tinggi adalah 170 ˚C. Didalam injector ada glass liner mudah sekali kotor
bila larutan berisi senyawa2 yg tdk mudah menguap seperti jika kita menggunakan pelarut yg lebih
polar. Senyawa2 ini akan tertinggal di glas liner dan mengotorinya maka lama2 akan tersumbat dan
kalau kita melakukan analisis tidak keluar kromatogramnya harus di ganti. Bagian dalam glass liner
merypakan tmpt vaporisasi sampel sehingga berubah mjd gas lalu didorong oleh carries gas untuk
msk ke dalam kolom. Skema gas kromatografi carrier membawa sampel masuk ke dalam colom lalu
keluar ke detector dan dibaca oleh personal computer.

Slide 19

System injeksi modenya dr awal sudah diatur. Modenya adalah split atau splitless. Biasanya
menggunakan mode splitless yaitu semua sampel maksuk ke dlm injeksi, tetapi jika puncaknya
tinggi2 shg overload sehingga beberapa puncak tergabung, maka perlu di injek lg dg mode split. Split
kalo konsentrasi senyawa didlm 1 microL lebih dari 50nanogram. Jika splitless kurang dr 50
nanogram per 1 microL. Jika sampel terlalu pekat tdk perlu dilakukan pengenceran bisa
menggunakan mode split saja, missal ingin diencerkan 10X maka tinggal mengatur split 10:90. Nanti
10% masuk kedalam kolom dan 90%nya dibuang. Split dan splitless injektornya dipanaskan. Splitless
kolomnya bisa dimulai pada suhu 60-90˚C, kalo split kolom bisa dimulai dg suhu dingin atau panas, jk
panas dimulai dr 150 ˚C. injeksi dengan cold on-colom jika konsentrasi senyawanya kurang dr 100
nanogram, dan tipenya adalah non-vaporizing menggunakan on-coloum syringe (ini jarang
digunakan). Mode PVT (programmable temperature vaporization) biasnya diindustri flavour dan
petrokimia (pestisida). Injektornya bisa diprogram suhunya dan bisa dibuat gradien. Bisa dibuat suhu
injektornya naik bertahap shg sampel akan berubah menjadi gas secara bertahap sehingga hasilnya
lebih baik dan akurat dan juga bisa diatur split atau splitlessnya. Jika ingin menggunakan PTV harus
ada settingan software sendiri.

Slide 20

Biasanya injector diatur suhunya lebih tinggi dr suhu kolom yg paling tinggi, biasaya lebih 20 ˚C.
paling besar perbedaan suhunya adalah 50 ˚C.

Slide 21

Kolom u/k gas kromatografi ada didalamnya packing materialnnya fase diemnya bisa solid dan liquid.
Dua2nya sama pada kolom kapiler dan packed kolom bisa solid dan liquid.

Slide 22

u/k kapiler kolom bisa WCOT, PLOT, SCOT.

WCOT= fase diam liquid dicoating diatas dinding kolom kapiler dibagian dalam
PLOT= fase diam padat seperti silika atau material polosnya dilapiskan dibagian dinding dalam
kapiler. Fase diamnya padat.

SCOT= fase diam cair dilapiskan dipermukaan butiran, butiran sbg supporting material, lalu
butirannya dilapiskan dipermukaan dinding bagian dalam.

WCOT= paling banyak digunakan u/k analisis pangan karena stabil pada suhu panas atau tetep utuh
senyawanya

Slide 23

Analisis gas, packed kolom memilikipanjang 1-2 meter dan diameternya 2-4mm terbiuat dr glass
atau stainless steal. Kolomnya terlihat pendek karena berbentuknya spiral. Jarang dipake karena
untuk analaisis komposisi gas [pada kemasan atau udara.

Paling sering menggunakan kapiler kolom yaitu sampel pada larutan liquid semi-polar atau nonpolar.

Slide 24

Film thickness= lapisan fase diamnya

Praktikum menggunakan open turbular yaitu untuk kolom kapiler

Slide 25

90% lebih analisis pangan menggunakan liquid kolom

Slide 26

Arang aktif anorganik

Slide 27

Organic= polimer yg poros

Slide 28

DB23 setara dengan SP-23 adalah kolom yang semi polar. Kolom semi polar ini memisahkan senyawa
bukan hanya berdasarkan perbedaan volatilitas tetapi juga perbedaan polaritasnya. Kolom wax
adalah kolom polar dan digunakan u/k senyawa polar. Kolom polar juga berdasarkan perbedaan
volatilitas tetapi juga perbedaan polaritasnya.

Slide 29

Detector MS merupakan general detector. Bisa digunakan untuk HPLC atau GC.

Detektor dibawah ini hanya u/k GC tdk bisa u/k HPLC.

Detektor paling universal adalah TCD yaitu anorganik daan organik. Tetapi jika kadar sgt kecil tdk
bisa di deteksi, seperti mendeteksi alkohol/etanol pada minuman yg tdk beralkohol maka sulit. Bisa
menganalisis karbon dioksida pada minuman karbonasi

FID cukup sensitif dan bisa dideteksi kurang dr 1 ppm. Tetapi sampelnya dpt mengalami destruksi
atau kerusakan shg tdk bisa digunakan lagi.

ECD sensitifitasnya bisa sampe ppb. Kekurangannya hanya analisis senyawa yg memiliki atom dg
elektrogenatifannya yg tinggi seperti senyawa yg memiliki atom oksigen dlm jmlh yg banyak.
FPD dibantu ionisasinya dg sinar UV. Khusus dg ssenyawa2 yg memiliki sulfur dan fosfor.

PID menggunakan u/k industri flavor yg banyak mengandung gugus aromatik. Tdk menggunakan
nyala api hanya menggunakan sinar UV saja.

ELCD untuk senyawa pestisida, nitrosamin (jarang dipake)

NPD untuk industri petrokimia. Untuk pupuk yg memiliki atom nitrogen dan atom fosfor. Untuk
senyawa flavor dr hasil maillard karena mengandung atom N

Slide 30

Organoklorin dan organofosfor menggunakan GC

Karbamat dan piretroid dg HPLC

Mendeteksi Organoklorin dan organofosfor menggunakan GC detector FPD dan ECD lebih sensitive
karena sampe ppb.

Slide 31

FID sampel akan di ionisasi mjd positif dan negative. Negatifnya electron dan positifnya adalah
sampel, kemudian eletron gterluarnya akan keluar dan msk ke elektroda lalu memberikan arus listrik

ECD terdapat blok radioaktif yiatu nikel 62. Sama menjadi ion tetapi electron yg negative, lalu
elektri2 kulit terluar yg terbentuk lebih banyak shg lebih muda dideteksi dan tdk ada nyala api.

Slide 32

FPD ada nyala api kemudian photometricnya dibandu dg cahaya

PID ada lampu UV yg membantu ionisasi.

Slide 33

Mempengaruhi pemisahan

-diameter kolom kapiler, semkain kecil diameter kolom maka pemisahan smakin bagus jadi artinya
efisiensi kolom semakin tinggi. Puncaknya akan lebih terpisah. Jk menggunakan kolom 60 m dengan
diameter 0,25mm maka dpt memisahkan cis dan trans pd sampel.

-lapisan fase diam yg lebih tipis lebih baik pemisahannya drpd yg tebal. Karena lebih tipis permukaan
didlm kolom yg bisa dikenai oleh senytawa lebih luas

- u/k memisahkan 2 senyawa menggunakan gradien suhu pada kolomnya. u/k memisahkan 2
senyawa maka gradien suhunya harus di rendahkan shg lebih teroisah antara 2 puncaknya.
MS
Slide 1

Ms bisa ditendem dengan atomic spektroskopi yg paling maju. MS yg ditendem dg atomic

spektroskopi berbeda dg yg ditendem pd GC dan HPLC yaitu pembacaan ion2nya berbeda, meskipun
sistemnya sama dg kondisi vakum dan bagian2nya sama.

Slide 2

Yg berbeda dr HPLC dan GC adalah ionizernya. Input pd HPLC adalah liquid sdngkn GC adalah gas
sehingga ionizernya berbeda tapi analayzer sama.

Slide 3

ICP MS= ion anorganik dan organic

GC dan HPLC MS= MSnya di set u/k mendeteksi ion2 senyawa organic.

MS terdiri dr ionization, analyser dan detector. Ketiganya pada GC pada kondisi vakum yg cukup
rendah (ultra low vacuum).

LC-MS ion source masih tekanan atmosfer, tapi ketika mulai interface sampe deteksi menggunakan
ultra low vacuum.

Ion source pada LC-MS/ LC-MS-MS ionizernya bisa ESI (eletrosprayionization), kalo di GC disebut EI
(electron ionization). LC-MS menggunnakan APCI (atmospheric pressure chemical ionization), kalo di
GC hanya CI (chemical ionization). LC MS lebih banyak pilihan ionizernya drpd GC MS. Seperti
terdapat juga APPI (atmospheric pressure photometric ionization), jadi ionisasinya dibantu dg sinar
UV dan jk di GC MS tidak ada. Di LC-MS juga ada yg menggunakan laser yg disebut MALDI yaitu
ionizernya.

Slide 4

• Prinsip umum: sebuah molekul (dari fraksi murni senyawa target) dibombardir oleh elektron beam
(aliran elektron) shg menjadi ion negative/positif yang mempunyai energi yang mampu memecah
molekul tersebut menjadi fragment-fragment ionnya.

Apabila banyak mengandung oksigen/ chlor digunakan negative mode shg banyak yg teranalisis. Jika
senyawa relatifnya tdk banyak oksigen/chlor menggunakan positif mode.

Ion molekulnya besar yaitu BMnya besar maka ion molekulnya lebih mdh difragmentasi/ dipecah
mjd framen ionnya, shg yg mucul dipaling kanan di MS yg terdeteksinya kecil/tinggi ion molekulnya
kecil sekali sekitar 5%. Ion fragmennya yg terbentuk banyak shg dapat mencapai 100%. Jika BMnya
besar maka seluruh ion molekulnya akan terfragmentasi/ terpecah oleh bombardirnya elektrion mjd
fragmen2 positifnya. Molekulnya sama maka fragmentnya sama. Fragment yg terbentuk akan mjd
fingerprint (sidik jari) spektrum massa ionnya. Ion2nya akan digambarkjan dlm spektrum masaanya
menjadi m/z (massa ionberbanding muatannya)

Muatan ion bisa +1-+4 lebih dr 1 +nya, tetapi jika menggunakan GC MS maka massa ionnya
umumnya hanya +1. HPLC MS/LC-MS tergantung dari instrumennya apabila soft ionization atau hard
ionization (arus elektron). Jk di hard ionization akan banyak terbentuk fragment ion, kalo di soft
ionization fragment ionnya yg terbentuk lebih sedikit lebih banyak ion molekul. Pada LC-MS u/k
analisis sentyawa kecil/ metabolit umumnya terbentuk adalah ion 1+, tp kalo analisinya molekul
besar seperti peptide ion yg terbentuk umumnya +2-+4 muatannya cukup besar. Yg tampil di MS sdh
dlm bentuk m/z. jika diketahui ion molekulnya 250 dg muatannya +4 , maka kita bisa mengetahui
massa dr ion tadi adalah 1000 karena m/znya adalah 250 dan z nya +4 maka massa ionnya adalah
1000. Maka 1000 itulah BM dr senyawa yg dianalisi.

Ion-ion/partikel bermuatan dipaksa melewati medan magnet (analyser) dengan kondisi vakum
sehingga terbagi-bagi sesuai dengan m/z (massa partikel dibagi muatannya).

Karena ion-ion yang dihasilkan mempunyai satu buah muatan positif, maka nilai m/z sama dengan
berat molekul ion/fragment tersebut.

Slide 5

Inputnya senyawa liquid lalu di evaporasi mjd dlm bentuk solid. Lallu ada electron beam yg akan
membombardir snyw mjd ion positif dg fragmen2nya yg bermuatan ppsitif. Lalu dipaksa msk ke dlm
medan magnet menggunakan analyser magnet field dan analyzernya jg ada magnet dgn kondisi
vakum msk ke medan magneitnya. Kondisi vakum maka ion yg mudah melayang2 shg sampai ke
detector ionnya. Ion yg ringan akan diarahkan kesebelah kiri yg berat akan kekanan.

Analyser juga bisa terbentuk dari tabung yg panjang tdk ada magnet sepanjang 2meter, disebut
analyser time of flight. Analyser bergantung pd waktu ionnya sampai ke detector, ion yg kecil akan
lebih cepat dan yg besar akan lebih lama. Semakin panjang tabungnya senkain bagus, akurat, dan
sensitive.

Analyser tipenya sama seperti TOF dan magnetic field dan detektornya bisa digunakan di HPLC dan
GC yg membedakan hanya penggunaan ionisation sourcenya.

Perbedaan GC dan HPLC pada MS

Tekanannya berbeda HPLC menggunakan ionisation sourcenya athmosphere pressure, GC ionisation

sourcenya sampe detector adalah vakum

Sampel yg masuk berbeda HPLC liquid GC gas

Slide 6

Ionisation methods include the following:

LC-MS: Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)

Electrospray Ionisation (ESI)

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI). Lebih banyak dipakai u/k senyawa protein atau
polipeptida karena BMnya besar, menggunakan laser dan matriks.

Semuanya di LC-MS menggunakan atmospheric pressure. Paling banyak digunakan adalah ESI mirip
dengan EI dan APCI mirip CI

GC-MS: Chemical Ionization (CI)

Electron Impact (EI) atau Electron Ionization (EI)

Slide 7

Pada MS analyzernya bisa digabung yaitu lebih dr satu yaitu minimal 2 maka disebut double MS

Quadrupole mass filter

Time of flight (TOF)

Magnetic sectors

Quadrupole ion trap

Orbitrap= cukup sensitive dan bisa digunakan u/k targeted dan untargeted bisa juga u/k kualitatif
dan kuantitatif (bisa menggunakan analisis peptisida, antibiotic, metabolomic) bisa sampai ppb/ppt

Tandem MS-MS applies 2, 3 or 4 analysers, most popular:

Triple quadrupole (TQ)

Quadrupole - Ion Trap (QTRAP)

Quadrupole-time of flight (QTOF)

Quadrupole - Orbitrap (Q-Orbitrap)

Slide 8

Detector include the following: - Photo multiplier - Electron multiplier - Micro-channel plate

Bisa digunakan untuk semua alatnya, tidak perlu digabung hanya pake 1 saja.

Yg mempengaruhi hasil analisis adalah ionizer dan mass analyser

Slide 9

GC MS/LC MS ini umumnya menghasilkan ion yang muatannya 1. Maka jika positif mode maka
menghasilkan ion molekul dg muatan 1+ atau menghasilkan fragmen2 dr ion molekul dg muatan 1+.

Yang negative sama seperti yg positif.

Memudahkan kita u/k fingerprint

Mode ionisasi dr awal diatur

Slide 10

Mass spektra khas pada tiap senyawa. Semakin kekanan ion semakin berat, ion kanan merupakan
ion molekul. Puncak2nya menunjukkan adanya ion positif. Selisih dr puncak ion satu dg lainnya
misalnya 113 ke 142 maka selisihnya dalah 29, mass loss 29 setara dg kehilangan CH2 CH3. Ion
molekul akan pecah selalu pecah pertama pecah carbonnya 2. Jadi CH2 CH3, jika ditotal 29.
Pecahannya tdk bermuatan dan sisanya bermuatan. Selisih 14 maka CH2.

Slide 11

Ion molekul berupa radikal kation karena kehilangan 1 elektron. Ion molekul besar mudah terpecah
mjd fragment2 ion/ kalo ionisasinya berlaku dgn arus electron yg cukup tinggi disebut hard ionisasi.
Ion molekulnya lebih mudah terpecah mjd ion fragment. Fragment ion adalah ion2 yg muatannya
positif yg sdh tentu massa ionnya lebih kecil dr ion molekul. Ion molekul bisa disebut dg parent ion
atau ion induk. Lalu ion fragmennya sbg daughter ion untuk pecahannya. Precursor ion belum tentu
ion molekul, tapi kl parent ion yg dimaksut adalah ion molekul.

Slide 12

Hasil GC MS bisa kromatogram dan mass spectra (sidik jari). Masing2 puncak akan memiliki mass
spectranya yg bisa di print.

Slide 13

Fragmentasi yg hasilnya positif akan masuk kedalam analyser yg akan dipisahkan brdskan massa ion
yg kecil dg massa ion yg berat.

Slide 14

EI untuk hard ionisation. Ionisationnya cukup kuat shg byk terbentuk fragment ion dibandingkan ion
molekul jadi ion molekulnya tinggal sedikit saja.

CI u/k soft ionisation. Lebih banyak ion molekulnya. Sedangkan ion molekul yg terfragmentasi
sedikit.

Slide 15

System EI menerapkan 70 elektron Volt. Jika lebih tinggi dr 70eV maka trellau banyak ion yg
terfragmentasi, ion molekul sama seklai tdk muncul. Jika ion molekul sm seklai tdk muncuk maka kita
kehilanagan 1 informasi mengenai BM. Jika terlalu rendah yaitu kurtang dr 70eV maka sedikit sekali
ion fragmennya yg terbentuk, jika sgt sedikit yg terbentuk maka sulit mengidentifikasi & sulit
melakukan fingerprint. Fingerprint semakin baik jg banyak ion fragmentasinya. EI tdk boleh ada air

Slide 16

EI aka nada arus electron yg akan mengalir dr eletroda negative ke elektroda positif. Dari anoda ke
katoda.

Slide 17

CI= nanti ada tambahan, karen tdk dg electron tetapi dg tambahan gas sbg chemical reaction.
Molekuylnya akan di tabrakan oleh snyw lain berupa gas seperti gas metana yg akan ditabrak shg
mjd molekuler ion. CI harus dilengkapi dg tabung lain yg bkn fase gerak yg langsung dihubungkan ke
detector MS. CI boleh ada air

Chemical ionization mevhanisms

Charge exchange (helium as reagent)

Acid/base (methane as reagent)

Acid/base (water as reagent)

Alkyl addition C

Slide 18

EI bisa mendapatkan 2 informasi yaitu ion molekul (memberikan informasi tentang BM) yg paling
kanan dan ion fragmennta yg bisa sbg sidik jari atau penanda identifikasi ini molekul apa. Jadi bisa
menentukan struktur senyawanya.
CI kita tdk bisa melakukan fingerprint karena hanya ada ion molekul dan ion fragmentnya hanya ada
1. Kita bisa menentukan BM dr ion molekul yg terdeteksi dg keyakinan yg tinggi. Pada EI karena ion
molekulnya terlalu kecil atau tidak muncul atau bisa jadi itu adalah ion fragment, pada CI ion
molekulnya besar.

Slide 19

Mass range artinya hanya ion yg ada pada kisarannya yg ada pada mass spektranya. Dibawah atau
lebih tinggi tdk akan tampak di mass spektra yg diset diawal sblm di injeksi

Slide 20

Quadrupole terdiri sari 4 batangan. Sisi atas dan bawah akan menyaring ion yg terlalu kecil <10-40.
Kanan dan kiri akan menyaring ion yg besar yaitu lebih dari 400-800. Yang sampai ke detektornya
hanya mass ionnya yg diset sesuai kemauan kita.

Slide 21

MS mengikuti sifat fisik senyawanya, tidak akan mjd sembarang.

Massa ionnya khas pada tiap senyawa sehingga menjadi ciri khasnya.

Slide 22

Senyawa halide (atom chlor, brom, seng) atom halogen bisa menjadi penanda.

Carbon 13 dialam atau tubuh kita abundancenya (kelimpahannya) hanya 1% saja dr 100% karbon 12
ini.

Chlor isotopnya ada 37 bukan 35 (normal). Dialam isotop 37 itu hanya ada 1/3 dari chlore 35.

Brom kelimphannya 100%, isotop 81 yg normal 79. Isotop 81 terdapat hamper 100% dr Brom 79.

Slide 23

Mass spectra u/k senyawa yg mengandung Cl ada ion molekul yg paling kanan yaitu 78. Ion molekul
78 ada isotopnya 80 dg ketinggian 1/3. Ion molekul ini mjd ion yg lain lagi mjd fragment ion
kehilangan 15 yatu CH3, tp msh ada ion isotop 65. Nai ini ciri jk ion isotopnya msh mengandung Cl di
65 dan 63, lalu di 78 dan 80 pasti ada Clnya nempel. Lalu ada ion di 43 yg kehilangan 35 dari 78,
maka Clnya akan lepas, karena tdk ada ion isotop. Garis 1 dikanan 43 yg ketinggiannya sama ketika
kita punya 3 Carbon, carbonnya dikali dg kelimpahannya 1% jd 3%. Jadi tinggi dr isotop adalah isotop
dr 43 yg carbonnya 13 tapi kelimpahannya tinggal 3 dikali 1% mjd 3%.

Slide 24

TQ ini sangat sensitive dan baik untuk analisis kuantitatif bisa sampe ppb, bisa digunakan untuk
menganalisis residu senyawa peptisida bisa juga sampe ppt.

QTRAP, TQ sensitive u/k analisis kuantitatif bisa sampe ppb

QTOF kurang sensitive shg kurang baik digunakan u/k analisis kualitatif.

Kualitatif bisa u/k mengidentifikasi senyawa yg tdk diketahui, profiling (QTOF)

Kuantitatifnya
Peptisida menggunakan GC-MS-MS menggunakan 2 MS karna banyak senyawanya yg mirip2 kalo 1
tidak bisa membedakan senyawa yg mirip.

Slide 25

HPLC-MS

Kualitatif u/k mengetahui BM dan menentukan profile HPLC, metobolik dan authenthic

Kuantitatif u/k menentukan kadar sampel

The ionisation methods used for the majority of HPLC-MS are

1. Electrospray Ionisation (ESI) → also Atmosp.Press.

2. Atmospheric Pressure CI (APCI)

3. Atmospheric Pressure Photo Ionization (APPI)

4. Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) → also Atmosp.Press.

Keempatnya merupakan soft ionisation. Hard ionisation baru muncul 10 tahun terakhir ini. Hard
ionisation bisa digunakan u/k metabolomic, targeted analisis u/k mengetahui target. Banyak
digunakan adalah ESI dan MALDI pada lab yg menganalisis kualitatif. APCI dg ESI atau ESI dg APPI
digunakan untuk kuantitatif. Soft ionisasi bisa digabung ionizernya jk hard tidak bisa digabung. Hard
ionisasion menggunakan ESI. ESI bisa soft dan hard.

Soft ionisation hanya 1 ion molekul yg paling tinggi. Hanya untuk mengetahui BM saja bukan
fingerprint. (untuk LC MS MS)

➢ ESI for analysis molecules MW 100 Da to more than 200,000 Da

➢ APCI for analysis less polar mol. MW<100 Da to 2000 Da

MALDI for analysis molecules MW 1000 Da up to around 40,000 Da

Slide 26

LC MS MS ion molekulnya bisa M+, M+H+, M+Na+. umumnya M+H+, jk ada M+Na+ maka kemasukan
Na dr wadah atau cube yg digunakan. Bisa juga M+ multiple

Slide 27

Skema ESI

Liquid-drying gas yg membuat liquid menguap-sehingga tinggal solid2 dr larutan sampel-dibombardir

oleh electron membentuk ion-masuk ke analyser.

Slide 28

MALDI menggunakan analat molekulnya besar diatas 1000. Matriksnya kecil dan lebih banyak dr
analatnya. Ada laser yg membuat perubahan menjadi ion +/- terganting mode dan masuk ke
detector. Menggunakan MALDI ini senyawanya harus diisolasi sendiri dg HPLC baru dibawa ke
MALDI isolatnya. 10 microL Cairan dr HPLC dicampur dg matriks yg akan membentuk luasan
tertentu. Lalu ditembak laser yg akan membentuk ion2 dipermukaannya. TOF ini merupakan tabung
dg ruang hampa dalam keadaan vakum shg ion2 akan melayang2.
MALDI-TOF ionisasinya dg MALDI analyzernya dg TOF u/k analisis kualitatif.

MALDI TOF bisa menentukan sequence dr senyawa yg diuji

Slide 29

ESI-MS lebih teliti drpd APCI-MS dan APPI-MS. Tetapi u/k senyawa yg lebih kecil atau kurang dr 100
APCI-MS lebih sensitive dr ESI-MS.

Slide 30

ESI bisa untuk hard ionisation.

Penggunaan mode +/- tergantung dr trial and eror jk pada + tidak ada puncak2nya maka
menggunakan – modenya. Jika keduanya puncaknya kecil maka kemungkinan sampelnya kurang
pekat.

Slide 31

MS Quantitation 1. TIC = Total Ion Current

2. SIM = Selected Ion Monitoring

3. MRM = Multiple Reaction Monitoring = SRM = Selected Reaction Monitoring (only for LCMS-MS or
GC-MS-MS)

Jika kepekatan maka hasil TICnya bisa overload karena semua ion pada waktu tertentu akan terbaca
sbg puncak.

SIM= khusus untuk single MS ini aka nada puncak m/z pada 170 saja yg cukup tinggi. Ex: asam lemak.
m/z 170 artinya melakukan kuantifikasinya mode SIM menggunakan kuantitatif ion m/z 170

SRM= double MS mengatur m/znya 2 lebih dr satu. base peak di Ion 170 m/z maka akan di select
untuk dimasukkan ke analyser ke dua sebelum msk akan di ionisasi kembali yaitu dg dibombardir
(arus electron)