Reaksi Identifikasi Lipid

1. Uji Kelarutan Lipid

Uji ini terdiri atas analisis kelarutan lipid maupun derivat lipid terdahadap berbagai macam pelarut.
Dalam uji ini, kelarutan lipid ditentukan oleh sifat kepolaran pelarut. Apabila lipid dilarutkan ke dalam
pelarut polar maka hasilnya lipid tersbut tidak akan larut. Hal tersebut karena lipid memiliki sifat
nonpolar sehingga hanya akan larut pada pelarut yang sama-sama nonpolar.

2. Uji Acrolein

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji akrolein. Dalam uji ini terjadi dehidrasi gliserol dalam bentuk
bebas atau dalam lemak/minyak menghasilkan aldehid akrilat atau akrolein. Uji akrolein digunakan
untuk menguji keberadaan gliserin atau lemak. Ketika lemak dipanaskan setelah ditambahkan agen
pendehidrasi (KHSO4) yang akan menarik air, maka bagian gliserol akan terdehidrasi ke dalam bentuk
aldehid tidak jenuh atau dikenal sebagai akrolein (CH2=CHCHO) yang memiliki bau seperti lemak
terbakar dan ditandai dengan asap putih.

3. Uji Kejenuhan pada Lipid

Uji kejenuhan digunakan untuk mengetahui asam lemak yang diuji apakah termasuk asam
lemak jenuh atau tidak jenuh dengan menggunakan pereaksi Iod Hubl. Iod Hubl ini digunakan sebagai
indikator perubahan. Asam lemak yang diuji ditambah kloroform sama banyaknya. Tabung dikocok
sampai bahan larut. Setelah itu, tetes demi tetes pereaksi Iod Hubl dimasukkan ke dalam tabung sambil
dikocokdan perubahan warna yang terjadi terhadap campuran diamati. Asam lemak jenuh dapat
dibedakan dari asam lemak tidak jenuh dengan cara melihat strukturnya. Asam lemak tidak jenuh
memiliki ikatan ganda pada gugus hidrokarbonnya. Reaksi positif ketidakjenuhan asam lemak ditandai
dengan timbulnya warna merah asam lemak, lalu warna kembali lagi ke warna awal kuning bening.
Warna merah yang kembali pudar menandakan bahwa terdapat banyak ikatan rangkap pada rantai
hidrokarbon asam lemak.

Trigliserida yang mengandung asam lemak yang mempunyai ikatan rangkap dapat diadisi oleh
golongan halogen. Pada uji ketidakjenuhan, pereaksi iod huble akan mengoksidasi asam lemak yang
mempunyai ikatan rangkap pada molekulnya menjadi berikatan tunggal. Warna merah muda yang
hilang selama reaksi menunjukkan bahwa asam lemak tak jenuh telah mereduksi pereaksi iod huble.

4. Uji ketengikan

Uji kualitatif lipid lainnya adalah uji ketengikan. Dalam uji ini, diidentifikasi lipid mana yang sudah
tengik dengan yang belum tengik yang disebabkan oleh oksidasi lipid. Minyak yang akan diuji
dicampurkan dengan HCl. Selanjutnya, sebuah kertas saring dicelupkan ke larutan floroglusinol.
Floroglusinol ini berfungsi sebagai penampak bercak. Setelah itu, kertas digantungkan di dalam
erlenmeyer yang berisi minyak yang diuji. Serbuk CaCO3 dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan segera
ditutup. HCl yang ditambahkan akan menyumbangkan ion-ion hidrogennya yang dapat memecah unsur
lemak sehingga terbentuk lemak radikal bebas dan hidrogen radikal bebas. Kedua bentuk radikal ini
bersifat sangat reaktif dan pada tahap akhir oksidasi akan dihasilkan peroksida (Syamsu 2007).

5. Uji Salkowski untuk Kolesterol

Uji Salkowski merupakan uji kualitatif yang dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan kolesterol.
Kolesterol dilarutkan dengan kloroform anhidrat lalu dengan volume yang sama ditambahkan asam
sulfat. Asam sulfat berfungsi sebagai pemutus ikatan ester lipid. Apabila dalam sampel tersebut terdapat
kolesterol, maka lapisan kolesterol di bagian atas menjadi berwarna merah dan asam sulfat terlihat
berubah menjadi kuning dengan warna fluoresens hijau.

6. Uji Lieberman Burchard

Uji Lieberman Buchard merupakan uji kuantitatif untuk kolesterol. Prinsip uji ini adalah
mengidentifikasi adanya kolesterol dengan penambahan asam sulfat ke dalam campuran. Sebanyak 10
tetes asam asetat dilarutkan ke dalam larutan kolesterol dan kloroform (dari percobaan Salkowski).
Setelah itu, asam sulfat pekat ditambahkan. Tabung dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit.
Mekanisme yang terjadi dalam uji ini adalah ketika asam sulfat ditambahkan ke dalam campuran yang
berisi kolesterol, maka molekul air berpindah dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian teroksidasi
membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang mengandung kromofor yang
menghasilkan warna hijau. Warna hijau ini menandakan hasil yang positif (WikiAnswers 2008). Reaksi
positif uji ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi
biru-ungu dan akhirnya menjadi hijau tua.

7. Uji Bilangan Iod

Lipid mengandung bermacam-macam asam lemak tak jenuh yang bereaksi dengan ion. Jumlah iod
yang diabsorpsi menetukan jumlah ketidak jenuhan dalam lipid. Jadi angka iod didefinisikan sebagai
berikut: banyaknya gram iod diabsorpsi oleh 100 gr lipid. Dua metode yang umumnya dipakai yaitu:
metode Hanus yang memakai iodin bromida sebagai carrier dan metode Wijs yang memakai iodin
klorida. Namun metode yang digunakan pada percobaan ini adalah metode iodin Hanus. Sebanyak 0,25
gr lipid padat ditambahkan 10 ml kloroform. Lipid padat ini tidak larut dalam kloroform karena lipid yang
digunakan adalah lipid padat, bukan lipid yang sudah dicairkan dengan proses pemanasan.

Selanjutnya ditambahkan 30 ml larutan iodin Hanus kemudian didiamkan selama 30 menit dengan
sesekali dikocok. Hasil yang diperoleh, larutan menjadi cokelat tua.

Setelah 30 menit larutan ini ditambahkan dengan 10 ml larutan KI 15%. Larutan berubah warna menjadi
cokelat muda. Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest kemudian dititrasi dengan Na2S2O3 0,1 N,
larutan menjadi kuning, setelah itu ditambahkan dengan 2 ml indikator kanji sampai larutan berwarna
putih dan dititrasi lagi dengan Na2S2O3. Pada titrasi kedua ini larutan tidak berubah atau tidak terjadi
perubahan warna larutan.

Lemak hewan pada umumnyaberupa zat padat pada suhu ruangan,sedangkan lemak yang
barasal dari tumbuhanberupa zat cair.Lemak yang mempunyaititik lebur tinggi mengandung asam
lemakjenuh,sedangkan lemak cair atau yng basa disebut minyak mengandung asam lemaktidak jenuh.
Lemak hewan dan tumbuhan mempunyai susunan asam lemak yangberbeda-beda. Untuk menentukan
derajat ketidakjenuhan asam lemak yangterkandung didalamnya diukur dengan bilanganiodium. Iodium
dapat bereaksi dengan ikatan rangkap dalam asam lemak. Tiapmolekul iodium mengadakan reaksi adisi
pada suatu ikatan rangkap. Olehkarenanya makin banyak ikatan rangkap,makin banyak pula iodium yang
dapatbereaksi.

8. Uji Penyabunan

Uji penyabunan untuk asam-asam lemak dilakukan dengan menambahkan 10 ml KOH alkoholis 10%
atau NaOH 10 % kedalam minyak yang hendak diuji, kemudian dikocok. Pencampuran ini menghasilkan
larutan berwarna kuning muda yang tidak saling campur. Setelah itu minyak dan KOH alkoholisis 10%
dipanaskan diatas penangas air. Pada proses pemanasan ini minyak dapat larut dalam KOH alkoholisis
dan larutan berwarna kuning muda.

Reaksi di atas dikenal dengan reaksi penyabunan (saponifikasi). Reaksi ini bertujuan untuk pengambilan
asam-asam lemak dari minyak, sehingga dihasilkan campuran sabun dan gliserol yang mudah larut
dalam air dan alkohol. Pada pengambilan asam lemak ini, minyak dihidrolisis dengan larutan alkali yaitu
KOH (Kalium hidrosida) atau NaOH (Natrium hidroksida).

Proses hidrolisis yang menggunakan basa disebut proses penyabunan. Jumlahmol basa yang digunakan
dalam proses penyabunan ini tergantung pada jumlah molasam lemak.Untuk lemak dengan berat
tertentu,jumlah mol asam lemak tergantungpada panjang rantai karbon pada asam lemak tersebut.
Apabila rantai karbon itupendek,maka jumlah mol asam lemak besar,sebaliknya apabila rantai karbon
itupanjang,jumlah mol asam lemak kecil. Jumlah miligram KOH yang diperlukan untukmenyabunkan
1gram lemak disebut bilanganpenyabunan. Jadi besar atau kecilnya bilangan penyabunan ini
tergantungpada panjang atau pendeknya rantai karbon asam lemak atau dapat dikatakan jugabahwa
besarnya bilangan penyabunan tergantung pada berat molekul lemaktersebut. Makin kecil berat
molekul lemak,makain besar bilangan penyabunannya.

9. Uji Bilangan Penyabunan / Angka Penyabunan

Menurut Farmakope edisi III, bilangan penyabunan adalah bilangan yang menunjukkan jumlah mg
kalium hidroksida yang diperlukan untuk menetralkan asam lemak bebas dan menyabunkan ester yang
terdapat dalam 1 g zat uji. Caranya adalah dengan menentukan jumlah kelebihan KOH yang tersisa
setelah saponifikasi.

10. Kromatografi

Untuk menganalisa kandungan lemak dalam makanan dapat dilakukan dengan cara volumetris,
gravimetris, dan kromatografi. Kromatografi yang dapat dipakai seperti kromatografi gas (CG),
kromatografi lapisan tipis (TLC), kromatografi ekslusi (SEC), kromatografi cairan (LC) dan kromatografi
yang memiliki unjuk kerja baik seperti HP-SEC dan HPLC.
Kromatografi gas digunakan untuk melarutkan dan menghitung lipida seperti triasilgliserol dan turunan-
turunan FAME. TLC sangat sesuai untuk memisahkan ester kolestrol, mono, di, triacylglycerols, asam
lemak bebas, kolestrol, dan fospolipid. SEC dan HP-SEC digunakan untuk memisahkan produk hidrolitik,
oksidasi dan pemanasan lemak. Sedangkan HPLC digunakan untuk memisahkan lipida non-volatil yang
memiliki berat molekul tinggi.

Untuk menentukan kadar lemak total dalam makanan, the Nutrition and Labeling Education
membutuhkan tahapan sebagai berikut, yaitu (1) hidrolisis dengan asam atau basa; (2) ekstraksi dengan
eter ; dan (3) konversi asam lemak ke metil ester asam lemak (FAME) kemudian menghitung kadar
FAME dengan kromatografi gas. Menentukan kandungan lipida dapat dilakukan dengan menggunakan
TLC dan metode enzimatis. Enzim yang digunakan adalah enzim hidrolase, oxidase dan peroxidase
dalam precursor chromogen. Metode ini sesuai untuk menentukan fospolipida hewan, jaringan tissue
manusia dan fluida.