Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 1|Page

BAGIAN I

PEMBUATAN PEREAKSI

1. Pereaksi Mollisch
Timbang 5 g -naftol, masukkan dalam tabu takar 50 ml. Larutkan dengan sedikit
alkohol sambil diaduk dengan batang pengaduk. Setelah larut, cukupkan
volumenya dengan alkohol hingga 50 ml.
2. Pereaksi Bial Orsinol
Timbang 0,5 g orcinol besi (III) klorida, masukkan dalam tabu takar 10 ml.
Larutkan dengan sedikit HCl pekat sambil diaduk dengan batang pengaduk. Setelah
larut, cukupkan volumenya dengan HCl pekat hingga 10 ml.
Catatan : kerja harus dilakukan di dalam lemari asam dan menggunakan masker.
3. Pereaksi Seliwanoff
Campurkan 3,5 ml resorsinol 0,5% dengan 1,5 ml HCl, masukkan dalam tabu takar
10 ml. Setelah larut, cukupkan volumenya dengan HCl 6 M hingga 10 ml.
Catatan : kerja harus dilakukan di dalam lemari asam dan menggunakan masker.
4. Pereaksi Barfoed
Timbang 6,65 g Kristal Cu(II)asetat ke dalam 100 ml asam asetat 1%.
Pembuatan larutan asam asetat 1%
Hitung volume untuk 1 gram asam asetat glacial dengan rumus : = m/v. (nilai
dapat dilihat pada label botol asam asetat glacial). Pipet sejumlah volume yang
sesuai untuk asam asetat glacial dan masukkan dalam labu takar 100 ml. cukupkan
volumenya dengan aquadest hingga tanda tera.
Catatan : kerja harus dilakukan di dalam lemari asam dan menggunakan masker.
5. Pereaksi Schiff
Timbang 1 g natrium metabisulfit, masukkan dalam labu takar. Timbang 0,1 g
larutan p-rosanilin HCl dan dan pipet 1 ml HCl pekat, masukkan ke dalam labu
takar tsb. Cukupkan volumenya dengan aquadest hingga tanda tera.
6. Pereaksi Tollens
Larutan A : timbang 1 g AgNO3, larutkan dalam 10 ml aquadest.
Larutan B : timbang 3 g NaOH Kristal menggunakan kaca arloji (hati-hati, bersifat
korosif), larutkan dalam 10 ml air.
Jika pereaksi akan dipakai, campurkan larutan A dan larutan B dengan volume
yang sama ke dalam tabung reaksi dan tambahkan larutan ammonia encer tetes
demi tetes sampai semua Ag2O larut.
7. Pereaksi Fehling

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 2|Page

Larutan Fehling A : timbang 6,928 g Kristal Cu(II)SO4, masukkan ke dalam labu

takar 100 ml. Teteskan beberapa tetes asam sulfat encer ke dalam 10 ml aquadest,
lalu masukkan ke dalam labu tsb. Aduk dengan batang pengaduk hingga Kristal
larut, cukupkan volumenya dengan aquadest hingga tanda tera.
Larutan Fehling B : timbang 12 g NaOH (gunakan kaca arloji) dan 34,6 g natrium
kalium tartarat (garam Rochelle), masukkan ke dalam labu takar 100 ml. Larutkan
dengan air secukupnya, setelah larut cukupkan volumenya hingga tanda tera.
Jika hendak digunakan campurkan larutan A dan B dengan volume yang sama.
8. Pereaksi Benedict
Timbang 34,6 g natrium sitrat (Na3C6H5O7. 11H2O) dan 1 g natrium karbonat
anhidrat, masukkan ke dalam labu takar 100 ml. larutkan dengan 80 ml aquadest.
Tambahkan kembali aquadest 5 ml. Timbang 3,46 g CuSO4 hidrat, larutkan dengan
10 ml aquadest. Masukkan larutan CuSO4 hidrat tsb ke dalam labu takar, cukupkan
volumenya hingga tanda tera.
9. Pereaksi Ninhidrin
Timbang 0,2 g ninhidrin, masukkan dalam labu takar 100 ml. Tambahkan sedikit
aquadest, aduk hingga larut lalu cukupkan volumenya hingga tanda tera.
10. Pereaksi Millon
Timbang 1 g HgSO4, masukkan dalam labu takar 100 ml. tambahkan sedikit larutan
asam sulfat 10%, aduk hingga larut, lalu cukupkan volumenya hingga tanda tera.
Larutan H2SO4 10 % : pipet 10 ml H2SO4 pekat, masukkan dalam labu takar 100 ml.
Cukupkan volumenya dengan aquadest hingga tanda tera.
Larutan NaNO2 1% : timbang 1 g NaNO2, masukkan dalam labu takar 100 ml.
Larutkan dengan sedikit aquadest lalu cukupkan volumenya hingga tanda tera.
Catatan : kerja harus dilakukan di dalam lemari asam dan menggunakan masker.
11. Larutan HCl
Normalitas/molaritas ml HCl pekat dilarutkan menjadi 1 liter
0,01 0,89
0,02 17,8
0,05 44,5
0,10 89,0
0,50 44,5
1,00 89,0
Simpan larutan HCl dalam botol tertutup.
12. Larutan NaOH
Siapkan alkali (1 : 1) dengan menambahkan aquadest pada NaOH pellet, aduk-aduk
hingga NaOH larut. Biarkan 1 hari hingga semua karbonat mengendap.Lihat table
di bawah untuk membuat berbagai konsentrasi NaOH.
Normalitas/molaritas Ml alkali 1:1 NaOH diencerkan menjadi
1 liter
0,01 0,54

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 3|Page

0,05 2,70
0,10 5,40
0,50 27,0
1,00 54,0
0,60 32,4
Larutan NaOH harus disimpan dalam botol tertutup

13. Larutan Asam Asetat 1 M

Larutkan 57,75ml asam asetat glasial dalam aquadest hingga diperoleh 1 liter
larutan.
14. Larutan Pati/Larutan Kanji
10 g pati/kanji yang dapat larut dicampur dengan 10 mg HgI dan 30 ml aquadest,
ditambahkan pada 1 liter aquadest yang sedang mendidih.
15. Larutan dapar/buffer asetat
Larutan A : 0,2 M larutan asam asetat (11,55 ml dalam 1000 ml)
Larutan B : 0,2 M larutan Na-asetat (16,4 g C2H3O2Na atau 27,2 g C2H3O2Na.3H2O
dalam 1000 ml)
Cara membuat : x ml larutan A + y ml larutan B, encerkan hingga 100 ml.
X y pH X y pH
46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8
44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0
41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2
36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4
30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6
25,5 24,5 4,6
16. Larutan iod 0,01 N
Sebanyak 2-2,5 g KI dan 1,269 g I2 (timbang menggunakan wadah kaca arloji)
dilarutkan dalam aquadest hingga 1 liter.
17. Pereaksi Nelson
Nelson A : larutkan 12,5 g natrium karbonat anhidrat, 12,5 g garam Rochelle, 10 g
natrium bikarbonat dan 100 g natrium sulfat anhidrat dalam 350 ml aquadest.
Encerkan hingga 500 ml.
Nelson B : larutkan 7,5 g CuSO4.5H2O dalam 50 ml aquadest dan tamabahkan 1
tetes asam sulfat pekat.
Pereaksi dibuat dengan mencampur 25 bagian Nelson A dan 1 bagian Nelson
B. Pencampuran dilakukan sesaat sebelum digunakan.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 4|Page

BAGIAN II

PROTEIN DAN ASAM AMINO

A. UJI SIFAT SIFAT PROTEIN

Kelarutan protein dalam suatu cairan dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara
lain pada pH isolistrik, kebanyakan protein sangat mudah untuk diendapkan.
Sebaliknya pada pada pH diatas atau dibawah titik isolistrik kelarutan protein sangat
meningkat. Sementara itu kelarutan protein akan meningkat dalam selang suhu
tertentu, yaitu kira-kira 0oC 40oC. peningkatan suhu sampai di atas suhu 50oC
menyebabkan protein tidak mantap dan mulai terdenaturasi.
Pada suhu rendah, pelarut organik yang bersifat polar seperti alcohol dan aseton
dapat menurunkan kelarutan protein dalam air karena zat-zat tersebut memiliki
konstanta dielektrik cairan yang lebih rendah dari air.
Garam logam berat seperti Ag, Pb dan Hg dapat berikatan dengan protein
membentuk endapan logam-protein yang kuat sehingga protein mengalami
denaturasi. Apabila terdapat garam-garam anorganik dengan prosentase tinggi dalam
larutan protein, maka kelarutan protein berkurang sehingga mengakibatkan
pengendapan. Teori menyebutkan bahwa sifat itu terjadi karena kemampuan ion
garam untuk terhidrasi sehingga berkompetisi dengan molekul protein untuk
mengikat air.

TUJUAN PERCOBAAN
Tujuan percobaan ini adalah untuk mengetahui sifat kelarutan dan denaturasi
yang berkaitan dengan protein albumin.

1. PENGENDAPAN DENGAN GARAM.

BAHAN : Larutan protein albumin
Larutan (NH4)2SO4
Reagen untuk uji biuret

ALAT : Pipet tetes dan tabung reaksi

PROSEDUR
Jenuhkan 10 mL larutan protein dengan amonium sulfat. Untuk pekerjaan ini yang
harus dilakukan : pertama tambahkan sedikit dari garam tersebut. Aduk hingga larut

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 5|Page

kemudian tambahkan sedikit amonium sulfat dan aduk secara terus menerus sehingga
sedikit garam tertinggal (tidak larut) apabila larutan telah jenuh, kemudian saring. Uji
kelarutan dari endapan di dalam air dan uji endapan dengan reagen Millon, sedangkan
filtratnya dengan uji Biuret.

2. UJI KOAGULASI
Bahan : asam asetat 1 M larutan protein
Reagen Millon air
Alat yang digunakan sesuai dengan kebutuhan dalam prosedur
Prosedur
Tambahkan 2 tetes asam asetat 1 M kedalam 5 ml. Larutan protein letakkan tabung
reaksi dalam air mendidih selama 5 menit. Ambil endapan dengan batang pengaduk.
Uji kelarutan endapan di dalam air dan uji endapan dengan reagen Millon.
Pertanyaan :
1. Mengapa ditambahkan asam?
2. Protein apa yang menggumpal pada saat pendidihan?

3. PENGENDAPAN DENGAN ALKOHOL

Perhatikan tabel berikut dan ikuti petunjuk di dalam tabel ;
Tabung 1 2 3
Larutan albumin 5 ml 5 ml 5 ml
HCl 0,1 M 1 ml - -
NaOH 0,1 M - 1 ml -
Buffer asetat pH = - - 1 ml
4 6 ml 6 ml 6 ml
Etil Alkohol 95%

Pertanyaan
1. Tabung-tabung mana yang menunjukkan protein tidak larut?
2. Jelaskan mengapa keadaan tsb dapat terjadi?

3. DENATURASI PROTEIN
Bahan : larutan albumin
HCl 0,1 M
NaOH 0,1 M
Prosedur :

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 6|Page

Tabung 1 2 3
Larutan albumin 5 ml 5 ml 5 ml
HCl 0,1 M 1 ml - -
NaOH 0,1 M - 1 ml -
Buffer asetat pH = 4 - - 1 ml

Tempatkan ketiga tabung dalam air mendidih selama 15 menit dan didinginkan dalam
temperatur kamar. Pada tabung mana yang kelihatan mengendap. Untuk tabung 1 dan
tabung 2 tambahkan 10 ml buffer asetat pH 4. Tuliskan hasilnya.

Pertanyaan :
1. Sifat fisik apa yang mempengaruhi kelarutan protein dalam percobaan ini
2. Mengapa perlu dilakukan pemanasan?
3. Bandingkan hasil perlakuan pertama dan kedua pada larutan protein, apa
kesimpulan anda?
4. Apakah ada metode lain yang di gunakan untuk denaturasi protein
5. Perubahan kimia apa yang berhubungan dengan denaturasi telur

B. Uji sifat-sifat ionik asam amino

Suatu protein pada umumnya mengandung sejumlah asam amino bermuatan positif
(basa) dan sejumlah lagi yang bermuatan negatif (asam), tergantung pada pH larutan
dan banyaknya asam amino basa atau asam. Atas dasar tersebut masing- masing asam
amino akan memiliki daerah kapasitas buffer dan nilai pKa-nya masing-masing bila
dititrasi dengan larutan basa.
Perhatikan dan isilah tabel berikut :
Volume asam HCl 0,5 (mL)
pH Sampel (a) Blanko (b) C1 = a-b

Volume basa NaOH 0,5 (mL)

pH Sampel (x) Blanko (y) C2 = x-y

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 7|Page

Pertanyaan :
1. Buatlah kurva titrasi di atas dengan memetakan C1 dan C2 terhadap pH
2. Apa perbedaan kurva C1 dan C2?
3. Apa kesimpulan anda?

C. PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM SAMPEL DENGAN METODE BIURET

TEORI
Penentuan protein secara biuret berdasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh
ikatan kompleks yang warnanya ungu. Hal ini terjadi apa bila protein bereaksi dengan
ion tembaga dalam lingkungan alkali

TUJUAN
1. Untuk mengetahui prinsip pengukuran kadar protein sampel dengan metode
Biuret
2. Untuk mengetahui kadar protein dalam sampel

BAHAN
Reagen Biuret : larutan 1,5 g (CuSO45H2O) dan 6 gram garam rochelle (NaKC4O6.O)
kedalam 500 mL air kedalam labu takar 1 L. Kemudian tambahkan 300 ml NaOH 10%
sambil dikocok kocok lalu tambahkan air hingga tamda batas. Apabila pembuatan
kurang baik dapat terjadi endapan hitam atau merah. Reagen demikian ini tidak dapat
dipakai.
Larutan standar protein : buatlah larutan standar serum albumin murni atau kasein
dalam air dalam kadar 10 mg/mL. Untuk mudah larutnya tambahkan beberapa tetes
NaOH 3%.

Alat : Pipet tetes tabung reaksi

Labu takar

Prosedur :
Pipet ke dalam tabung reaksi 1 ml larutan protein yang mengandung 1-10 mg/ml
protein. Tambahkan 4 ml larutan reagen biuret. Kocok dan diamkan selama 30 menit
pada suhu kamar. Baca serapannya pada panjang gelombang 540 nm. Untuk blanko
dipakai campuran 1 ml air dan 4 ml reagen biuret yang juga didiamkan selama 30
menit pada suhu kamar. Hukum Lambert Beer berlaku untuk larutan-larutan protein
antara 1 dan 10 mg/ml.

Nomor Tabung
Pereaksi
1 II III IV V VI

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 8|Page

Biuret 6 mL 6 mL 6 mL 6 mL 6 mL 6 mL
Aquadest 6 mL 5,8 ml 5,6 mL 5,4 mL 5,2 mL 5 mL
Standar 6 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 0,8 ml 1 mL

Sample yang digunakan adalah telur, tahu, bakso, tepung terigu.

Tugas dan pertanyaan

1. Tentukan panjang gelombang maksimum untuk pengukuran sampel dengan
spektrofotometer!
2. Buatlah kurva standar dan tetapkan protein larutan yang diberikan.
3. Berikan penjelasan tentang hukum Lambert Beer.
4. Senyawa apa yang dapat mengganggu cara Biuret seperti diatas
5. Tuliskan reaksi Biuret dengan larutan protein!

Uji Warna Protein

Uji Biuret
Ambil 3 ml larutan protein ditambah 1 ml NaOH 40%. Tambahkan bertetes-tetes
larutan CuSO4 0,5% sehingga terjadi warna merah muda atau ungu. Intensitas warna
menunjukkan jumlah ikatan peptide dalam sampel.
Uji Xantoprotein
Ambil 3 ml larutan protein ditambah 1 ml HNO3 pekat.Panaskan campuran tsb dan
larutan menjadi kuning.Dinginkan kemudian tambahkan ammonia hingga warnanya
berubah menjadi jingga.
Uji Ninhidrin
Atur pH dari larutan protein 0,5% sampai pH 7. Ambil 1 ml larutan dan tambahkan 10
tetes larutan Ninhidrin 0,2%. Panaskan campuran pada suhu 100oC selama 10
menit.Amati perubahan warna yang terjadi.
Uji Millon
2 ml larutan protein ditambah 1 ml pereaksi merkurisulfat.Panaskan campuran,
mungkin terjadi endapan kuning. Dinginkan dengan air lalu tambahkan 1 tetes larutan
NaNO2 1%. Panaskan lagi endapan atau larutannya amenjadi merah.
Uji Hopkins-Cole
1 ml larutan protein ditambah 1 tetes larutan formaldehid encer kemudian ditambah 1
tetes pereaksi merkurisulfat.Campuran tsb kemudian ditambah 1 ml asam sulfat pekat
melalui dinding tabung reaksi yang dimiringkan sehingga terbentuk dua lapisan.Pada

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

 Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 9|Page

biddang batas terlihat adanya cincin ungu.Jika digojog maka seluruh larutan menjadi
ungu.

Hidrolisis Protein dan Uji Adanya Belerang

1 ml larutan protein ditambah 1 ml larutan NaOH 40% dipanaskan selama 1 menit.
Tambahkan 1 tetes Pb-asetat akkan terjadi warna hitam karena terjadinya endapan
PbS.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 10 | P a g e

BAGIAN III

PATI/KARBOHIDRAT

TEORI
Glikogen dan amilum merupakan simpanan karbohidrat di dalam binatang dan
tumbuhan.Glikogen dan amilum merupakan hasil kondensasi beberapa molekul
glukosa.Karena molekulnya besar, maka larutanya sukar larut dan bersifat
koloidal.Glikogen dan amilum dapat dihidrolisis oleh pengaruh enzin pencernaan
menjadi maltosa atau oleh asam menjadi glukosa.Sebagai hasil antara diperoleh
erythro dan achrodextrin glikogen.Amilum dan desktrin dapat diendapkan dengan
menambahkan garam yang sangat mudah larut misalnya ammonium sulfat.
Karbohidrat dikelompokkan ke dalam tiga golongan yaitu : monosakarida
oligosakarida, dan polisakarida. Monosakarida adalah gula sederhana yang tidak dapat
diuraikan lebih lanjut dan mempunyai sifat-sifat karbohidrat.Jenis yang penting
misalnya glukosa fruktosa, dan mannose serta arabinosa.
Oligosakarida adalah disakarida yang molekulnya terdiri dari beberapa monosakarida
misalnya disakarida (sukrosa, maltosa, laktosa).Sukrosa banyak terdapat tebu dan
buah-buahan.Maltosa merupakan hasil hidrolisa dari amilum oleh enzim amylase.
Sedangkan laktosa terdapat banyak di susu. Monosakarida dan oligosakarida dapat
membentuk kristal, larut dalam air dan mempunyai rasa yang manis.
Jenis polimer monosakarida yang lain yaitu polisakarida, senyawa ini mempunyai
rantai yang panjang dengan struktur yang lurus atau bercabang. Plisakarida biasanya
tidak mempunyai rasa.Tidak larut dalam air dan berbobot molekul tinggi.Contohnya
amilum, dekstrim, glikogen dan selulosa.
A. UJI KARBOHIDRAT
BAHAN : ubi jalar terigu
Amilum manihot (kanji) tepung sagu
Tepung konjak (nutrijel) tepung agar-agar
Tepung beras tepung jagung (maizena)
PROSEDUR :
Masukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing 3 mL larutan amilum pada tabung
pertama tambahkan dua tetes air dan tabung kedua tambahkan dua tetes HCl. Pada
tabung tiga tambahkan 2 tetes NaOH. Kocok maing masing tabung , selanjutnya
tambahkan iodine kedalam masing masing tabung. Perhatikan warna yang
terbentuk. Panaskan ketiga tabung tersebut, kemudian didinginkan amati
perubahannya.
B. HIDROLISIS PATI
BAHAN : larutan Pati 1% pereaksi Nelson
Larutan iodine reagen Arsenomolibdat
HCl 6 N NaOH 6 N

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 11 | P a g e

ALAT : tabung reaksi pipet tetes

Pipet ukur 5 mL labu takar

PROSEDUR

Hidrolisis menggunakan asam :

Sebelum di tambahkan HCl pekat larutan pati 1 % diuji iodine.15 mL larutan pati 1 %
ditambahkan 10 tetes HCl pekat, didihkan.Pada selang waktu 5 menit diambil dua tetes
campuran kemudian lakukan uji iodine (lihat uji untuk karbohidrat di atas).Pada
waktu yang bersamaan diambil tiga tetes campuran dan masukkan kedalam tabung
reaksi selanjutnya ditambahkan 5 mL pereaksi Nelson.Dipanakan larutan tsb di atas
penangas air mendidih. Selanjutnya dinginkan dan amati hasilnya.
Hidrolisis menggunakan enzim amylase:
Sebelum ditambahkan enzim larutan pati 1 % diuji dengan cara 15 mL larutan pati 1
% diinkubasi terlebih dahulu dalam penganas air 500C selama 5 menit, selanjutnya
ditambahkan 1 mL saliva (penggenceran 10-1 atau 1 ml larutan enzim amylase dari A
niger). Inkubasi dilanjutkan.Pada selang waktu 5 menit diambil 2 tetes campuran
kemudian dilakukan uji iodine (lihat uji karbohidrat diatas).Pada waktu yang
bersamaan diambil 3 tetes campuran dan masukkan kedalam tabung reaksi,
selanjutnya ditambah5 ml pereaksi Nelson.Pekerjaan dilakukan sampai menit ke
25.semua tabung yang telah diperlakukan dengan pereaksi Nelson dipanaskan dengan
penangas air mendidih. Selanjutnya dinginkan dan amati.

Reaksi Warna
Uji Mollisch
Masukkan 5 mg cuplikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 0,5 ml air dan tambahkan
2 tetes larutan 10% 2-naftol dalam pealrut etanol atau kloroform. Masukkan 1 ml
asam sulfat pekat ke dasar tabung reaksi dengan menggunakan pipet tetes sedemikian
rupa (pipet tetes panjang) hingga asam sulfat membentuk lapisan yang terpisah dari
lapisan awal. Jmika dalam cuplikan terdapat karbohidrat, maka akan terbentuk cincin
berwarna merah pada permukaan lapisan bawah. Warna merah akan segera berubah
dan larutan menjadi berwarna ungu tua. Setelah didiamkan selama 2 menit, encerkan
campuran tsb dalam 5 ml air. Jika didalam cuplikan terdapat kerbohidrat, makaakan
terjadi endapan berwarna ungu.
Uji Bial Orsinol
Masukkan 0,2 ml (2 3 tetes) larutan cuplikan (1%) ke dalam tabung reaksi.
Tambahkan perlahan-lahan 2 ml pereaksi orsinol.Kocok dan panaskan pada penangas
air.Catat perubahan warna yang terjadi setelah pemanasan selama 15 menit.Warna
biru kehijauan menunjukkan uji positif.
Uji Seliwanoff
Masukkan 2 ml pereaksi Seliwanoff dalam tabung reaksi dan tambahkan 0,2 ml (2-3
tetes) cuplikan 1%. Campuran dikocok dan dipanaskan di atas penangas air.Hitung

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 12 | P a g e

waktu yang diperlukan untuk terjadinya perubahan warna.Jika perubahan warna

memerlukan waktu di atas 10 menit, uji dinyatakan negative.
Uji Barfoed
Panaskan tabung reaksi yang berisi 1 ml pereaksi Barfoed dan 1 ml larutan encer
cuplikan alam penangas air.Jika terdapat endapan merah dari Cu2O selama 2 menit
berarti dalam cuplikan terdapat monosakarida. Disakarida pada pemaanasan selama
10 menit juga akan menunjukkan uji positif. Hal ini terjadi karena disakarida akan
terhidrolisis menjadi monosakarida (dalam suasana asam).
Uji Fuchsin
Campurkan 2 ml pereaksi Fuchsin dan 1 tetes cuplikan ke dalam tabung reaksi. Kocok
dan amati warna yang terjadi setelah 3-4 menit.
Uji Schiff
Campurkan 2 ml pereaksi Schiff dengan 2 tetes cuplikan (0,05 g) dan diamati warna
yang terjadi.
Uji Tollens
Masukkan 2-3 tetes (0,05 g) cuplikan ke dalam tabung reaksi dan tambahakan 2-3 ml
pereaksi Tollens. Jika tidak terjadi kaca perak, dapat dicoba dengan memanaskan
campuran tsb.Terbentuknya kaca perak menunjukkan positif adanya gugus aldehid.
Uji Fehling
Cara 1 : Campur 2 tetes (0,05 g) cuplikan dan 2-3 ml larutan Fehling. Panaskan dengan
penangas air selama 3-4 menit. Amati endapan yang terjadi.
Cara 2 : Panaskan 2-3 ml larutan cuplikan hingga mendidih lalu teteskan pereaksi
Fehling beberapa ml. hasil dinyatakan positif jika warna biru dari pereaksi Fehling
hilang dan terbentuk endapan merah atau kuning dari Cu2O.
Uji Benedict
Campurkan 5 ml pereaksi Benedict dengan 0,4 ml larutan 2% karbohidrat. Panaskan
selama 2 menit dan setelah dingin amati perubahan yang terjadi. Jika di dalam
cuplikan tidak terdapat gula pereduksi maka larutan jernih, sedangkan jika terdapat
gula pereduksi akan terbentuk endapan Cu2O.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 13 | P a g e

BAGIAN IV

ENZIM

TEORI
Enzim merupakan kelompok protein yang berperan penting dalam proses aktivitas
biologi. Enzim berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya sangat khas. Dalam
jumlah sangat kecil enzim dapat mengatur kecepatan reaksi tertentu sehingga dalam
keadaan normal tidak terdapat penyimpangan-penyimpangan hasil akhir reaksinya.
Enzim akan kehilangan aktivitas akibat panas, asam, atau basa kuat, pelarut organik,
atau apa saja yang menyebabkan denaturasi protein.
A. UJI UREASE
Membuktikan adanya enzim urease dalam suspensi kedelai
Substrat urea oleh enzim urease dalam suspensi kedelai akan diuraikan menjadi
amonia (NH30 dan gas CO2. Senyawa amonia yang dihasilkan bersifat basa sehingga pH
larutan menjadi naik dan dapat ditunjukkan dengan menggunakan indiokator PP.
Aktivitas enzim urease dirusak oleh adanya inhibitor logam berat seperti Hg2+ atau
Pb2+ dan rusak pada pemanasan 100oC.
Alat dan bahan :
Suspensi kedelai larutan urea 1 %
Larutan PP (pH : 8,3 10) larutan HgCl2 1%
Alat pemanas tabung reaksi
Pipet tetes
Prosedur :
1. Siapkan 3 tabung reaksi bersih dan kering. Isilah masing-masing dengan 1 ml
larutan urea 1%.
2. Selanjutnya, pada :
Tabung i : tambahkan 10 tetes filtrat kedelai dan 2 tetes PP
Tabung 2 : tambahkan 10 tetes filtrat kedelai yang telah dididihkan dan 2 tetes
PP
Tabung 3 : tambahkan 10 tetes filtrat kedelai, 2 tetes PP dan 10 tetes HgCl2 1%
3. Setelah dicampur dengan baik, masukkan ke-3 tabung dalam tangas air pada
suhu 37 40oCselama 5 menit.
4. Amati perubahan warna yang dihasilkan.
B. EKSTRAKSI ENZIM

Ekstraksi enzim proteolitik dari buah-buahan

Bahan :
Buah pepaya muda segar buah nenas
Alkohol 80% buffer fosfat pH 7,0
Sentrifus stirer magnetik

Ekstraksi Enzim Bromelin

Buah nenas dipotongkecil, diblender, diperas, disaringsehingga diperoleh cairan
jernih. Kedalam cairan ini ditambahkan alcohol 80% dengan perbandingan 1:4,

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 14 | P a g e

Biarkanselama satu malam pada suhu 100C agarenzim mengendap. Selanjutnya

dilakukansentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpmselama 15 menit pada suhu
100C.Endapan yang diperoleh dikeringkandengan cara pengeringan beku.Diperoleh
serbuk yang merupakanenzim bromelin kasar kemudiandilarutkan dalam buffer fosfat
pH 7,0disimpan pada 40C.

Ekstraksi enzim papain

Buah papaya muda disadap (mengambil) getahnya, setelah didapat getah pepaya
dilakukan penjemuran sampai getah mengering, dan terakhir menghaluskan getah
kering sampai menjadi bubuk enzim papain (ekstrak kasar).

C. KARAKTERISASI ENZIM
Penentuan Unit Aktivitas Enzim
Sebanyak 0,5 ml kasein (10mg/ml) direaksikan dengan 0,5 ml enzim dan 8 ml larutan
buffer fosfat. Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37oC.Setelah diinkubasi, ke dalam
campuran reaksi ditambahkan 1 ml larutan asam trikloroasetat 30%. Panaskan lagi
pada suhu yang sama selama 30 menit. Protein yang terkoagulasi dipisahkandengan
kertas saring.Filtrat yangdiperoleh diukur absorbansinya padapanjang gelombang 280
nm. Sebagaikontrol digunakan enzim yang telahdimatikan aktivitasnya melalui
pemanasan. Unit aktivitas dinyatakandalam 1 mikro mol tirosin yangdihasilkan per
ml enzim dalam15 menitpada kondisi percobaan. Untukmengetahui jumlah tirosin
yangdihasilkan digunakan kurva standartirosin.
Penentuan Kadar Protein dengan Metoda Biuret
Pengukuran kadar protein enzim dilakukan berdasarkan metode Biuret, dengan cara
campurkan 1 ml enzim dengan 4 ml reagen biuret dan diamkan selama 30 menit,
kemudian ukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Standar protein yang
digunakan adalah bovin serum albumin (BSA) pada kisaran konsentrasi 1 10 mg/ml,
dengan selang 2 mg/ml.
Penentuan spesifik aktivitas enzim.
Spesifik aktivitas ditentukan dengan menentukan unit aktivitas enzim dibagi dengan
kadar protein enzim.
Optimasi aktivitas enzim
Untuk mendapatkan kondisi optimum aktivitas enzim, maka dibuat variasi suhu (40,
45, 50, 55, 60, 65), pH (3, 5, 7, 9), serta lama inkubasi (5, 10, 15, 20, 25, 30 menit)
terhadap aktivitas enzim. Setelah diinkubasi, ke dalam campuran reaksi ditambahkan
1 ml larutan asam trikloroasetat 30%. Panaskan lagi pada suhu yang sama selama 30
menit. Protein yang terkoagulasi dipisahkan dengan kertas saring dan filtrat yang
diperoleh diukur absorbansinya pada panjang gelombang 280 nm. Sebagai kontrol
digunakan enzim yang telah dimatikan aktivitasnya melalui pemanasan. Unit aktivitas
dinyatakan dalam 1 mikro mol tirosin yang dihasilkan per ml enzim dalam 15 menit
pada kondisi percobaan. Untuk mengetahui jumlah tirosin yang dihasilkan digunakan
kurva standar tirosin

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 15 | P a g e

Penentuan kinetika enzim

Kinetika enzim (Vmax dan Km) didasarkan atas plot grafik hubungan antara konsentrasi
substrat [S] dan aktivitas enzim (V).
Larutan substrat kasein dibuat dengan konsentrasi bervariasi ( 0,5 ml, 1,0 ml, 1.5 ml,
2,0 ml, 2,5 ml, 3,0 ml, 3,5 ml, 4,0 ml, 4,5 ml, 5,0 ml) lalu ditambah dengan0,5 ml enzim
dan 8 ml larutan buffer fosfat. Lakukan pengujian aktivitas seperti prosedur
sebelumnya pada waktu inkubasi optimal.Setelah itu tentukan aktivitas enzim (U/ml)
pada masing-masing konsentrasi substrat. Selanjutnya dibuat table V dan [S] dan
konversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot grafik hubungan antara 1/V dan
1/[S], lalu ditentukan persamaan garis regresinya, yaitu 1/V = (Km/Vmaks), (1/[S]) +
1/Vmaks (Y = aX + b) untuk kemudian dapat dihitung nilai Vmaks dan Km.

Tugas :
1. Buat kurva hubungan suhu dan aktivitas enzim
Aktivitas enzim

suhu
2. Buat kurva hubungan pH dan aktivitas enzim
Aktivitas enzim

pH

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 16 | P a g e

BAGIAN V

LIPID

A. PENYABUNAN
TEORI
Alkali bila bergabung dengan asam lemak akan membentuk sabun yang dapat
berfungsi sebagai emulgator
TUJUAN
Mempelajari jenis sabun yang terbentuk berdasarkan jenis lemak yang digunakan.

BAHAN : minyak kelapa margarine

Minyak sawit minyak curah
Minyak wijen Larutan KOH beralkohol
Larutan NaOH beralkohol Aquades
ALAT : pemanas (hot plate)
Tabung reaksi Gelas ukur
PROSEDUR
1. Masukkan bahan percobaan (minyak kelapa, margarin dll) sebanyak 4-5 tetes ke
dalam tabung reaksi
2. Tambahkan aquades 3 ml larutan KOH beralkohol
3. Panaskan campuran tersebut dalam penangas air selama 1-2 tetes
4. Lakukan prosedur (1-4) tetapi larutan KOH diganti dengan NaOH beralkohol
5. Bandingkan hasilnya.
B. UJI KETIDAKJENUHAN (UJI IOD)
TEORI
Asam lemak tidak jenuh memiliki ikatan rangkap yang dapat diadisi oleh golongan
halogen dengan kata lain tiap ikatan rangkap dapat mengikat satu molekul halogen
TUJUAN
Mengetahui ada tidaknya asam lemak tak jenuh pada jenis minyak/lemak tertentu
BAHAN : minyak tengik minyak segar ( bimoli, minyak kelapa biasa, curah)
Margarine (Blue Band) Larutan iod
Kloroform
ALAT : disesuaikan

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 17 | P a g e

PROSEDUR
Masukan 1 mL bahan percobaan (minyak tengik/minyak kelapa segar, margarin) ke
dalam tabung bersih.
Tambahkan kloroform 1 mL lalu kocok sampai semua bahan melarut
Tambahkan tetes demi tetes larutan iod sambil kocok lihat perubahan dan perbedaan
yang terjadi antara bahan yang satu dengan yang lain.

C. PEMISAHAN ASAM LEMAK

TEORI
Asam Lemak terdapat dalam lemak dan minyak dapat dipisahkan dan dimurnikan
TUJUAN : Memisahkan dan memurnikan asam lemak dari jenis lemak atau
minyak tertentu
BAHAN : Sama dengan percobaan diatas
ALAT : Disesuaikan
PROSEDUR
1. Masukkan 5 gram bahan percobaan ke dalam gelas beker 300 mL
2. Bubuhkan air suling 75 mL
3. Masukkan KOH sebanyak 25 mL
4. Didihkan selama 10 menit atau sampai terjadi penyabunan sempurna yang
ditandai dengan tidak ada lagi lemak yang terapung
5. Larutan sabun panas dibubuhkan HCl pekat sampai larutan terjadi asam, (kira-
kira 5 mL HCl)
6. Asam lemak bebas yang terbentuk akan naik ke atas permukaan sebagai lemak
yang terapung
7. Dinginkan larutan ini, lalu biarkan asam lemak mengental dan membentuk busa
seperti roti
8. Angkat busa seperti roti tersebut dan pecahkan menjadi potongan kecil
9. Cuci dengan air suling melalui saringan dan tempatkan dalam sebuah beker
yang berisi 30 mL alkohol 95%
10. Hangatkan campuran tersebut pada penangas air sampai asam (bentuk roti)
larut dan saring melalui kertas saring kering.
11. Biarkan filtrat menjadi dingin agar diperoleh kristal yang baik bila asam lemak
sudah mengkristal sempurna saring dan keringkan kristal diantara kertas
saring. Kemudian biarkan pada suhu kamar.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 18 | P a g e

D. UJI KETENGIKAN KREIS

Alat dan bahan :
Minyak Bimoli larutan floroglusinol dalam eter
Beaker glass oven
Pembuatan minyak tengik
Masukkan minyak yang diduga mempunyai ikatan tidak jenuh ke dalam beker gelas.
Panaskan minyak tersebut pada suhu 150oC selama 1 jam dan 2 jam. Pada selang
waktu tersebut amati bilangan peroksida, bilangan asam, bilangan iod dan uji Kreis.
Uji Kreis
Ke dalam minyak sebanyak 1 ml ditambah 2 ml asam klorida dan selanjutnya dikocok
dengan larutan encer floroglusinol dalam eter.Jika larutan berwarna merah jambu
menunjukkan minyak mulai tengik.
E. UJI KOLESTEROL
Kelompok lipid seperti fosfolipid dan sterol merupakan komponen penting yang
terdapat dalam membrane semua mahluk hidup.Kolesterol adalah sterol utama yang
banyak terdapat di alam.Untuk mengetahui adanya sterol dan kolesterol dapat
dilakukan uji kolesterol menggunakan reaksi warna.Salah satunya adalah reaksi
Lieberman-Burchard.Hasil positif menunjukkan warna yang berubah dari merah,
kemudian biru dan hijau.Warna hijau yang terjadi sebanding dengan konsentrasi
kolesterol dalam bahan.
Alat dan bahan :
Kolesterol 0,5% dalam kloroform minyak kelapa
Asam asetat anhidrat minyak ikan
Kloroform H2SO4 pekat
Tabung reaksi pipet ukur
Pipet tetes
Prosedur :
1. Siapkan 3 tabung reaksi yang bersih dan kering. Isilah tabung pertama dengan
1 ml minyak kelapa, tabung ke-2 dengan 5 tetes minyak ikan dan tabung ke-3
dengan 5 tetes kolesterol 0,5%.
2. Pada setiap tabung masukkan kloroform 2 ml
3. Tambahkan pula 10 tetes asam asetat anhidrat
4. Melalui dinding tabung, tambahkan 2-3 tetes asam sulfat pekat.
5. Kocoklah hati-hati dan diamkan beberapa detik.
6. Amati perubahan warna yang terjadi.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO

Penuntun Praktikum Biokimia, Program Studi Pendidikan Kimia FKIP UHO 19 | P a g e

DAFTAR PUSTAKA

1. Harrow, B. 1960, Laboratory Manual of Blochemistry, Edisi V

2. Soedarmo, J., A. Girindra, A. Manaf, M. Hawab, E.Kustaman, M. Bintang,
Sulistiayani, 1988, Penuntun Praktikum Biokimia, PAU IPB, Bogor.
3. Suhartono, MT. 1989, Petunjuk Laboratorium Dasar Dasar Biokimia, PAU IPB,
Bogor
4. Winarno, FG. 1982, Enzim Pangan, PT Gramedia, Jakarta
5. Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi, 1997, Prosedur Analisa Untuk Bahan
Pangan dan Pertanian, Liberty, Yogyakarta.
6. Apriyantono, A., Fardiaz, D., Puspitasari, N.L., Sedarnawati, dkk, 1989, Petunjuk
Laboratorium Analisis Pangan, Depdikbud Dirjen Dikti PAU PAngan dan Gizi
IPB, Bogor.
7. Sebayang, F., 2006, Pengujian Stabilitas Enzim Bromelin yang Diisolasi dari
Bonggol Nanas Serta imobilisasi Menggunakan kappa Karagenan, Jurnal Sains
Kimia Vol. 10 No. 1, USU, Medan.
8. Yazid, E., Nursanti , L., 2006, Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa
Analis, Penerbit Andi, Yogyakarta.

Laboratorium Pendidikan Kimia FKIP UHO