Evaluasi Kromatin Sperma Sebagai Indikator Kualitas Sperma

Ahmad Syauqy
Bagian Ilmu Biologi Kedokteran Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Jambi
Email : asqyjbi30@gmail.com

ABSTRACT
There are infertility cases that is founded on man, which cant be explained. It encourages androlog and
the researcher to find another examination besides mens fertility examination as commonly use in clinic.
Nowadays, sperm chomatin is not become a clinical parameter in deciding man fertility yet. According to
some researchers, abnormality in sperm chromatin can influence infertility in men. Sperm chromatins
examination that is commonly use is aniline blue and toluidine blue examination. Aniline blue examination
is used to see chromatins sperm maturity and toluidine blue examination is used to see packaging of
sperm chromatin. Some researchers told that aniline blue and toluidine blue examination is recomended to
complete semens analysis in mens fertility examination.

Keywords: sperm chromatin, quality of sperm

ABSTRAK
Ditemukannya kasus infertilitas pada pria yang tidak dapat dijelaskan mendorong para klinisi dan peneliti
untuk menemukan pemeriksaan penunjang selain pemeriksaan fertlitas pria yang telah umum dilakukan.
Saat ini, aspek kromatin sperma belum menjadi salah satu parameter klinik dalam penentuan fertilitas
seorang pria sedangkan dari beberapa penelitian menunjukkan bahwa abnormalitas pada kromatin
sperma dapat menyebabkan infertilitas pada pria. Pemeriksaan kromatin sperma yang banyak digunakan
adalah pemeriksaan biru anilin dan biru toluidin. Pemeriksaan biru anilin digunakan untuk melihat
kematangan kromatin sperma dan pemeriksaan biru toluidin digunakan untuk melihat kepadatan kromatin
sperma. Dari beberapa penelitian menunjukkan bahwa pemeriksaan biru anilin dan biru toluidin sangat
dianjurkan untuk melengkapi pemeriksaan analisis semen dalam pemeriksaan fertilitas pria.

Kata Kunci: Kromatin sperma, Kualitas sperma

PENDAHULUAN 27% merupakan kasus infertilitas pada pria

1
Saat ini permasalahan reproduksi pria yang yang tidak dapat dijelaskan penyebabnya.
banyak mendapatkan perhatian adalah Berbagai penelitian telah dilakukan untuk
masalah infertilitas. Infertilitas pada pria dapat mengatasi masalah tersebut baik
mencapai angka 50% dari kasus infertilitas secara klinik maupun secara biologi
1
secara umum. Dari 50% kasus tersebut, 6- molekuler. Dengan berkembangnya ilmu

87
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

biologi molekuler, para ilmuan juga mulai lebih hidrodinamik sehingga sperma dapat
mencoba memandang masalah infertilitas bergerak lebih cepat menuju ovum untuk
10
pada pria dari aspek molekuler untuk melakukan fertilisasi. Secara umum,
mencari penyebab infertilitas dan kualitas kromatin sperma merupakan salah
menemukan alternatif penatalaksanaan satu faktor yang berperan penting dalam
11
infertilitas yang lebih akurat. Salah satu proses fertilisasi sel ovum.
penelitian yang berkembang saat ini terkait Dalam menegakkan diagnosis dan
faktor-faktor yang berpengaruh pada memberikan penatalaksanaan pada pria
fertilitas pria adalah mengenai mekanisme yang mengalami infertilitas, praktisi
2
epigenetik pada spermatogenesis. Proses kesehatan selama ini lebih berpatokan pada
pergantian histon menjadi protamin pada hasil analisis semen berupa motilitas,
saat spermiogenesis merupakan salah suatu morfologi, dan konsentrasi sperma. Selain
mekanisme epigenetik yang ikut meregulasi itu juga, telah umum dilakukan pemeriksaan
diferensiasi spermatid menjadi spermatozoa integritas DNA sperma dan imunologi
2,3
dalam proses spermatogenesis. sperma yang dapat menentukan kualitas
Kualitas kromatin sperma merupakan salah sperma. Namun melalui pemeriksaan
satu indikator yang menentukan kualitas tersebut, tidak semua penyebab infertilitas
sperma. Kualitas kromatin sperma pada pria dapat diketahui sehingga masih
ditentukan oleh komposisi protamin dan terdapat 6-27% dari kasus infertilitas secara
histon yang terdapat pada sperma. Sperma umum yang tergolong infertilitas pria yang
yang matang mengandung minimal 85% tidak dapat dijelaskan. Terkait hal tersebut,
4
protamin dan 15% histon. Komposisi pemeriksaan kualitas kromatin sperma
protamin yang lebih besar dibandingkan dapat dijadikan sebagai salah satu indikator
histon tersebut berperan dalam proses tambahan dalam menentukan kualitas
pengemasan DNA sperma menjadi lebih sperma sehingga lebih mempertajam
padat. Pada beberapa penelitian diagnosis etiologi dan penatalaksanaan
menunjukkan bahwa kegagalan pergantian infertilitas pada pria.
histon menjadi protamin dan kepadatan
kromatin yang tidak optimal pada sperma PEMBAHASAN
berhubungan dengan terjadinya infertilitas I. Spermatogenesis
5,6,7,8,9
pada pria. Aspek kematangan dan Spermatogenesis merupakan suatu proses
kepadatan kromatin sperma berperan dalam pembentukan gamet pada pria berupa
mengemas genom paternal menjadi sangat sperma. Proses ini terjadi di testis pada
padat dalam nukleus sperma sehingga struktur yang disebut sebagai tubulus
genom paternal dapat terlindungi dari enzim seminiferus. Pembentukan sperma ini
nuklease, mutagen, dan faktor lain yang dimulai pada saat pubertas, ketika produksi
dapat merusak DNA. Disamping itu, aspek hormone gonadotropin sudah cukup
kepadatan kromatin sperma juga berperan maksimal untuk merangsang pembentukan
dalam membentuk nukleus sperma menjadi spermatozoa. Pada mulanya, diwaktu masih

88
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

dalam kandungan, sel-sel germinal kromosom induknya (spermatosit primer).

primordial tampak pada tingkat Langkah selanjutnya adalah tahap dimana
perkembangan awal di antara sel endoderm spermatid berdiferensiasi menjadi
di dinding kantung kuning telur di dekat spermatozoa.
allantois. Kemudian pada minggu ke-3 masa Hasil akhir dari spermatogenesis adalah
janin, mereka akan bermigrasi ke rigi spermatozoa yang haploid (n), dimana satu
urogenital yang saat itu tumbuh di daerah spermatosit primer menghasilkan empat
lumbal. Semenjak dari dalam kandungan spermatozoa. Proses ini berlangsung di
sampai masa pubertas nanti, sel-sel dalam testis lebih kurang selama 64 hari,
germinal primordial ini akan mengalami fase dimana sebenarnya spermatozoa yang
istirahat, sampai suatu saat ketika lumen terbentuk adalah sekitar 300 juta sel
14
tubulus seminiferus telah sempurna dibentuk spermatoza baru setiap hari.
pada pubertas, mereka akan berdiferensiasi
menjadi spermatogonia. Spermatogonia II. Struktur Spermatozoa
terdiri atas 2 tipe yaitu spermatogonia tipe A Spermatozoa merupakan sel yang sangat
12,13
dan spermatogonia tipe B. terspesialisasi dan padat yang tidak lagi
Spermatogonia tipe A adalah spermatogonia mengalami pembelahan atau pertumbuhan,
awal yang dibentuk. Seiring perkembangan berasal dari gonosit yang menjadi
ilmu pengetahuan, saat ini diketahui bahwa spermatogonium, spermatosit primer dan
spermatogonia tipe A ini akan mengalami sekunder dan selanjutnya berubah menjadi
serangkaian fase pembelahan secara spermatid dan akhirnya berubah menjadi
mitosis, dan akhirnya membentuk spermatozoa. Spermatozoa terdiri atas dua
spermatogonia tipe B. Spermatogonia tipe B bagian fungsional yang penting yaitu kepala
13,14,15
ini kemudian yang akan bergerak ke lumen, dan ekor.
termodifikasi dan membesar membentuk Kepala spermatozoa bentuknya bulat telur
spermatosit primer. Spermatosit primer dengan ukuran panjang 5 mikron, diameter
nantinya akan semakin ke arah lumen 3 mikron dan tebal 2 mikron yang terutama
sambil membelah secara miosis menjadi dibentuk oleh nukleus yang mengandung
spermatosit sekunder. Pada fase miosis informasi genetik sifat penurunan ayah
pertama, proses yang berlangsung cukup dalam molekul DNA. Pada bagian anterior
lama adalah pada tahap profase I, yakni kepala spermatozoa terdapat akrosom,
sekitar 22 hari. Sedangkan proses suatu struktur yang berbentuk topi yang
selanjutnya yakni metafase, anafase dan menutupi dua per tiga bagian anterior
telofase berlangsung dengan cepat. Setelah kepala dan mengandung sejumlah enzim
terbentuk spermatosit sekunder, alamiahnya hidrolitik. Enzim tesebut terdiri dari;
ia akan langsung membelah kembali secara hialuronidase, akrosin, dan Corona
miosis (miosis II) menjadi spermatid. Penetrating Enzim (CPE) yang semuanya
Spermatid yang dihasilkan sekarang telah penting untuk penembusan ovum (sel telur)
13,14,15
haploid, atau memiliki setengah dari pada proses fertilisasi.

89
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

Ekor dibedakan atas 3 bagian yaitu bagian komposisi protamin lebih dominan
16
tengah (midpiece), bagian utama (principle dibandingkan dengan histon.
piece) dan bagian ujung (endpiece). Komposisi protamin yang lebih dominan
Panjang ekor seluruhnya sekitar 55 mikron dibandingkan dengan histon pada sel
dengan diameter yang makin ke ujung sperma disebabkan oleh adanya proses
makin kecil: di depan 1 mikron, di ujung 0,1 pergantian histon menjadi protamin pada
mikron. Panjang bagian tengah: 5-7 mikron, saat spermiogenesis yang diregulasi melalui
17
tebal 1 mikron; bagian utama panjang 45 proses epigenetik. Epigenetik merupakan
mikron, tebal 0,5 mikron dan bagian ujung suatu proses yang ikut meregulasi
panjang 4-5 mikron, tebal 0,3 mikron. perubahan fenotip atau ekspresi genetik
Bagian ekor tidak bisa dibedakan dengan melalui perubahan pada struktur DNA dan
mikroskop cahaya tetapi harus dengan histon yang tidak menyebabkan perubahan
13,14,15
mikroskop elektron. pada sekuens DNA. Mekanisme epigenetik
Pada bagian midpiece sperma, dijumpai dapat melalui proses metilasi DNA atau
2
adanya struktur mitokondria yang berfungsi modifikasi histon. Pada spermatogenesis,
sebagai pembangkit energi pada histon mengalami modifikasi posttranslasi
spermatozoa. Bagian principle piece sperma yang mengubah interaksi histon dengan
dibungkus oleh sarung fibrous (fibrous DNA dan protein lain dalam inti sel.
sheath) yang perbatasannya disebut Modifikasi tersebut merupakan suatu
anulus. Sarung fibrous bentuknya terdiri mekanisme epigenetik melalui proses
dari kolom ventral dan dorsal yang masing- metilasi, fosforilasi, ataupun ubiquitinasi.
masing melalui rusuk-rusuk. Ke arah sentral Kombinasi-kombinasi yang terjadi dari
ada semacam tonjolan yang memegangi modifikasi lima protein penyusun histon
cincin nomor 3, 8 dari aksonema. Keduanya tersebut oleh para peneliti diduga menjadi
(tahanan rusuk dan pegangan cincin suatu kode histon yang berperan dalam
aksonema) memberikan gerak tertentu. beberapa proses biologis seperti regulasi
13,14,15
gen, kondensasi kromosom, dan juga
spermatogenesis.
III. Kromatin Sperma Manusia Dalam proses spermatogenesis terdapat
Kromatin sperma manusia memiliki struktur serangkaian modifikasi histon mulai dari
terorganisasi yang tersusun dari DNA dan fase meiosis sampai dengan fase
nukleoprotein yang heterogen. Salah satu spermiogenesis. Pada fase miosis, terjadi
aspek yang membedakan kromatin sperma metilasi, fosforilasi, ataupun ubiquitinasi
dengan kromatin sel somatik adalah dengan bantuan enzim spesifik pada lokasi
komposisi protamin dan histon yang menjadi tertentu dari kompleks histon. Selanjutnya
salah satu komponen nukleoprotein dari histon tersebut akan digantikan oleh histon
kromatin. Pada kromatin sel somatik, yang spesifik pada testis (H1-t, H3-t, H2A-t,
komposisi histon lebih banyak dibandingkan H2B-t, H2A-x, dan H3.3) selama proses
protamin sedangkan pada kromatin sperma, meiosis. Hiperasetilasi dari varian histon H4

90
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

23
(H4-t) menjadi faktor kunci terjadinya oleh mekanisme epigenetik. Protamin ini
relaksasi pengemasan DNA akibat akan mengemas DNA sperma secara
menurunnya stabilitas ikatan antara histon optimal sehingga terjadi peningkatan
dan DNA yang selanjutnya memfasilitasi kondensasi kromatin yang akan melindungi
pertukaran histon yang spesifik pada testis integritas genetik genom paternal dari enzim
menjadi protein transisi (TP1 dan TP2), nuklease, mutagen, dan faktor lain yang
sedangkan enzim topoisomerase 1 dapat merusak DNA selama proses transpor
mengurangi daya torsi dengan memecah dari saluran reproduksi pria ke saluran
24
untaian ganda sehingga selanjutnya reproduksi wanita.
protamin akan menggantikan protein transisi Pada beberapa penelitian menunjukkan
mengemas untaian DNA menjadi lebih bahwa kegagalan pergantian histon menjadi
kompak enam kali lipat dibandingkan pada protamin pada proses spermatogenesis dan
3
nukleosom somatik. kepadatan kromatin yang tidak optimal pada
Protein histon yang merupakan protein sperma berhubungan dengan terjadinya
5,6,7,8,9
dasar yang kaya akan residu lisin dan infertilitas pada pria.
arginin serta terdiri atas lima macam protein
yaitu H1, H2A, H2B, H3, dan H4. Protein IV. Evaluasi Kromatin Sperma
histon tersebut digunakan untuk Pemeriksaan integritas DNA sperma telah
menggulung molekul DNA sehingga menjadi umum dilakukan sebagai pemeriksaan
struktur lebih padat dimana dalam satu tambahan untuk menunjang pemeriksaan
gulungan molekul DNA terdapat kompleks analisis semen dalam menegakkan
histon yang tersusun atas satu molekul H1 diagnosa etiologi dari infertilitas pria. Banyak
dan masing-masing dua molekul H2A, H2B, teknik yang dapat dilakukan untuk
18
H3, dan H4. pemeriksaan integritas DNA, namum semua
Protamin merupakan protein dasar pada pemeriksaan tersebut pada umumnya
nukleus sperma yang tersusun atas 100 membutuhkan peralatan dan biaya yang
asam amino memiliki karakteristik kaya akan cukup mahal. Dari pemeriksaan integritas
19,20
residu arginin dan sistein Kandungan DNA, dapat diketahui tingkat fragmentasi
arginin yang tinggi ini menyebabkan ikatan pada DNA sperma yang selanjutnya akan
protamin dengan DNA menjadi sangat kuat mempengaruhi kualitas sperma.
20,21
pada gugus fosfatnya. Residu sistein Berdasarkan uraian sebelumnya, bahwa
memfasilitasi pembentukan ikatan disulfida integritas DNA pada sperma dilindungi oleh
antara protamin yang satu dengan yang lain kromatin sperma, sehingga secara teori
dan ikatan disulfida intra protamin untuk integritas DNA memiliki korelasi dengan
mengemas kromatin secara optimal kualitas kromatin sperma. Pemeriksaan
sehingga dapat menunjang fungsi sperma kualitas kromatin sperma terdiri atas
22
yang normal. Pada sperma manusia, 85% pemeriksaan kematangan kromatin dan
histon akan digantikan oleh protamin dalam kepadatan kromatin sperma. Pemeriksaan
proses spermatogenesis yang diregulasi kematangan kromatin sperma yang banyak

91
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

digunakan dalam penelitian adalah mengandung protamin yang kaya akan

pemeriksaan sperma dengan pewarnaan residu sistein sehingga akan memberikan
25 25
biru anilin , sedangkan pemeriksaan reaksi negatif pada pewarnaan biru anilin.
kepadatan kromatin sperma yang banyak Pada pewarnaan sperma dengan biru anilin,
digunakan dalam penelitian adalah adapun bahan-bahan yang diperlukan
pemeriksaan sperma dengan pewarnaan antara lain; larutan glutaraldehid 3%, larutan
25,26
biru toluidin . Kedua teknik pemeriksaan phosphat buffer saline (PBS), serta zat
ini banyak digunakan karena memerlukan warna biru anilin 5% (pH 3,5). Untuk
peralatan yang sederhana, praktis dalam glutaraldehid 3% dibuat dengan cara
pelaksanaannya, dan memerlukan biaya melarutkan tiga ml larutan glutaraldehid
27,28,29
yang tidak mahal. dalam larutan PBS hingga volume total
larutannya menjadi 100 ml. Untuk
V. Pewarnaan Biru Anilin pembuatan larutan pewarnaan biru anilin
Pewarnaan biru anilin merupakan suatu 5% (pH 3,5) dibuat dengan cara
teknik pewarnaan yang telah banyak menimbang satu gram biru anilin lalu
digunakan dalam bidang biologi. Dalam dilarutkan dalam larutan PBS sampai
aplikasinya, pewarnaan biru anilin telah volume total larutannya menjadi 20 ml.
digunakan untuk beberapa pewarnaan, Selanjutnya larutan dipanaskan sampai
diantaranya adalah untuk pewarnanaan bubuk biru anilin larut lalu setelah itu
jaringan tulang rawan, mitokondria, telur disaring dengan kertas saring. Selanjutnya
kutu, dan sedimen urin. Zat warna biru larutan biru anilin ini diatur pH nya sampai
anilin merupakan zat warna dari kelas 3,5 dengan penambahan asam asetat
31
tripenilmetan yang larut dalam air dan etanol glasial.
serta memiliki bentuk fisik berupa bubuk Adapun cara kerja pewarnaan sperma
berwarna biru tua. Zat warna ini memiliki dengan biru anilin adalah dimulai dengan
rumus molekul C37H27N3Na2O9S3 dengan membiarkan semen yang baru diejakulasi
30
berat molekul 799,80. Zat warna ini juga selama 30-60 menit untuk mencapai
digunakan untuk pewarnaan sperma dengan likuifaksi yang sempurna. Setelah
tujuan untuk mengidentifikasi kematangan mengalami likuifaksi sempurna, cairan
kromatin sperma. Prinsip pewarnaan biru semen dibuat sediaan hapus pada slide
anilin pada sperma adalah membedakan mikroskop. Selanjutnya sediaan hapus
nukleus sperma yang mengandung kromatin difiksasi dengan larutan Glutaraldehyde 3%
matang dengan yang tidak matang. Nukleus dalam PBS selama 30 menit. Setelah itu,
sperma dengan kromatin yang tidak matang, sediaan hapus dicelupkan dua kali dalam
mengandung banyak histon yang kaya akan larutan PBS selama lima menit lalu
residu lisin sehingga akan memberikan dikeringkan di udara. Setelah kering,
reaksi positif dengan pewarnaan biru anilin, sediaan hapus diwarnai dengan larutan biru
sedangkan nukleus sperma dengan anilin (pH 3,5) dan biarkan selama tujuh
kromatin yang matang, lebih banyak menit. Selanjutnya sediaan hapus yang

92
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

telah diwarnai, dibilas dengan larutan PBS hasil yang tidak seragam. Dari penelitian
dan dikeringkan di udara bebas. Setelah itu, Franken dkk (1999) yang mengevaluasi
preparat di pasang cover glass morfologi sperma dengan kematangan
menggunakan enthelan. Selanjutnya khromatin menggunakan pewarnaan biru
31
preparat siap untuk diperiksa. anilin yang hasilnya menunjukkan bahwa
Pemeriksaan preparat dilakukan dengan persentase teratozoospermia yang tercat
menggunakan mikroskop cahaya dengan dengan anilin blue (51%) lebih tinggi
perbesaran 100 kali. Pengamatan dilakukan dibandingkan yang normozoospermia
34
dengan mengamati warna kepala sel (26%). Namun dari beberapa penelitian
sperma secara random dari 200 sperma. yang lain menunjukkan bahwa tidak ada
Kepala sperma yang kromatinnya matur korelasi antara parameter analisis semen
25
akan berwarna jernih (tidak terwarnai) dengan hasil pemeriksaan biru anilin.
sedangkan kepala sperma yang Berdasarkan penelitian Hammadeh dkk
31
kromatinnya immatur akan berwarna biru. (1998) yang meneliti hubungan kematangan
Setelah dihitung lalu ditentukan kromatin sperma dengan tingkat fertilisasi,
persentasenya masing-masing. Untuk pembelahan sel, dan kehamilan pada
mengurangi subjektifitas, pengamatan program IVF menunjukkan bahwa hasil
dilakukan oleh dua orang yang hasil pemeriksaan biru anilin memiliki korelasi
persentasenya kemudian dirata-ratakan. yang signifikan dengan tingkat kehamilan
Untuk penilaian semen yang normal, kepala sehingga dapat dijadikan sebagai indikator
sperma yang mengandung kromatin matang dalam memprediksi keberhasilan kehamilan
25,35
(tidak terwarnai) meliputi minimal 75% dari dalam program IVF.
200 sperma yang diamati sedangkan kepala
sperma yang mengandung kromatin tidak VI. Pewarnaan Biru Toluidin
matang (berwarna biru) meliputi maksimal Pewarnaan biru toluidin merupakan suatu
32
25% dari 200 sperma yang diamati. teknik pewarnaan yang juga telah banyak
Berdasarkan penelitian Foresta dkk (1992) digunakan dalam bidang biologi. Dalam
yang meneliti abnormalitas histon yang aplikasinya, pewarnaan biru toluidin telah
persisten pada sperma pria infertil digunakan untuk beberapa pewarnaan,
menggunakan pewarnaan biru anilin yang diantaranya adalah untuk pewarnanaan
hasilnya menunjukkan bahwa pemeriksaan ekspresi gen, sel saraf, lesi pada mulut, sel
30
biru anilin ini dapat memproyeksikan ginjal, dan sputum. Zat warna biru anilin
hubungan antara abnormalitas kromatin merupakan zat warna dari golongan
25,33
sperma dengan infertilitas pada pria. fenotiazin yang larut dalam air dan etanol
Hubungan antara hasil pemeriksaan biru serta memiliki bentuk fisik berupa bubuk
anilin dengan parameter analisis semen berwarna hijau gelap. Zat warna ini memiliki
(motilitas, konsentrasi, dan morfologi) masih rumus molekul C15H16CIN3S dengan berat
30
kontroversial, karena dari beberapa molekul 305,83. Zat warna ini juga
penelitian terkait hal tersebut memberikan digunakan untuk pewarnaan sperma dengan

93
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

tujuan untuk mengidentifikasi kepadatan lima menit. Selanjutnya, sediaan hapus

kromatin sperma. Prinsip pewarnaan biru dibilas tiga kali menggunakan air suling
toluidin adalah zat warna biru toluidin akan masing-masing selama dua menit dan
diikat oleh gugus phosphat dari untaian DNA dibiarkan mengering di udara. Setelah
sperma yang memiliki kepadatan kromatin kering, sediaan hapus diwarnai dengan
yang kurang baik. Sedangkan sperma yang larutan biru toluidin 0,05% dan biarkan
memiliki kepadatan kromatin yang baik akan selama 10 menit. Selanjutnya sediaan
terwarnai minimal atau tidak terwarnai oleh hapus yang telah diwarnai, dibilas dengan
26
zat warna biru toluidin. air suling lalu didehidrasi menggunakan t-
Pada pewarnaan sperma dengan biru butanol sebanyak dua kali masing-masing
0
toluidin, adapun bahan-bahan yang selama tiga menit pada suhu 37 C untuk
diperlukan antara lain; etanol 96%, larutan selanjutnya dicelupkan dalam larutan xylol
aceton, larutan HCl 0,1 N, larutan biru sebanyak dua kali selama tiga menit.
toluidin 0,05% dimana buffer biru toluidin Setelah kering, preparat kemudian ditutup
terdiri dari 50% phosphate sitrat (McIlvain dengan cover glass menggunakan enthelan
31
buffer, pH 3,5), larutan t-butanol, dan Xylol. untuk selanjutnya dilakukan pemeriksaan.
Larutan HCl 0,1 N dibuat dengan cara Pemeriksaan preparat dilakukan dengan
melarutkan 1,7 ml HCl pekat dalam larutan menggunakan mikroskop cahaya dengan
akuades hingga volume totalnya menjadi perbesaran 100 kali. Pengamatan dilakukan
200 ml. Larutan biru toluidin dibuat dengan dengan mengamati warna kepala sel
cara menimbang 0,01 gram biru toluidin lalu sperma secara random dari 200 sperma.
dilarutkan dalam campuran larutan buffer Kepala sperma yang kepadatan
hingga volume totalnya menjadi 20 ml. kromatinnya baik akan berwarna biru terang
Larutan buffer biru toluidin dibuat dengan atau jernih sedangkan kepala sperma yang
cara mencampurkan larutan akuades dan memiliki kepadatan kromatin yang kurang
31
McIlvain buffer ( pH 3,5) dengan baik akan berwarna ungu atau violet.
31
perbandingan 1:1. Setelah dihitung lalu ditentukan
Adapun cara kerja pewarnaan sperma persentasenya masing-masing. Untuk
dengan biru toluidin adalah dimulai dengan mengurangi subjektifitas, pengamatan
membiarkan semen yang baru diejakulasi dilakukan oleh dua orang yang hasil
selama 30-60 menit untuk mencapai persentasenya kemudian dirata-ratakan.
likuifaksi yang sempurna. Setelah Untuk penilaian semen yang normal, kepala
mengalami likuifaksi sempurna, cairan sperma yang mengandung kepadatan
semen dibuat sediaan hapus pada slide kromatin yang baik (berwarna biru terang
mikroskop. Selanjutnya sediaan hapus atau jernih) meliputi minimal 65% dari 200
difiksasi dengan larutan etanol 96% - aseton sperma yang diamati sedangkan kepala
0
(1:1) pada suhu 4 C selama 30 menit. sperma yang mengandung kepadatan
Setelah itu, sediaan hapus dihidrolisa dalam kromatin yang kurang baik (berwarna biru
0
larutan 0,1 N HCl pada suhu 4 C selama

94
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

gelap atau ungu) meliputi kurang 35% dari acridine orange) dengan hasil pemeriksaan
36
200 sperma yang diamati. pengecatan biru toluidin sehingga
Berdasarkan penelitian Erenpreiss dkk pemeriksaan ini juga dapat digunakan untuk
(2009) yang mengevaluasi pewarnaan biru melihat integritas DNA dengan teknik yang
toluidin pada sperma pria yang fertil dan pria lebih simpel dan biaya yang lebih murah
yang infertil menunjukkan hasil bahwa dibandingkan dengan pemeriksaan
36,37
terdapat perbedaan yang signifikan antara integritas DNA lainnya.
kelompok pria yang fertil dengan kelompok
pria yang infertil berdasarkan hasil KESIMPULAN
pemeriksaan biru toluidin tersebut sehingga Aspek kromatin sperma saat ini belum
disimpulkan bahwa pemeriksaan biru menjadi salah satu parameter dalam
toluidin ini dapat digunakan untuk menentukan fertilitas pria sedangkan dari
pemeriksaan tambahan dalam menegakkan beberapa penelitian menunjukkan bahwa
26
diagnosa infertilitas pada pria. abnormalitas pada kromatin sperma dapat
Berdasarkan penelitian Erenpreisa dkk menyebabkan infertilitas pada pria. Dari
(2002) serta Erenpreiss dkk (2004) yang beberapa penelitian juga menunjukkan
meneliti hubungan antara beberapa bahwa pemeriksaan kualitas kromatin
pemeriksaan integritas DNA seperti SCSA, sperma sangat dianjurkan untuk melengkapi
tes TUNEL, dan tes acridine orange dengan pemeriksaan analisis semen dalam
hasil pemeriksaan pengecatan biru toluidin pemeriksaan fertilitas pria terutama pada
ternyata menunjukkan adanya korelasi yang kasus infertilitas pria yang tidak dapat
signifikan antara hasil pemeriksaan dijelaskan.
integritas DNA (SCSA, tes TUNEL, dan tes

DAFTAR PUSTAKA

1. Hamada Alaa, Esteves SC, Agarwal A. Unexplained male infertility: potensial causes and
management. Human Andrology. 2011.p.2-16.
2. Rajender Singh, Avery Kelsey, Agarwal Ashok. Epigenetics, spermatogenesis and male infertility.
Mutation Research. 2011; 727. p.62-71.
3. Carrell DT, Emery BR, Hammoud S. Altered protamine expression and diminished
spermatogenesis: what is the link?. Human Reproduction Update. 2007; 13(3). p. 313-327.
4. Zini A, Agarwal A. Sperm chromatin. Springer. New York. 2011. p. 29.
5. Aoki VW, Liu L, Carrell DT. Identification and evaluation of a novel sperm protamine abnormality in
a population of infertile males, Human Reproduction. 2005; 20. p. 12981306.
6. Aoki VW, Liu L, Emery BR, Carrell DT. Protamine levels vary between individual sperm cells of
infertile human males and correlate with viability and DNA Integrity, Journal of Andrology. 2006;
27(6). p. 890898.

95
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

7. Hekmatdoost Azita dkk. Sperm chromatin integrity: etiologies and mechanisms of abnormality,
assays, clinical importance, preventing and repairing damage. Avicenna Journal of Medical
Biotechnology. 2009; 1(3). p. 147-160.
8. Tsarev I dkk. Evaluation of male fertility potential by toluidine blue test for sperm chromatin
structure assessment. Human Reproduction. 2009; 24 (7). p. 1569-1574.
9. Erenpreiss J dkk. Toluidine blue cytometry test for sperm DNA conformation: comparison with the
flow cytometric sperm chromatin structure and TUNEL assays. Human Reproduction. 2004; 19
(10). p. 2277-2282.
10. Olivia Rafael. Protamines and male infertility. Human Reproduction. 2006; 12 (4). p. 417-435.
11. Golan R dkk. Evaluation of chromatin condensation in human spermatozoa:a flow cytometric assay
using acridine orange staining. Molecular Human Reproduction . 1997; 3(1). p.47-54.
12. Arey LB. Developmental anatomy. A textbook and laboratory manual of embryology. W.B.
Saunders Company. Philadelphia. 1957.
nd
13. Nieschlag E, Behre H M, Andrology male reproductive health and dysfungtion. 3 Ed. Springer.
New York. 2010. p. 16-21.
th
14. Campbell N A, Reece J B, Urry L A, et all. Biology. 8 Ed. Pearson Benjamin Cummings. San
Francisco. 2008.
th
15. Alberts Bruce, Jhonson Alexander, Lewis Julian, et all. Molecular biology of the cell. 5 Ed. Garland
Science. United States of America. 2008.
16. Corzett M, Mazrimas J and Balhorn R. Protamine 1: protamine 2 stoichiometry in the sperm of
eutherian mammals. Molecular Reproduction Dev. 2002(61). p.519527.
17. Sassone-Corsi P. Unique chromatin remodeling and transcriptional regulation in spermatogenesis.
Science. 2002( 296).p.21762178.
18. Yuwono T. Biologi molekular. Erlangga. Jakarta. 2005.
19. Kasinsky HE dkk. Protamines: structural complexity, evolution and chromatin patterning. Protein &
Peptide Letters. 2011(18). p. 755-771.
20. Balhorn R, Brewer L and Corzett M. DNA condensation by protamine and arginine-rich peptides:
analysis of toroid stability using single DNA molecules. Molecular Reproduction Dev. 2000(56). p.
230234.
21. Le Lannic G, Arkhis A, Vendrely E, Chevaillier P and Dadoune JP. Production, characterization,
and immunocytochemical applications of monoclonal antibodies to human sperm protamines.
Molecular Reproduction Dev. 1993(36). p.106112.
22. Steger K. Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids.
Anatomy Embryology (Berl). 1999(199). p. 471487.
23. Oliva R and Dixon GH. Vertebrate protamine gene evolution I. Sequence alignments and gene
structure. Journal Molecular. 1990(30). p. 333346.
24. Shoukir Y, Campana A, Farley T, Sakkas D. Early cleavage of in vitro fertilized human embryos to
the 2-cell stage:a novel indicator of embrio quality and viability. Human Reproduction. 1997 (12).
p.1531-1536.
25. Agarwal A, Erenpreiss J, Sharma R. Sperm chromatin assessment. In Textbook of assissted
th
reproductive technologies laboratory and clinical perspectives. 3 Ed. Informa. United Kingdom.
2009.

96
JMJ, Volume 2, Nomor 1, Mei 2014, Hal: 87 - 97 Ahmad Syauqy, Evaluasi Kromatin Sperma...

26. Tsarev I dkk. Evaluation of male fertility potential by toluidine blue test for sperm chromatin
structure assessment. Human Reproduction. 2009; 1(1).p. 1-6.Sevilla2006.
27. Lamirande E, Gabriel MS, Zini A. Human sperm chromatin undergoes physiological remodeling
during in vitro capacitation and acrosome reaction. Journal of Andrology. 2012;33(5). p. 1025-1035.
28. Hammadeh ME, Stieber M, Haidl G, Schmidt W. Association between sperm cell chromatin
condensation, morphology based on strict criteria, and fertilization, cleavage and pregnancy rates in
an IVF program. Andrologia. 1998;30. p. 29-35.
29. Erenpreiss Juris dkk. Sperm chromatin structure and male fertility:biological and clinical aspects.
Asian Journal Andrology. 2006;8(1). p. 11-29
30. Sabnis RW. Handbook of biological dyes and stains. Jhon Wiley & Sons Inc. New Jersey.2010.
31. Erenpreiss Juris dkk. Comparative study of cytochemical tests for sperm chromatin integrity.
Journal of Andrology. 2001; 22(1). p. 45-53.
32. Hammadeh ME dkk. The effect of chromatin condensation (aniline blue staining) and morphology
(strict criteria) of human spermatozoa on fertilization, cleavage and pregnancy rates in an
intracytoplasmic sperm injection programme. Human Reproduction. 1996;11(11). p. 2468-2471.
33. Foresta C, Zorzi M, Rossato M dkk. Sperm nuclear instability and staining with aniline blue:
abnormal persistence of histones in spermatozoa in infertile men. Int J Androl. 1992;15. p. 330
337.
34. Franken DR, Franken CJ, de la Guerre H, de Villiers A. Normal sperm morphology and chromatin
packaging: comparison between aniline blue and chromomycin A3 staining. Andrologia. 1999;
31(6). p. 361366.
35. Hammadeh ME, Stieber M, Haidl G, Schmidt W. Association between sperm cell chromatin
condensation, morphology based on strict criteria, and fertilization, cleavage and pregnancy rates in
an IVF program. Andrologia. 1998;30. p. 29-35.
36. Erenpreisa Jekaterina dkk. Toluidine blue test for sperm DNA integrity and elaboration of image
cytometry algorithm. Wiley Interscience. 2003;52. p. 19-27.
37. Erenpreiss J dkk. Toluidine blue cytometry test for sperm DNA conformation: comparison with the
flow cytometric sperm chromatin structure and TUNEL assays. Human Reproduction. 2004; 19(10).
p.2277-2282.

97