SOAL-SOAL HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Nama : Fadhila Ulfa (1507123685)

Geo Rayfandy (1507123614)
Program Studi : Teknik Kimia S1-C

I. PILIHAN BERGANDA
1. Salah satu jenis kromatografi dimana fase gerak berupa cairan dan menggunakan pompa tekanan
tinggi/high pressure untuk peningkatan efisiensi pemisahan disebut....
a. HPLC
b. HLPC
c. Kromatografi gas
d. Kromatografi kertas
e. Kromatografi lapis tipis
2. Dibawah ini yang merupakan instrumen-instrumen HPLC, kecuali....
a. Kolom
b. Reservoir
c. Pompa
d. Injektor
e. nyala
3. Dibawah ini yang merupakan jenis-jenis HPLC adalah....
a. Kromatografi Adsorbsi
b. Kromatografi penukar ion
c. Kromatografi pasangan ion
d. Kromatografi afinitas
e. Semua benar
4. Karakteristik detektor yang benar adalah....
a. Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
b. Mudah digunakan
c. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier).
d. Keberulangan tinggi
e. Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
5. Prinsip pemisahan KCKT didasarkan pada perbedaan....
a. Warna zat
b. Polaritas
c. Kelarutan
d. Bau zat
e. Kekentalan
6. Dibawah ini urutan skala polaritas yang benar adalah....
a. golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter
< golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam
b. golongan fluorocarbon < golongan hidrocarbon < senyawa terhalogenasi < golongan ester <
golongan eter < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
c. golongan hidrocarbon < golongan fluorocarbon < senyawa terhalogenasi < golongan ester <
golongan eter < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
d. golongan fluorocarbon < golongan hidrocabon< senyawa terhalogenasi < golongan ester <
golongan keton< golongan alkohol < golongan asam.
e. golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter <
golongan keton < golongan alkohol < golongan asam< golongan ester.
7. Keunggulan KCKT dibandingkan dengan kromatografi lainnya adalah kecuali....
a. Simultan
b. Sampel sedikit
 c. Cepat
d. Sampel banyak
e. Teliti
8. Dibawah ini yang merupakan persyaratan fase gerak HPLC adalah kecuali....
a. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
b. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatografi.
c. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
d. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
e. Zat cair yang digunakan harus kental.
9. HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-polar disebut dengan HPLC
fase....
a. Diam
b. Lurus
c. Normal
d. Bergerak
e. Terbalik
10. Pompa yang digunakan sebagai instrumen HPLC adalah....
a. Pompa reciprocating
b. Pompa displacemen
c. Pompa pneumatic
d. a dan b benar
e. semua benar
11. Apa keunggulan utama dari HPLC....
a. Resolusi rendah
b. Lambat
c. Sensitivitas detektor tinggi
d. Kolom yang tidak dapat digunakan lagi
e. Tidak Luwes
12. Komponen dasar HPLC, kecuali....
a. Eluen
b. Pompa
c. Injektor
d. Monokromator
e. detektor
13. Ada 4 jenis detektor pada HPLC, kecuali....
a. detektor infrared
b. detektor fluoresensi
c. detektor ultraviolet
d. detektor indeks refraksi
e. detektor diode array
14. Metode detektor HPLC yang umum dipakai & mudah untuk menjelaskan yaitu....
a. Penggunaan detektor fluoresensi
b. penggunaan detektor serapan ultra-violet (UVD)
c. penggunaan detektor indeks refraksi
d. penggunaan detektordiode array
e. A dan C benar
15. Sampel yang dapat dianalisis dengan HPLC adalah kecuali....
a. Asam amino
b. Asam nukleat
c. Hidrokarbon aromatik
d. Protein
e. Asam organik
16. Yang termasuk Ciri-ciri detektor yang baik dibawah ini adalah....
 a. memiliki sensitifitas yang rendah
b. gangguan (noise) yang rendah,
c. waktu respon pendek sehingga bergantung kecepatan alir
d. stabilitas dan keterulangan tinggi
e. waktu respon yang panjang
17. Sampel yang dapat dianalisa dengan HPLC kecuali....
a. Anion anorganik
b. Hidrokarbon aromatik
c. Logam
d. Sirup jagung
e. Anion organik
18. 2 fasa yang terdapat pada penggunaan HPLC adalah…
a. Fasa berdiri dan Fasa duduk
b. Fasa gerak dan Fasa diam
c. Fasa mobile dan Fasa gerak
d. Fasa diam dan Fasa duduk
e. Fasa mobile dan fasa diam
19. Berikut ini urutan alat dalam proses kerja HPLC adalah…
a. Solvent reservoir → Pump → Sample Injection → HPLC tube → Detector →Processing
Unit and Display
b. Solvent reservoir → Sample Injection → Pump → HPLC tube → Detector →Processing
Unit and Display
c. Solvent reservoir → Sample Injection → HPLC tube → Pump → Detector →Processing
Unit and Display
d. Solvent reservoir → Detector → Pump → HPLC tube → Sample Injection →Processing
Unit and Display
e. Solvent reservoir → Detector → Pump → Sample Injection→ HPLC tube →Processing Unit
and Display
20. Yang dimaksud dengan eluen pada HPLC adalah…
a. Fase Stasioner
b. Fase Mobile
c. Absorban
d. Panjang gelombang
e. kuvet
21. Sifat umum fase gerak pada HPLC adalah, kecuali…
a. Murni
b. Berwarna
c. Sesuai dengan detector
d. Viskositas rendah
e. Faktor penentu keberhasilan pemisahan
22. Pernyataan berikut yang benar mengenai HPLC adalah....
a. HPLC dapat dipakai untuk sebagian besar senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu
HPLC
b. HPLC biasanya tidak dapat dilakukan pada suhu kamar
c. Dalam HPLC, untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan tidak
bergantung pada komposisi yang tepat dari pelarut dan temperatur pada kolom
d. HPLC merupakan jenis kromatografi gas
e. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar tidak dapat
dipisahkan dengan HPLC.
23. Berikut ini urutan dari bagian-bagian HPLC....
a. Reservoir – pump – column – injector – detector – recorder
b. Reservoir – pump – injector – column –detector – recorder
c. Reservoir – pump – column – detector - injector – recorder
d. Reservoir – column – pump – injector – detector – recorder
 e. Reservoir-column-injector-pump-recorder-detector
24. Penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil ke dalam kolom merupakan ciri-ciri....
a. GC
b. HPLC
c. AAS
d. spektrostroskopi UV-VIS
e. inframerah
25. Berikut ini pernyataan untuk injector pada HPLC, kecuali....
a. Injector digunakan untuk memasukkan sampel.
b. Pada alat HPLC biasanya dilengkapi dengan penyampel otomatis (automatic sampler).
c. Injektor dapat bekerja tekanan balik
d. Penyampel otomatis dapat diprogram untuk mereaksikan atau menginjeksikan sampel.
e. Injektor tidak dapat bekerja pada tekanan balik
26. Beberapa sifat fase gerak yang digunakan pada HPLC adalah, kecuali....
a. Murni, tidak terdapat kontaminan
b. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)
c. Memiliki visikositas yang tinggi
d. Luwes
e. Sesuai dengan detector
27. Dasar pemisahan LLC dari HPLC adalah....

a. Absorbsi
b. Adsorbsi
c. Partisi
d. pertukaran ion filtrasi gel
e. Absorban
28. Dasar pemisahan LSC dari HPLC adalah....
a. Absorbsi
b. Absorbansi
c. Partisi
d. pertukaran ion filtrasi gel
e. kepolaran
29. Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya HPLC dibagi menjadi ?

a. Fase gerak dan fase diam

b. Fase mobil dan fase stasioner
c. Fase normal dan fase terbalik
d. Fase terbalik dan fase stasioner
e. Fase diam dan fasa stasioner
30. Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan,kecuali....
a. Syring
b. Loop valve
c. Septum
d. Stop – flow
e. Semua benar
Untul menyelesaikan soal nomor 31 dan 32 lihat gambar di bawah ini!
31. Apa nama bagian dari HPLC no 1 dan 4 yang di
tunjukkan oleh gambar?

a. Detektor dan injektor

b. Injektor dan recorder
c. Reservoir dan detektor
d. Injektor dan pump
e. Pump dan column
32. Apa nama bagian dari HPLC no 2 dan 5 yang di tunjukkan oleh gambar?

a. Detektor dan injektor

b. Reservoir dan detektor
c. Reservoir dan pum
d. Injektor dan pump
e. Pump dan column
33. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada, kecuali....
a. Tekanan yang digunakan
b. Temperatur pada kolom
c. Kelarutan
d. Komposisi yang tepat pada pelarut
e. a dan b salah
34. Bagian HPLC yang berfungsi untuk merekam data adalah....

a. Injektor
b. Column
c. Detektor
d. Reservoir
e. Rekorder
35. Pada analisis HPLC, “puncak-puncak kromatogram” menunjukkan....
a. Gugus fungsi
b. Senyawa
c. Konsentrasi
d. Rumus senyawa
e. Kelarutan
36. Jika pemisahan meliputi suatu partisi sederhana antara fase diam cair dan fase gerak cair juga,
maka proses ini disebut …
a. kromatografi partisi
b. kromatografi cair
c. kromatografi flotasi
d. Kromatografi ionic
e. Kromatografi adsorbsi
37. Hasil percobaan pada analisis HPLC akan dicetak dalam bentuk kromatogram yang terlihat oleh
komputer pada instrument....
 a. Pompa
b. Injeksi
c. Kolom
d. Detector
e. Recorder
38. Untuk melaksanakan pemisahan secara kromatografi kolom ada 3 cara, yaitu …
a. Destilasi, ekstraksi dan presipitasi
b. Analisi frontal, penukar ion, dan presipitasi
c. Analisi frontal, analisis elusi dan pergeseran
d. Teknik ring oven, zone melting dan penukar ion
e. Dialisis, flotasi dan presipitasi
39. Dalam HPLC, fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju
detector, juga....
a. fasa gerak dapat berinteraksi dengan gas pembawa
b. fasa gerak dapat berinteraksi dengan fasa diam
c. fasa gerak dapat berinteraksi dengan fasa terbalik
d. fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut
e. fasa gerak dapat berinteraksi dengan eluen
40. Resolusi yang tinggi, waktu analisis pendek dan kepekaan di daerah ppm merupakan cirri-cii dari...
a. Kromatografi cair-padat
b. Kromatografi gas-cair
c. Kromatografi cair
d. Kromatografi gas
e. Kromatografi padat
41. Untuk memperoleh analisis kromatografi yang sempurna diperlukan pemilihan kondisi. Hal ini
dilakukan agar …
a. Luas peak semakin besar
b. Jumlah peak semakin banyak
c. Waktu retensinya tidk terlalu besar
d. Waktu tetesnsinya besar
e. Luas peak semakin kecil
42. Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya HPLC dibagi menjadi....
a. fase normal dan fase terbalik
b. fase diam dan fase terbalik
c. fase normal dan fase gerak
d. fase polar dan fase non-polar
e. fase diam dan fase polar
43. Berikut merupakan zat yang dapat dianalisis menggunakan HPLC, kecuali…

a. Protein
b. Lemak
c. Karbohidrat
d. Vitamin
44. Pada kromatografi, Diffusi Eddy timbul karena adanya …
a. Perbedaan aliran fasa gerak dalam kolom
b. Perbedaan aliran fasa gerak dalam detector
c. Perbedaan aliran fasa diam dalam kolom
d. Perbedaan aliran fasa diam dalam detector
e. Perbedaan aliran fasa gerak dalam injektor
45. Keunggulan dari analisis High Pressure Liquid Chrom (HPLC) adalah, kecuali:
a. Resolusi tinggi
b. Cepat
c. ideal untuk zat berberat molekul rendah dan berionik
d. teliti
 e. sensitivitas detector tinggi
46. Berapa tekanan yg didukung pada alat HPLC :
a. 1000 atm
b. 4 atm
c. 10 atm
d. 400 atm
e. 0,4 atm
47. Manakah pelarut yg lebih polar untuk fase mobile pada alat HPLC....
a. asam asetat
b. aseton
c. heksana
d. benzene
e. minyak
48. Komponen dasar peralatan HPLC terdiri dari, kecuali....
a. eluen/ fase mobil
b. detector
c. rekorder
d. injektor
e. flame
49. Alat HPLC sangat berguna untuk industri....
a. Industri minyak bumi
b. industri farmasi dan pestisida
c. industry makanan
d. industry tekstile
e. industri karet
50. Dibawah ini adalah keunggulan utama analisis HPLC, kecuali....
a. Resolusi tinggi
b. Cepat
c. Teliti
d. Lambat
e. Luwes
51. fase stationer (diam) pada HPLC berupa...
a. cair
b. padat
c. gas
d. gas dan cair
e. cair dan padat
52. Komponen peralatan HPLC berupa....
a. pompa, injector, dan kolom
b. eluen, kolom, dan detector
c. recorder dan kolom
d. eluen, pompa, injector, kolom, detector, dan recorder
e. Nyala, kuvet, monokromator, detector, recorder
53. Dibawah ini adalah jenis-jenis detector pada HPLC, kecuali....
a. detector ultraviolet
b. detector absorpsi
c. detector fluoresensi
d. detector indeks refraksi
e. detector diode array
54. Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detector, disebut....
a. waktu retensi
b. waktu absorpsi
c. waktu injeksi
d. waktu adsorpsi
e. waktu resensi
55. Yang termasuk bagian kromatografi adalah...
a. GC dan HPLC
b. IR dan HPLC
c. HPLS
d. UV VIS
e. Inframerah
56. Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama
kerjanya, yaitu....
a. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida.
b. Senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan ester.
c. Menentukan konsentrasi zat yang dianalisa
d. Penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
e. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam buah.
57. Komponen dasar peralatan HPLC terdiri dari, kecuali....
a. Reservoir
b. Monokromator
c. Detector
d. Rekorder
e. Injektor
58. Fungsi dari Gradien Controller/Solvent Reservoir pada HPLC adalah....
a. Untuk elusi gradien
b. Untuk mendeteksi komponen yang keluar dari kolom
c. Untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan kedalam kolom dengan bantuan
pompa
d. Untuk merekam data dan juga dilengkapi dengan pengolah data (data station) yang
dihubungkan dengan computer
e. Untuk menampilkan hasil analisa
59. Pernyataan berikut yang benar mengenai HPLC adalah:
a. Dapat dipakai untuk sebagian besar senyawa berbobot molekul tinggi. Selain itu HPLC
dapat dipakai untuk senyawa anorganik
b. HPLC biasanya tidak dapat dilakukan pada suhu kamar
c. Dalam HPLC, untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan tidak
bergantung pada komposisi yang tepat dari pelarut dan temperatur pada kolom
d. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar tidak dapat
dipisahkan dengan HPLC
e. Memiliki fasa mobile dan stationer
60. Penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom merupakan ciri-ciri....
a. GC
b. HPLC
c. AAS
d. Spektroskopi IR
e. Spektroskopi UV

61. Data dibawah ini

• Resolusi tinggi
• Cepat
• Sensitivitas detektor tinggi
• Kolom yang dapat digunakan kembali
• Ideal untuk zat berberat molekul tinggi dan berionik
Data diatas merupakan keuntungan dari....
a. IR
b. AAS
c. GC
 d. HPLC
e. Spektrofotometer
62. Dibawah ini Jenis-jenis detektor pada HPLC, kecuali....
a. Detektor Ultraviolet (UVD)
b. Detektor Fluoresensi (FD)
c. Detektor indeks refraksi (RID)
d. Detektor Diode Array (DAD)
e. Detektor defraksi
63. Dibawah ini yang merupakan Komponen dasar peralatan HPLC,kecuali....
a. pompa
b. injector
c. Kolom
d. Detector
e. buret
64. Berikut merupakan hal-hal yang mempengaruhi waktu retensi, kecuali...
a. Temperatur pada kolom
b. Tekanan yang digunakan
c. Komposisi yang tepat dari pelarut
d. Kondisi dari fase diam
e. Panjang gelombang

65. Berikut merupakan sifat umum fase gerak pada HPLC

i. Murni, tidak terdapat kontaminan
ii. Sesuai dengan injector
iii. Bereaksi dengan wadah (packing)
iv. Melarutkan sampel
v. Viskositas tinggi
vi. Memudahkan sample recovery
Yang termasuk kedalam sifat umum dari fase gerak pada HPLC adalah...
a. i, ii, dan iii
b. i, ii, dan iv
c. i, iv, dan vi
d. ii, iv, dan vi
e. ii, iii, dan v

66. Alat yang digunakan untuk memisahkan sampel dari komponen-komponennya pada HPLC
disebut...
a. Coloumn
b. Detector
c. Recorder
d. Injector
e. Reservoir

67. Pada proses kromatografi berdasarkan perbedaan distribusi senyawa penyusun campuran dengan
fasa, yaitu fasa….
a. Diam
b. stationer dan gerak
c. gas
d. gas dan padat
e. terbalik
68. Pemisahan sampel terjadi di dalam….
 a. Detektor
b. tempat injeksi
c. kolom
d. resolusi
e. recorder
69. HPLC termasuk kromatografi….
a. Gas
b. Padat
c. Gas-cair
d. Cair
e. Larutan
70. Luas peak menyatakan...
a. Konsentrasi
b. Volume
c. Massa
d. Panjang
e. Luas
II. ESSAI
1. Jelaskan apa yang dimaksud dengan HPLC?
HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan
pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi;
lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Penggunaan HPLC ( High
Performance Liquid Chromatography), dalam bidang kefarmasian yaitu HPLC Method for the
Analysis of Paracetamol, Cafeine and Dipyrone (Metode HPLC Untuk Analisis Parasetamol,
Kafein dan Antalgin). HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair – cair yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif
dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam
kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar.
2. Jelaskan prinsip kerja HPLC!
Prinsip kerja dari HPLC adalah suatu tekhnik yang mana solut atau zat terlarut terpisah
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Pemisahan solut-solut ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam.
3. Sebutkan kegunaan umum dari HPLC!
Kegunaan umum HPLC adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik,
maupun senyawa biologis ; analisis ketidakmurnian (impurities) ; analisis senyawa-senyawa
tidak menguap (non-volatil) ; penentuan molekul-molekul netral, ionik, maupun zwitter ion ;
isolasi dan pemurnian senyawa; pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama;
pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element), dalam jumlah banyak
dan dalam skala proses industri. HPLC merupakan metode yang tidak dekstruktif dan dapat
digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
4. Sebutkan instrument dari HPLC!
(1) Wadah fase gerak (Reservoir)
(2) Pompa
(3) Tempat Injeksi
(4) Kolom
(5) Detector
5. Buatlah bagan susunan alat HPLC!
6. Sebutkan aplikasi dari HPLC dalam kehidupan sehari-hari!
(1) HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
(2) Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat
dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
(3) Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
(4) Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
(5) Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
(6) Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
7. Sebutkan beberapa keuntungan dari HPLC!
(1) Dapat dilakukan pada suhu kamar.
(2) Kolom dan pelarut pengembang dapat digunakan berkali-kali.
(3) Detector HPLC dapat divariasi dan banyak jenisnya.
(4) Waktu analisis pada umumnya singkat.
(5) Ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi.
(6) Mudah dioperasikan secara otomatis.
8. Ada dua jenis kolom pada HPLC yaitu kolom komversional dan kolom
mikroboe. Sebutkan keuntungan kolom mikrobor dibandingkan kolom
konvensional!
(1) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mokrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat
(10-100 µL/menit )
(2) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika
digabung dengan spectrometer massa.
(3) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan Karena solute lebih pekat, Karena jenis kolom
ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misalnya sampai klinis
9. Apa yang dimaksud dengan waktu retensi pada HPLC ?
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom
menuju detector. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda.
10. Mengapa dalam fase balik HPLC senyawa-senyawa non polar dalam campuran
cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon ?
Karena adanya disperse vanderwalls, sehingga dalam pemutusan ikatan hidrogen akan
menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.
11. Sebutkan pengelompokan HPLC berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solute!
(1) Kromatografi Adsorbsi
(2) Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
(3) Kromatografi penukar ion
(4) Kromatografi Pasangan ion
(5) Kromatografi Eksklusi Ukuran
(6) Kromatografi Afinitas
12. Jelaskan Prinsip kerja kromatografi adsorbsi!
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar
90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai
reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
13. Jelaskan Prinsip kerja kromatografi fase terikat!
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau
fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-
hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam
yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau
asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau
basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut
akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini
menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam
bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi
lebih cepat.
14. Jelaskan apa yang mempengaruhi kekuatan pertukaran ion dalam kromatografi
penukar ion ?
Kekuatan pertukaran kation dipengaruhi oleh berbagai faktor, semakin besar muatan semakin
kuat kapasitas pertukaran. jumlah kation total yang dipertukarkan akan sebanding dengan
total ion hidrogen yang dilepaskan resin.
15. Sebutkan kelebihan dari penggunaan kromatografi penukar ion!
• Kecepatan (speed)
• Sensitivitas (sensitivity)
• Selektivitas (selectivity)
• Pendeteksian yang serempak (simultaneous detection)
• Kestabilan pada kolom pemisah (stability of the separator column)
16. Sebutkan manfaat dari kromatografi eksklusi ukuran!
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk
memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
17. Jelaskan prinsip kerja kromatografi afinitas!
Pada kromatografi ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel
jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini
dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
18. Apa itu fase gerak dalam HPLC?
 Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fase
gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak dalam HPLC
merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
19. Sebutkan apa-apa saja persyaratan fase gerak dalam HPLC!
1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatografi.
3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
6. Sesuai dengan detector.

20. Sebutkan dan jelaskan jenis HPLC berdasarkan kepolaran fase diam dan fase
gerak!
a) HPLC fase normal: HPLC dengan kombinasi antara fase diam polar dan fase gerak non-
polar. Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan
pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.
b) HPLC fase terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fase diam non-polar dan fase gerak
polar. Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
21. Apa-apa saja syarat pompa yang bisa digunakan sebagai instrumen HPLC?
Pompa yang digunakan harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk
pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
22. Apa fungsi pompa dalam instrumen HPLC?
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas
dari gangguan.
23. Jelaskan 3 buah jenis pompa yang digunakan sebagai instrumen HPLC!
a) Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston
mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung
dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk,
sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang
telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacemen
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong
yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak
bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
c) Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan
bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
24. Dalam instrumen HPLC terdapat tempat injeksi, jelaskan 3 tipe dasar injektor
yang dapat digunakan!
a) Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan
aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan
resolusi tidak dipengaruhi
 b) Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada
Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari
septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c) Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar
dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai,
volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi
kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuk ke
dalam kolom.
25. Sebutkan syarat-syarat injektor yang baik untuk digunakan sebagai instrumen
HPLC!
Syarat- syarat injektor yang baik :
a) Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
b) Mudah digunakan
c) Keberulangan tinggi
d) Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
26. Sebutkan pengelompokan detektor sebagai instrumen HPLC!
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang
mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif)
seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang
spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-
Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
27. Sebutkan karakteristik ideal dari detektor!
a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang
sangat kecil;
c. stabil dalam pengopersiannya;
d. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita;
e. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas
(kisaran dinamis linier);
f. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
28. Jelaskan prinsip kerja HPLC dalam menganalisa secara kualititatif!
Pada proses kualitatif cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat
Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya adalah
sebagai peak milik analat. Selain melihat RT hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D
dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan
adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
29. Jelaskan prinsip kerja HPLC dalam menganalisa secara kuantitatif!
Melalui analisa kuantitatif dapat diketahui kadar komponen yang dianalisis di dalam sampel.
Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang
digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk
analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus
dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus
digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi
sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.
30. Sebutkan gangguan-gangguan yang terjadi pada analisa HPLC!
Gangguan yang terjadi dibedakan menjadi dua yaitu : gangguan sistem garis dasar dan
gangguan bentuk puncak. Gangguan sistem garis dasar (baseline) yang mungkin timbul antara
lain : noise (derau), drift (melayang), spiking (berpaku), wander (menyimpang) dan shift
(bergeser). Sedangkan gangguan bentuk puncak (peak shape) yang mungkin timbul yaitu
:Puncak lebih kecil dari yang diharapkan, Tailing (puncak), Fronting (puncak mengandung),
Puncak berubah bentuk (cigar top, round top, flat top), Puncak membelah (split), Puncak
negatif.