Struktur Penduduk Afrika Timur

Relapsing Fever Borrelia spp.

Diferensiasi demam kambuhan endemik Afrika Tengah yang endemik Borrelia duttonii
spirochetes dari Louse Borne Reledemam kambuh yang melahirkan kambuh (LBRF) B.
berulangnya spirochetes ke spesies yang berbeda telah dipertanyakan. Kami menilai wilayah
spacer intragik nonkoding (IGS) untuk membandingkan genotipe yang ditemukan dalam sampel
klinis dari pasien demam kambuh. Meskipun pengetikan IGS sangat diskriminatif dan
menyelesaikan 4 kelompok demam kambuhan dari Afrika Timur yang kambuh dari daerah
endemis penyakit di Tanzania, 2 klas IGS ditemukan di antara pasien LBRF di Etiopia. 2 Tipe
urutan IGS untuk B. recurrentis tumpang tindih dengan 2 dari 4 kelompok yang ditemukan di
antara B. duttonii. Semua isolat B. duttonii yang dapat diolah jatuh ke dalam satu cluster IGS
tunggal, yang menunjukkan bahwa analisis mereka dapat mengenalkan bias selektif. Kami
memberikan dukungan lebih lanjut bahwa B. recurrentis adalah subset dari B. duttonii dan
mewakili ekotipe dan bukan spesies. Pengamatan ini memiliki implikasi dan saran pengendalian
penyakit LBRF Borrelia spp. dapat muncul kembali dari reservoir yang ditularkan melalui kutu
di mana vektor hidup berdampingan. Demam yang kambuh adalah infeksi demam berulang yang
disebabkan oleh berbagai antibiotik Borrelia yang ditransmisikan baik oleh kutu (demam
kambuh epidemi) atau oleh kutu (demam kambuh endemik). Demam yang kambuh dulunya
merupakan penyakit globalepidemi penting Namun, sebagian besar akibat dari kematian kostum
busana Pediculus humanus, sekarang hanya terbatas pada daerah di mana pakaian kutu masih
merupakan tempat yang umum, seperti Ethiopia (1). Di wilayah ini masih memiliki dampak yang
besar dan didokumentasikan dalam laporan Departemen Kesehatan Ethiopia baru-baru ini
sebagai penyebab ketujuh masuk paling umum ke rumah sakit (2,5% dari total; 3.777 kasus) dan
penyebab kematian paling umum kelima (0,9% 42 kasus) (2004) (1). Kecenderungan epidemi
infeksi ini kemungkinan berada dalam transmisi vektornya, dengan gelombang kutu pakaian
yang melarikan diri dari pasien demam dan dengan demikian memfasilitasi penularan epidemi.
Strik demam kambuhan kambuhan endemik ditularkan oleh kutu Ornithodoros; O. sonrai
berfungsi sebagai vektor prinsip untuk Borrelia crociduraedi Afrika Barat, dan kompleks O.
moubata kutu secara efektif menjaga spirochetes ini di Afrika Timur (1). Karena kutu lembut
hanya dikaitkan dengan host karena pemberian makan malam mereka yang biasanya cepat, ini
membatasi penyebaran infeksi di luar kontrafi Ada daerah dimana vektor tick berada.
 Meskipun gaya hidup yang berbeda dari vektor dapat menjelaskan perbedaan
epidemiologis antara infeksi ini, penelitian terbaru telah menyoroti kesamaan antara B.
recurrentis, penyebab demam kambuh yang melahirkan, dan B. duttonii, agen dari Afrika Timur
yang melakukan kutu - demam kambuhan bawaan (2-4). Telah dipostulasikan bahwa B.
recurrentisis varian beradaptasi louse dari B.duttonii (5). Di daerah endemis penyakit ini,
diagnosis biasanya dicapai melalui demonstrasi spirochetes dalam film darah bernoda dari
pasien. Namun, teknik ini tidak bisa membedakan antara Borrelia spp yang berbeda. yang
menyebabkan demam kambuh.
Untuk menyediakan metode yang dapat dipercaya mengidentifikasi spirochetes ini, kami
memvalidasi penggunaan analisis urutan area spacer intragenik (IGS) untuk mengetik
spirochetes (3). Metode ini digunakan untuk menganalisis wilayah spacer noncoding dan terbukti
sangat diskriminatif; itu diselesaikan 4 kelompok antara B. duttonii ditemukan di antara isolat
dan langsung di vektor centang. Dua kelompok ditemukan di antara isolat B. recurrentis dan
vektor kutu (3). Selanjutnya, spesies Borrelia baru yang terdeteksi sebelumnya ditemukan, dan
beberapa jenis urutan menyerupai B. crocidurae, yang sebelumnya diyakini hanya di Afrika
Barat (3,6). Temuan yang mengejutkan adalah bahwa kelompok filogenetik B. duttonii tumpang
tindih dengan sekelompok B. recurrentis (3). Kolinearitas ini selanjutnya didukung oleh sekuens
genom lengkap dari 1 isolat B. recurrentis dan 1 dari B. duttonii, yang menunjukkan bahwa B.
recurrentis adalah genom pembusukan yang berevolusi dari B. duttoniior yang merupakan strain
nenek moyang yang sama (5).
Untuk lebih jauh mengeksplorasi tumpang tindih antara B. duttonii dan B. recurrentis ini,
kami melakukan sequencing dan membandingkan target gen tambahan. Namun, penelitian ini
berfokus pada gen pengkode yang berada di bawah tekanan selektif yang berbeda dan karenanya
tidak harus dibandingkan dengan IGS nonkode yang sebelumnya digunakan. Selanjutnya,
investigasi ini hanya menggunakan strain yang dapat dibudidayakan, dan dengan demikian dapat
mewakili bias terhadap mereka yang mampu tumbuh dalam kondisi axenic. Penyelidikan ini
mengungkapkan demarkasi yang jelas antara B. duttonii dan B. recurrentis (4).
Untuk mengatasi dikotomi ini, kami melakukan pengetikan IGS secara langsung pada
sampel serum yang dikumpulkan dari pasien dengan kasus klinis, sehingga menghilangkan
tekanan kultivasi selektif. Kami melaporkan hasil investigasi tersebut.
Bahan dan metode
Sampel Klinis
Delapan puluh delapan sampel serum dari pasien di Etiopia dengan demam kambuh yang
merupakan cairan darah positif untuk spirochetes dikumpulkan dan disimpan beku pada suhu -20
° C sebelum pengujian. Demikian pula, 23 sampel yang dikumpulkan dari pasien di Tanzania
dikumpulkan dan disimpan beku. Serangkaian tambahan dari 45 sampel dari anggota keluarga
yang menyertai pasien ke rumah sakit karena donor darah potensial tersedia untuk dianalisis.
Persetujuan etis untuk pengumpulan dan pengujian demam kambuhan telah diberikan untuk
penelitian sebelumnya (Etiopia dan Komisi Ilmu Pengetahuan dan Teknologi
[COSTECH] 2001-330-NA-2001-25 untuk Tanzania).
Ekstraksi DNA
Sampel sampel disentrifugasi pada 13.000 rpm di microfuge selama 30 menit dan 100 μL
pelet digunakan untuk ekstraksi DNA. Setelah pengolahan proteinase K awal pada waterbath
pada suhu 56 ° C selama 1 jam, ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan DNeasyreagents
(QIAGEN, Valencia, CA, USA) sesuai dengan protokol pabrikan untuk platform robot QIAcube
dengan volume elusi akhir 200 μL.
Skrining Awal untuk Borrelia spp.
Uji flagelle TaqMan real-time digunakan untuk menyaring sampel untuk mengetahui
adanya DNA borrelial sebelum dilakukan penyelidikan. Primer ditunjukkan pada Tabel 1. Primer
adalah
digunakan pada konsentrasi akhir 1.000 mmol / L, dan probe digunakan pada a
konsentrasi akhir 50 mmol / L. Sebuah mastermix terdiri dari buffer penghasil PCR tanpa MgCl2
(Invitrogen, Carlsbad, CA, AS), 0,2 mmol / L masing-masing dNTP, 5 mmol / L MgCl2, 0,075
nmol / L Rox, dan 0,06 U Taq polimerase (Invitrogen). Mastermix dibagi menjadi aliquot dari 23
μL dimana 2 μL DNA yang diekstraksi ditambahkan. Termokliner MX3000 (Stratagene, La
Jolla, CA, AS) digunakan dengan denaturasi awal 95 ° C selama 10 menit, diikuti oleh 50 siklus
masing-masing pada suhu 94 ° C selama 15 s dan 60 ° C selama 60 detik. Hasil terbaca pada
panjang gelombang Fam (emisi 516) dengan menggunakan Rox sebagai panjang gelombang
acuan (emisi 610).
IGS TypingSamples positif untuk DNA Borrelia oleh uji waktu flagellin real time selanjutnya
dikenai mengetik IGS. PCR bersarang digunakan untuk memperkuat IGS, dengan primer luar
berlabuh di ujung 3 'gen rrs ribosom dan ujung 5' dalam gen ileT seperti yang digunakan
sebelumnya (3).
Urutan primer ditunjukkan pada Tabel 1. PCR konvensional dilakukan dengan menggunakan
volume reaksi 25μL pada termokuin My Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, AS) dengan denaturasi
awal pada suhu 94 ° C selama 3 menit, diikuti oleh 35 siklus pada 94 ° C selama 30 detik, 55 ° C
selama 30 detik, dan 74 ° C selama 60 detik, dan ekstensi akhir pada suhu 72 ° C selama 7 menit.
Volume 2-μL dari reaksi putaran pertama ditambahkan ke 23 μL segar
mastermix babak kedua Campuran ini dipanaskan pada suhu 94 ° C selama 3 menit, diikuti oleh
35 siklus pada suhu 94 ° C selama 30 detik, 60 ° C selama 30 detik, dan 74 ° C selama 60 detik,
dan perpanjangan akhir pada suhu 72 ° C selama 7 menit. . Hasil amplicons diselesaikan dengan
elektroforesis pada gel agarosa 1% yang diwarnai dengan etidium bromida (0,5 μg / mL).
Manipulasi PCR yang berbeda dilakukan di berbagai wilayah laboratorium untuk menghindari
kontaminasi, dan
Kontrol nontemplate disertakan dengan perbandingan 1 untuk setiap 15 sampel yang diuji.