1.

Perkenalan

Timolol maleat secara luas digunakan sebagai agen penghambat b-adrenergik topikal dalam
opthalmologi untuk menurunkan tekanan intraokular pasien glaukoma. Pada penyakit kronis seperti
glaukoma, menurunkan frekuensi dosis juga berguna untuk meningkatkan kepatuhan pasien (Akafo et
al., 1995; Patel dan Spaeth, 1995). Telah diketahui bahwa timolol yang dioleskan secara topikal dapat
menyebabkan efek samping kardiovaskular dan respiratorik yang berat (Shields, 1992). Efek samping ini
sebagian disebabkan oleh bioavailabilitas yang buruk dari obat ophthalmic yang diaplikasikan secara
topikal, karena sebagian besar obat yang ditanamkan dihilangkan karena drainase aliran air mata dan
penghalang difusi kornea, dan secara sukses diserap ke dalam sirkulasi sistemik. Peningkatan
bioavailabilitas okuler dapat memungkinkan re-duction frekuensi instilasi atau dosis, dengan
konsekuensi penurunan efek samping yang tidak diinginkan. Untuk alasan ini, berbagai penelitian telah
dilakukan dengan tujuan meningkatkan bioavailabilitas okular timolol: ini termasuk penggunaan prodrug
(Chien et al., 1988), dari insert ophthalmic (Friedrich et al., 1996) atau dari solusi pembentuk gel (El-
Kamel, 2002). Bahkan timolol maleat kedokteran gel pembentukan solusi yang dirancang untuk
memperpanjang retensi obat prekornat baru-baru ini dimasukkan ke pasar (Rozier et al., 1989; Schenker
et al., 2000; Wada et al., 1999a, b). Namun, keterbatasan persiapan gel telah dilaporkan, yaitu bahwa
viskositas mereka menyebabkan penglihatan kabur (Shedden, 1994).

Dalam pekerjaan ini kami telah mencoba untuk meningkatkan penyerapan timolol transcorneal
dengan mempromosikan pembentukan pasangan ion. Pasangan ion diketahui meningkatkan lipofilisitas
obat yang dapat terionisasi dengan melindungi muatan mereka dengan ion counter. Beberapa pasangan
ion formulasi oph-thalmic telah dipelajari, termasuk beberapa yang melibatkan timolol (Lee, 1990). Kato
dan Iwata (1988) melaporkan bahwa pembentukan pasangan ion dengan asam lemak rantai lurus satu-
tingkat meningkatkan penetrasi kornea bunazosin. Anggota yang lebih tinggi dari serangkaian homolog
asam lemak rantai lurus jenuh lebih efektif dalam meningkatkan penyerapan kornea bunazosin dan ada
hubungan yang baik antara peningkatan penyerapan kornea bunazosin dan peningkatan lipofilisitasnya.
Sayangnya, peningkatan lipofilisitas mengurangi kelarutannya dalam larutan berair. Oleh karena itu,
lipospheres koloid dan mikroemulsi yang menyebarkan obat yang dipasangkan telah dihasilkan untuk
memiliki efek reservoir serta untuk meningkatkan kelarutan (Gallarate et al., 1988). Namun, tidak
mudah untuk meningkatkan bioavailabilitas okular obat ketika dikemas sebagai kompleks pasangan ion.
Gasco dkk. (1989) membandingkan konsentrasi timolol in vivo dalam humor aqueous kelinci yang
dihasilkan dari penggunaan mikroemulsi konsen-trated (2,6%), dan larutan berair yang mengandung
timolol (0,33%) dikombinasikan dengan asam oktanoat. Konsentrasi timolol yang digunakan dalam dua
persiapan berbeda karena solu-bility yang lebih rendah dari kompleks asam timolol-octanoic. Memang,
kelarutan timolol dalam mikroemulsi lebih tinggi daripada larutan berair yang mengandung pasangan
ion, dan daerah di bawah kurva (AUC) dari mikroemulsi lebih rendah daripada larutan berair (Gasco et
al., 1989; Vandamme, 2002).
 Dalam penelitian ini, kami telah meneliti efek asam sorbat di dalam sebagai ion penghambat
dalam larutan ophthalmic maleolol maleat berair. The in vivo ab-penyerapan timolol diterapkan oleh
berangsur-angsur adalah di-vestigated untuk mengevaluasi efek pembentukan pasangan ion pada
bioavailabilitas. Selain itu, kami menganalisis permeabilitas kornea in vitro berdasarkan model membran
bi-layer (Martin, 1993; Tojo et al., 1987) untuk menjelaskan bagaimana asam sorbat meningkatkan
ketersediaan bio.

. Bahan dan metode

2.1. Material

2.1.1. Obat dan reagen

Timolol maleat dibeli dari LEIRAS (Turku, Finlandia) dan asam sorbat dari industri kimia Daicel
(Osaka, Jepang). Timoptol® 0,5% (Banyu Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Jepang) dan TIMOPTIC-XE®
0,5% (Merck & Co., Inc., West Point, PA) digunakan sebagai formulasi kontrol dalam eksperimen instilasi
in vivo. Kedua rumus timolol mengandung 6,8 mg / ml timolol maleat (setara dengan 5 mg / ml timolol).
Semua bahan kimia lain yang digunakan adalah kelas reagen.

2.1.2. Binatang

Kelinci albino jantan Jepang (dibeli dari Fukusaki Rabbits Raising Co-op, Hyogo, Jepang) dengan
berat sekitar 2 kg digunakan di seluruh dunia. Mereka dibesarkan pada suhu 23 ± 3 ◦C dan kelembaban
relatif 55 ± 10%, dengan pencahayaan buatan 12-jam (dari jam 08.00 hingga 20.00). Mereka diberi diet
pelet komersial 100 g per hari per kelinci dan memiliki akses gratis ke air leding. Semua prosedur
eksperimental yang melibatkan an-imals telah disetujui oleh Komite institusional untuk Perawatan dan
Penggunaan Hewan Laboratorium.

2.2. Metode

2.2.1. Pengukuran koefisien partisi oktanol / air jelas

 Konsentrasi timolol dalam larutan uji ditetapkan pada 15,7 mmol / l (setara dengan 6,8 mg / ml
tim-olol maleat) dan konsentrasi asam sorbat, ex-ditekan sebagai rasio molar asam sorbat ke timolol,
bervariasi dari 0 sampai 10 (setara dengan 0–17,6 mg / ml asam sorbat). Asam sorbat dilarutkan dalam
air alka-line, timolol maleat ditambahkan ke larutan, dan pH disesuaikan hingga 7.0. Volume oktanol
yang sama ditambahkan dan campuran dikocok selama 2 jam pada suhu kamar. Konsentrasi timolol
dalam lapisan berair ditentukan oleh HPLC dan koefisien-koefisien partisi okanol / air diukur dari
konsentrasi dalam lapisan berair sebelum dan sesudah penambahan oktanol.

2.2.2. Persiapan larutan ophthalmic timolol maleat yang mengandung asam sorbat (persiapan
asam sorbat)

Larutan ophthalmic maleolol maleat dengan asam sorbat yang digunakan dalam penelitian in
vivo ditumbuk dari beberapa bahan untuk berangsur-angsur ke dalam mata. Larutan buffer fosfat (pH
7,0) disiapkan mengandung konsentrasi tetap timolol maleat (15,7 mmol / l) dan berbagai konsentrasi
asam sorbat dari 15,7 hingga 157 mmol / l (rasio molar asam sorbat / timolol dari 1 hingga 10). Sejumlah
natrium klorida (dari 0 hingga 0,72%) ditambahkan ke setiap larutan menjadi isotonik dengan cairan air
mata, dan 0,005% benzalkonium klorida juga ditambahkan sebagai preservatif. Larutan ophthalmic
maleolol maleat juga disiapkan tanpa asam sorbat sebagai kontrol.

2.2.3. Percobaan instilasi in vivo

Larutan ophthalmic timolol dosis 50 ml dimasukkan ke dalam kantung konjungtiva setiap mata
kelinci. Kelinci dikorbankan dengan suntikan intravena natrium pentobarbital berlebih pada waktu yang
sudah ditentukan sebelumnya, dan aqueous humor ditarik. Setiap humor berair disuntikkan langsung ke
HPLC dan diuji untuk konsentrasi timolol, dan hasilnya dianalisis dengan uji t satu sisi dengan P <0,05
sebagai tingkat signifikansi minimal. Statis-tical Library (Yukms Co., Tokyo, Jepang) digunakan untuk
analisis komputer.

2.2.4. Eksperimen penetrasi kornea in vitro

2.2.4.1. Solusi donor dan buffer reseptor. Persiapan asam sorbat dengan rasio molar asam
sorbat ke timolol 2, dan kontrolnya, diuji sebagai solusi donor. Keduanya disiapkan tanpa benzalkonium
klorida untuk studi in vitro. The benzalkonium klorida sangat meningkatkan permeasi kornea in vitro
dengan memodifikasi integritas epitel kornea (Sasaki et al., 1995a; Lee, 1990), dan sehingga dapat
menyulitkan evaluasi efek asam sorbat, meskipun pengaruh yang disebabkan oleh benzalkonium klorida
di vivo lebih kecil dari pada in vitro karena pengenceran dan eliminasi oleh cairan air mata in vivo.

Penyangga reseptor terdiri dari 0,013% kalsium klorida, 0,04% kalium klorida, 0,02% magnesium
sulfat, 0,019% natrium dihidrogenfosfat di-hidrat, 0,787% natrium klorida dan 0,1% glukosa, dan
disesuaikan dengan pH 7,2.

2.2.4.2. Eksperimen. Kelinci dikorbankan dengan suntikan berlebihan natrium pentobarbital, dan
epitel kornea mata kanan mereka dikerok dengan pisau bedah. Seluruh mata diberi enukleat, kornea
mata kedua dipotong dan kemudian dipasang pada ruang difusi side-by-side. Recep-tor buffer (4,5 ml)
ditambahkan ke sisi endotel. Volume yang sama dari solusi donor kemudian ditambahkan ke sisi epitel.
Suhu di setiap ruang diffu-sion dipertahankan pada 34 ◦C oleh jaket air yang beredar dan pada interval
100 ml aliquot sam-pled dari sisi endotel untuk pengujian obat oleh HPLC, dan segera diganti dengan
volume yang sama segar buffer reseptor.

2.2.4.3. Analisis data. Perawatan kuantitatif dari transfer substansi melintasi kornea memiliki
sepuluh deskripsi yang diberikan oleh hukum difusi Fick. Parameter permeasi in vitro untuk difusivitas
dan partisi dalam epitel korneum dan stroma dihitung dari kelambatan waktu dan tingkat mapan
permeasi berdasarkan model bilayer diffusion. Pendekatan yang dikembangkan sebelumnya oleh Tojo et
al. (1987) diadopsi. Tingkat mapan perembesan obat melintasi kornea in-tact (dQ / dt) 2 dan di seluruh
kornea de-epithelialyzed (dQ / dt) 1, dan jeda waktu (td) 2 (td) 1, dievaluasi dari setiap profil permeasi
dengan memplot jumlah kumulatif obat yang meresap terhadap waktu. Selang waktu diperoleh dari
intercept pada sumbu waktu dengan mengekstrapolasi profil permeasi steady-state, dan tingkat
permeasi steady-state dihitung dari kemiringan linier dari profil permeasi.
 di mana D1 adalah koefisien difusi dalam stroma, D2 adalah koefisien difusi dalam epitel, K1
adalah parti-tioning ke stroma, K2 adalah partisi ke epitel, Cd adalah konsentrasi obat dalam larutan
donor (5000 mg / ml) dan dapat diasumsikan konstan karena proporsi kecil penetrasi obat; h adalah
ketebalan epitel (0,0035 cm); H adalah ketebalan kornea de-epithelialyzed (0,04 cm).

2.2.5. Analisis HPLC timolol

Sistem HPLC (CCP & 8020 series; TOSOH Co., Ltd., Tokyo, Jepang) digunakan dalam mode fase
terbalik untuk penentuan timolol. Kolom TSKgel ODS-80Ts® (5 mm, 4,6 mm x 150 mm) digunakan pada
40 ◦C. Fase gerak dibuat dengan mencampur volume yang sama metanol dan larutan berair dari 50
mmol / l asam fosfat yang mengandung 20 mmol / l natrium 1-pentansulfonat dan 0,2% trietilamina (pH
3,0). Laju aliran adalah 0,7 ml / menit dan detektor UV ditetapkan pada 294 nm. Untuk pengukuran
koefisien partisi oktanol / air, etil p-hidroksibenzoat digunakan sebagai standar internal.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Pengaruh asam sorbat pada lipofilisitas timolol yang nyata

Koefisien partisi oktan / air timolol bersama dengan asam sorbat diukur untuk menyelidiki
peningkatan lipofilisitas yang jelas dari timolol. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan larutan
yang disederhanakan tidak termasuk bahan-bahan untuk dasar mata untuk menyelidiki efek asam
sorbat itu sendiri pada koefisien partisi timolol. Gambar. 1 menunjukkan koefisien partisi oktanol / air
timolol sebagai fungsi dari konsentrasi asam sorbat. Koefisien partisi secara bertahap meningkat dengan
meningkatnya rasio molar asam sorbat ke timolol, dan ketika rasio molar adalah 10, itu 35 kali lipat lebih
tinggi daripada timolol saja. Kami juga menegaskan bahwa koefisien partisi asam sorbat meningkat
dengan meningkatnya konsentrasi timolol. Oleh karena itu, asam sorbat meningkatkan lipofilisitas
timolol yang nyata, menunjukkan bahwa itu membentuk pasangan ion lipofilik yang lebih kompleks
dengan tim-olol. Bahkan pada rasio molar asam sorbat / timolol ini, larutan timolol 5 mg / ml dapat
disiapkan tanpa pembentukan endapan. Asam sorbat adalah asam lemak tak jenuh yang memiliki enam
karbon. Telah diketahui dengan baik bahwa pembentukan pasangan ion dengan asam lemak rantai
karbon yang lebih panjang jauh lebih sedikit larut serta meningkatkan koefisien partisi. Asam kaprat,
yang memiliki panjang alkil lebih panjang jenuh (C10), telah dilaporkan untuk meningkatkan koefisien
partisi oktanol / air dan penetrasi kornea bunazosin (Kato dan Iwata, 1988) serta beberapa b-blocker
(Sasaki et al.) ., 1995b). Ketika kami mencoba memasangkan asam timolol / capric bahkan pada
equimolar, kelarutan air yang mencukupi tidak diperoleh karena kelebihan lipofilisitas. Hasil ini
menunjukkan bahwa dalam kompleks dengan asam timolol sor-bic mencapai lipofilisitas yang lebih
tinggi diperlukan untuk meningkatkan afinitasnya untuk membran lipofilik sambil tetap larut dalam air.

Asam sorbat adalah satu-satunya asam lemak rantai tengah yang digunakan untuk bahan
oftalmik, meskipun asam lemak jenuh C6, C8 dan C10 telah digunakan untuk penggunaan lain dalam
pengobatan klinis (Ash dan Ash, 2002). Keamanan asam sorbat telah dikonfirmasi oleh tidak hanya
penggunaan oftalmik, tetapi juga aplikasi oral. Oleh karena itu asam sorbat bisa menjadi ion kontra yang
menjanjikan untuk keamanan serta properti lipofilik.

3.2. Percobaan instilasi in vivo

3.2.1. Evaluasi pengaruh konsentrasi asam sorbat terhadap bioavailabilitas timolol

Konsentrasi timolol dalam aqueous humor ditentukan setelah berangsurnya larutan oph-thalmic
maleolol maleate yang mengandung 5 mg / ml timolol dengan adanya berbagai molaritas asam sorbat.
Dalam Gambar. 2 kami menyajikan konsentrasi timolol dalam humor aque-ous 30 menit setelah
berangsur-angsur. Tingkat hu-mor berair meningkat secara signifikan ketika molar ra-tio asam sorbat ke
timolol adalah 2 atau lebih tinggi. Ketika rasio molar asam sorbat / timolol adalah 1,4, tingkat humor
aqueous meningkat meskipun perbedaannya tidak signifikan secara statistik. Temuan ini menunjukkan
bahwa asam maleat membentuk garam dengan timolol, dan com-petes dengan asam sorbat untuk
membentuk pasangan ion dengan obat. Persiapan dengan asam sorbat pada rolar molar 4 atau 10
menghasilkan konsentrasi humor aqueous yang hampir sama dengan yang memiliki rasio molar 2
meskipun lipofilisitasnya lebih besar. Gallarate et al. (1988) mengusulkan penjelasan untuk penurunan
perme-kemampuan timolol melintasi membran buatan ketika konsentrasi misel campuran berada di
atas konsentrasi misel kritis (CMC) (timolol / octanoate 1: 8). Mereka berpendapat bahwa pembentukan
misel campuran sebagian mengkonsumsi asam oktanoik dan timolol yang tersedia untuk pembentukan
pasangan ion. Dalam contoh ini, timolol dan asam sorbat dapat membentuk misel campuran pada
konsentrasi tinggi asam sorbat (Gallarate et al., 1988). Untuk alasan ini kami menyimpulkan bahwa rasio
molar (asam sorbat / timolol) dari 2 mungkin optimal. Konsentrasi op-timal asam sorbat melebihi jumlah
prekursor untuk penggunaan oftalmik (2 mg / g), meskipun itu di bawah preseden oral (34,8 mg / g)
(Japanese Pharmaceutical Excipients Directory, 2000). Dengan demikian kami menegaskan bahwa tidak
ada tanda-tanda iritasi yang diamati oleh penelitian toksisitas okular pada kelinci dan monyet (unpub-
lished data).

3.2.2. Perbandingan pengaruh berbagai formulasi timolol pada bioavailabilitas

Tingkat timolol dalam aqueous humor ketika diterapkan sebagai persiapan asam sorbat (rasio
molar asam sorbat / timolol: 2) dibandingkan dengan Timoptol® 0,5% dan TIMOPTIC-XE® 0,5%.
Timoptol® 0,5% adalah larutan ophthalmic timolol maleat sementara TIMOPTIC-XE® adalah sekali sehari
untuk mulasi larutan mata yang mengandung Gellangum yang membentuk gel saat kontak dengan
kation dalam air mata (Rozier et al., 1989). Konsentrasi timolol dalam humor aqueous diukur hingga 3
jam setelah berangsur-angsur. Profil konsentrasi-waktu untuk tiga formulasi ditunjukkan pada Gambar.
3. Persiapan asam sorbat menghasilkan konsentrasi timolol aqueous humor tinggi 15 dan 30 menit
setelah berangsur-angsur daripada Timoptol® pada tahap yang sama. TIMOPTIC-XE® juga menghasilkan
konsentrasi aqueous humor yang lebih tinggi daripada Timoptol® hingga 1 jam setelah berangsur-
angsur. Konsentrasi pada 3 jam setelah berangsur-angsur dari persiapan asam sorbat dan TIMOPTIC-XE®
kira-kira dua kali lipat lebih tinggi daripada Timoptol®, meskipun perbedaannya tidak signifikan secara
statistik. Fakta bahwa persiapan asam sorbat menghasilkan konsentrasi aqueous humor timolol yang
lebih tinggi daripada TIMOPTIC-XE® pada 15 menit setelah in-stillation menunjukkan bahwa perilaku
lipofilik yang lebih dari pasangan ion dapat meningkatkan partisi ke permukaan kornea. Parameter
farmakokinetik ditunjukkan pada Tabel 1. Cmax dari persiapan asam sorbat adalah 3,1 kali lipat lebih
tinggi dibandingkan dengan Timoptol® dan 2,8 kali lipat lebih tinggi daripada TIMOPTIC-XE®. Secara
praktis tidak ada perbedaan dalam Tmaxs mengingat deviasi. AUC0 → 3 dari preparasi asam sorbat mirip
dengan TIMOPTIC-XE®, dan AUCs keduanya 2,2 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan Timoptol®.
Dengan demikian bioavailabilitas dari preparasi asam sorbat hampir sama dengan TIMOPTIC-XE®.

3.3. In vitro penetrasi kornea timolol dengan asam sorbat

Percobaan in vitro pada penetrasi kornea dilakukan untuk menyelidiki mekanisme penyerapan
transcorneal yang dipromosikan oleh asam sorbat. Model membran bilayer (Martin, 1993; Tojo et al.,
1987) diadopsi dalam penelitian ini. Penembakan obat melalui kornea utuh bukanlah masalah difusi
sederhana tetapi terbaik diwakili oleh konsep kelarutan diferensial (DeSantis et al., 1994). Kornea
dianggap sebagai struktur berlapis-lapis. Epitelium, lapisan lipofilik sangat, memberi kontribusi terhadap
resistensi terhadap obat hidrofilik di kornea sementara stroma, lapisan hidrofilik, adalah bar-rier untuk
obat lipofilik. Bergantung pada lipofilik obat, kontribusi masing-masing individu terhadap resistensi
kornea terhadap penetrasi obat bervariasi. Dalam model membran bilayer kornea dianggap sebagai
membran bilaminat yang terdiri dari lapisan lipofilik epitel) dan stroma (lapisan berair). Dengan
memeriksa profil permeasi in vitro di seluruh kornea utuh dan kornea de-epithelialyzed, satu dapat
menentukan tambang untuk setiap lapisan kornea, sifat dikendalikan oleh tingkat penetrasi kornea,
yaitu difusivitas dan kelarutan (partisi).

Profil permeasi untuk timolol di kedua persiapan ditunjukkan pada Gambar. 4, dan parameter
permeasi timolol di kornea dirangkum dalam Tabel 2. Seperti yang ditunjukkan oleh profil permeasi
pada Gambar. 4, timolol meresap jauh kurang efektif ke dalam kornea utuh dari menjadi kornea de-
epithelialized terlepas dari adanya asam sorbat, yang menunjukkan bahwa resistensi utama terhadap
permeasi kornea timolol berada di epitel. Huang et al. (1983) melaporkan bahwa epitel kornea
menyumbang 68% dari total resistensi kornea terhadap timolol, sedangkan stroma memberi kontribusi
9%. Seperti ditunjukkan pada Tabel 2, koefisien partisi timolol dengan asam sorbat sekitar dua kali lipat
lebih tinggi daripada timolol saja, sedangkan koefisien difusi dalam epitel tidak dipengaruhi oleh asam
sorbat. Temuan ini jelas menunjukkan bahwa peningkatan dalam tingkat permeasi timolol dengan
adanya asam sorbat tidak disebabkan oleh peningkatan koefisien dif-fusi, tetapi oleh peningkatan partisi
ke epitel.

Sasaki dkk. (1995c) menunjukkan bahwa karakter permeasi kornea b-blocker ditentukan oleh
koefisien partisi obat terhadap permukaan kornea, bukan oleh koefisien difusi, dan koefisien partisi obat
lipofilik di lapisan epitel lebih tinggi daripada obat hidrofilik (Sasaki). et al., 1995c). Dalam kompleks
pasangan ion ini, juga dianggap bahwa partisi ke epitel dikendalikan oleh lipofilisitas obat yang
dipasangkan.

Juga ditetapkan bahwa koefisien difusi berbanding terbalik dengan berat molekul penetran
(Martin, 1993). Jika diasumsikan bahwa pasangan ion kompleks berdifusi dalam kornea seperti itu,
koefisien difusi bisa menjadi kecil karena meningkatnya berat molekul. Bahkan, difusivitas tidak
terpengaruh oleh asam sorbat. Dari hasilnya, obat yang dipasangkan diasumsikan berdisosiasi dan
kemudian difus secara individual setelah kompleks dipartisi ke permukaan kornea.

Singkatnya, kami telah mengeksplorasi efek asam sorbat pada lipofilisitas dan absorpsi
transcorneal timolol dan telah menemukan bahwa kemampuan bioavail okular timolol ditingkatkan
dengan adanya asam sorbat dalam larutan mata. Dari in vitro re-sult, jelas bahwa peningkatan ini
disebabkan peningkatan partisi timolol ke epitel kornea.