PENDAHULUAN

Telah diusulkan bahwa gen seperti BABY BOOM1 (BBM1) dan LEAFY COTYLEDON1 (LEC1)
diperlukan selama awal SE [10,11]. BBM1 secara istimewa diekspresikan dalam mengembangkan embrio
dan biji Brassica napus, sedangkan BnBBM1 overekspresi meningkatkan proliferasi sel dan morfogenesis
selama embriogenesis [10]. Selain itu, telah diidentifikasi itu BBM1 mengaktifkan gen yang terlibat
dalam modifikasi dinding sel yang terkait dengan membagi dan menumbuhkan sel, menunjukkan bahwa
BBM1 mengaktifkan a jaringan kompleks jalur perkembangan yang terkait dengan sel proliferasi [12]. Di
sisi lain, LEC1 memainkan peran sentral dalam pematangan benih di Arabidopsis, dan telah diusulkan
sebagai kunci regulator untuk identitas embriogenik. Ia juga berpikir bahwa itu Ekspresi ektopik
mempromosikan perkembangan embrio [11]. Selanjutnya, AtLEC1 mengintegrasikan kegiatan pada
tingkat regulasi yang beragam, seperti sebagai faktor transkripsi, hormon dan sinyal cahaya di keduanya
embriogenesis somatik dan zigotik [13]. Semua temuan ini menunjukkan jalur perkembangan umum
antara somatik dan zigotik embriogenesis. Gen lain yang terkait dengan SE adalah WUSCHEL-RELATED
HOMEOBOX (WOX), yang memiliki spesialisasi berfungsi dalam berbagai proses perkembangan pada
tumbuhan, seperti itu sebagai pola embriogenik dan pemeliharaan sel induk [14]. Untuk Misalnya, di
Arabidopsis dan tomat, WOX4 memainkan peran penting mempromosikan dan mempertahankan
procambium vaskular [15,16], sementara di SE dari Vitis vinifera, WOX4 meningkatkan level ekspresinya
ketika embrio mulai berkecambah [17]. Meskipun ada kemajuan seperti itu dalam pemahaman tentang
dasar molekuler SE, epigenetic mekanisme, seperti metilasi DNA dan modifikasi histon, yang terjadi
selama proses biologis penting ini tidak baik dipahami [18-21].

Metilasi DNA dan modifikasi histon terjadi secara luas selama diferensiasi seluler dan
pengembangan di pabrik dan mamalia [18,22,23]. Metilasi DNA adalah salah satu epigenetic mekanisme
pengaturan yang paling dipelajari dalam pengembangan tanaman, dan kontribusi ilmiah terkait dengan
perannya dalam berbunga, pengembangan endosperm, respons terhadap stres, pemeliharaan genom,
pembungkaman gen, kontrol elemen transposabel dan pencetakan genom telah membantu untuk
memahami penting proses pengaturan [24-26]. Dalam kasus modifikasi histon, diketahui bahwa mereka
diperlukan dalam aktivasi atau represi transkripsi gen dengan mengubah struktur kromatin. Misalnya,
di- atau trimethylation dari histone H3 di lisin 4 dan 36 (H3K4me2 / me3 dan H3K36me2 / me3) terkait
kromatin aktif transkripsi [27,28]; sebaliknya, H3K9me2 dan H3K27me3 dianggap sebagai tanda yang
represif [29–31]. Laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa pembentukan sel embriogenik
meningkatkan metilasi DNA di Daucus carota dan Cucurbita pepo [32,33]. Namun, Charkrabarty dkk.
[34] melaporkan bahwa dalam memesan untuk mendapatkan kalus embriogenik dari senticosus
Eleuterococus, rendah tingkat metilasi DNA diperlukan. Baru-baru ini, Viejo dkk. [20] menunjukkan pada
Castanea sativa bahwa demetilasi DNA diperlukan untuk induksi SE dan pengembangan lebih lanjut
embrio somatik pada spesies ini. Di sisi lain, itu baru-baru ini melaporkan bahwa kedua metilasi DNA dan
H3K9me2 Memodulasi ekspresi WUSCHEL secara in vitro selama regenerasi tunas di Arabidopsis [35].
Selanjutnya, H3K27me3 bersifat represif tanda memainkan peran penting dalam pengaturan gen yang
terlibat di biosintesis, transportasi, persepsi dan sinyal auxins, dan perkembangan embriogenesis zygotic
[36,37]. Berdasarkan ini informasi, tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperpanjang lebih lanjut
pemahaman kita tentang cara-cara epigenetik dimana SE in tanaman diatur dan mengusulkan
mekanisme pengaturan untuk LEC1, BBM1 dan WOX4 dalam pengembangan embrio somatik. Di
penelitian ini, kami menggunakan Coffea canephora karena sangat embriogenik respons in vitro [38] dan
relevansi ekonominya di seluruh dunia. C. canephora adalah salah satu dari dua spesies ekonomis
penting kopi dan itu mewakili 25% kopi di pasar. Coffea spp adalah komoditas kedua yang paling banyak
diperdagangkan di dunia setelah minyak. Kopi mentah menghasilkan antara $ 15 dan $ 20 miliar per
tahun untuk negara pengekspor [39]. Karena aspek ekonomi ini, banyak inisiatif penelitian telah menjadi
sasaran genomik dan data transkriptomik dari Coffea spp., yang dapat berkontribusi pada pemahaman
tentang biologi kopi [40,41]. . Namun, penelitian dalam epigenetik juga diperlukan untuk memahami
lebih lanjut tentang mekanisme molekuler pertumbuhan dan reproduksi di pabrik ini. Hasil dari
pekerjaan ini mengungkapkan modifikasi kromatin spesifik selama SE dalam kopi, yang bisa memberikan
jawaban tentang hal itu peristiwa regulasi yang terjadi selama perkembangan embrio ke meningkatkan
praktik pemuliaan.

HASIL

Induksi, morfologi dan histologi dari embriogenesis somatik di coffea canephora untuk
menyelidiki epigenetik dan molekul perubahan pada berbeda pembangunan tahap embrio somatik
pembentukan, kami melakukan in vitro se induksi. In vitro C. canephora planlet yang aspal dengan
naftalena asam asetat (NAA) dan kinetin untuk 14 hari. Kemudian, daun muda dipotong dan berbudaya
di media cair dilengkapi dengan 5 MM benzil-adenin (BA) 56 hari (lihat bahan dan metode). Antara 21
dan 28 hari setelah induksi (dai), padat selular pembentukan dikenal sebagai proembryogenic massa
(PM) adalah melihat (gambar 1). Pembentukan baru meristematik Pusat di PM memungkinkan
munculnya pertama embriogenik tahap, yang bulat (G), pada hari 35 (gambar 1 dan gambar 2). Setelah
itu, pembentukan beberapa embriogenik struktur seperti G, jantung tahap (h), torpedo tahap (T) dan
cotyledonary tahap (c) diamati 42 dan 49 dai (gambar 1 dan angka 2b-f). Akhirnya, pada 56 dai, yang
eksplan dikelilingi oleh semua embrio tahap (PM, G, h, T dan c), dan, oleh scanning mikroskop elektron,
itu mengamati bahwa PM muncul dari dalam sel di eksplan margin (gambar 2). Dalam kasus h, sebuah
bifurkasi pada bagian atas struktur diamati (gambar 2c). Selama transisi dari h untuk T, embrio mulai
memanjang, dan sumbu polaritas mulai muncul; ini polaritas sangat penting untuk pembentukan dari
apikal dan radikuler meristem (gambar 2d). Selama tahap terakhir, yang c tahap, yang kotiledon mulai
memperluas dan terpisah (gambar 2f). Histologis analisis juga mengungkapkan bahwa baru
meristematik Pusat memungkinkan untuk awal G tahap, berasal dari embriogenik sel, yang kecil
sehubungan dengan tetangga sel (gambar 3a). Dalam G tahap, yang procambium sel, yang membentuk
struktur dasar masa depan pabrik, yang didefinisikan dengan baik (gambar 3b). Selama transisi dari G ke
h tahap, yang embriogenik sumbu untuk perpanjangan dan split dari procambium didefinisikan (gambar
3 C). Para T tahap menyajikan memanjang embrio, dan sepenuhnya terpolarisasi procambium diamati
(gambar 3d). Akhirnya, di c tahap, kehadiran dari kotiledon di embrio jelas (gambar 3e) dan baik
menembak dan akar sel induk renang mapan

Perubahan dalam DNA metilasi selama embriogenesis somatik dalam rangka untuk mengetahui
apakah DNA metilasi memainkan peran dalam se proses, kami dianalisis global DNA metilasi selama se
temporal tentu saja 56 hari (gambar 4a) dan di berbeda pembangunan tahap somatik embrio (gambar
4b). Itu mengamati bahwa selama awal 56-hari tentu saja dari se proses, ada sebuah peningkatan
bertahap di 5-metil-29-deoxycytosine (5 MDC) tingkat, dari 23.8% pada awal induksi (0 hari) 29% di 56
hari (gambar 4a). Namun, pada hari 21 dan 28, penurunan DNA metilasi konten diamati, 24.8% dan
23.5%, masing-masing (gambar 4a). Ini mungkin berhubungan dengan cepat proliferasi sel dari
dedifferentiated jaringan (gambar 1; 28 hari). Namun, dengan hari 35, ketika pertama embrio tahap
mulai muncul, bertahap peningkatan tingkat DNA metilasi diamati hingga hari 56, ketika peningkatan
yang signifikan (ditunjukkan dengan tanda bintang) di DNA metilasi diamati (gambar 4a). Hasil ini
menunjukkan bahwa diferensiasi dari embriogenik struktur disertai oleh peningkatan DNA metilasi
(angka 1 sampai 4). Karena kita mengamati perubahan penting di isi DNA metilasi selama se
pengembangan (gambar 4a), kita menganalisis konten DNA metilasi di setiap embrio pembangunan
tahap (gambar 4b). Somatik embrio dipisahkan Daun eksplan dikultur cair Yasuda menengah di hadapan
5 MM dari benzil adenin di bawah kondisi gelap. Yang embriogenik proses dimulai dengan penebalan
daun tepi di 14 hari setelah induksi (dai), seluler proliferasi dan pengembangan dari proembryogenic
massa (PM), antara 21 dan 28 dai. Diferensiasi pertama somatik embriogenik struktur dari PM mulai
muncul 35 dai dan diferensiasi akhir embriogenik tahap dimulai 42 dai sampai 56 dai. Close-up dari
embrio tsb ditayangkan di lingkaran. Bar = 4 MM.

Proembryogenic massa (PM) dari daun eksplan di 21 hari setelah induksi (dai). B) globular tahap;
putih arrowhead menunjukkan protoderm establisment. C) jantung tahap; putih panah menunjukkan
awal dari cotyledonary primordia di embrio. D) torpedo tahap; putih panah menunjukkan pembesaran
embrio. E) awal cotyledonary tahap, di mana pembentukan masa depan kotiledon dapat diamati. F)
akhir cotyledonary tahap. Pada tahap ini yang kotiledon sepenuhnya dikembangkan. Bar = 100 MM.

Melintang dipotong dari awal globular tahap dari proembryogenic massa di 14 dai. B) melintang
dipotong dari globular tahap. Merah arrowhead menunjukkan selular organisasi dan kehadiran
didefinisikan dengan baik procambium. C) longitudinal dipotong dari jantung tahap. Merah
arrowhead menunjukkan inisiasi pemanjangan dari procambium zona dan awal dari cotyledonary
primordial ditandai dengan putih bintang. D) longitudinal potongan torpedo tahap. Merah arrowhead
menunjukkan pemanjangan dari procambium zona. E) longitudinal dipotong dari awal cotyledonay
tahap. Merah arrowhead menunjukkan procambium zona, Sedangkan putih arrowhead menunjukkan
perkembangan awal cotyledonary primordial. F) longitudinal dipotong dari akhir cotyledonary tahap.
Merah panah menunjukkan procambium zona, dan putih arrowhead menunjukkan perkembangan
cotyledonary primordial. Bar = 200 MM.

oleh tahap (PM, G, h, T dan c) dan DNA mereka metilasi konten dibandingkan dengan yang dari in vitro
plantlet (p) dan zigotik embrio, dalam cotyledonary tahap, terisolasi dari kopi biji (Z) (gambar 4b).
terendah DNA metilasi persentase (23.7%) diamati di PM, yang dipisahkan dari eksplan dan terisolasi di
28 dai. itu juga mengamati bahwa DNA metilasi meningkat sebagai cikal bakal mengembangkan, dan
tertinggi konten DNA metilasi ditemukan di T dan c tahap. di sisi lain, yang planlet disajikan perbedaan
dari 5% pada DNA metilasi konten dibandingkan dengan somatik cotyledonary tahap (gambar 4b),
Sedangkan zigotik embrio memiliki 2% kurang DNA metilasi dari embrio somatik di sama pembangunan
tahap (gambar 4b). efek dari 5-azacytidine selama somatik embriogenik proses dalam rangka untuk
mengetahui apakah peningkatan DNA metilasi berhubungan dengan timbulnya dan diferensiasi somatik
embrio, sebuah farmakologis assay dilakukan dengan dua konsentrasi yang berbeda (10 MM 20 MM)
dari 5-azacytidine (5-azac, DNA metilasi inhibitor) dan tanpa 5-azac (kontrol) (gambar 5). 5-azac telah
Ditambahkan setiap 7 hari (sampai hari 56) mulai independen titik waktu (7, 14, 21 dan 35) untuk
melihat pengaruh senyawa ini ketika Ditambahkan pada awal (hari 7 atau 14) atau pada akhir proses
(hari 21 atau 35). jumlah somatik embrio dari setiap pembangunan tahap di masing-masing dari empat
kali percobaan dengan 5-azac dihitung di 56 dai (gambar 5b; melihat bahan dan metode). itu mengamati
bahwa 5-azac memiliki dramatis efek negatif pada embriogenik respon ketika itu Ditambahkan hari 7
setelah induksi pada kedua konsentrasi. Namun, ini efek negatif itu tidak teramati saat ini inhibitor telah
Ditambahkan pada hari 35 setelah induksi (gambar 5a). Selain itu, mengamati bahwa 5-azac di 10 MM,
Ditambahkan pada hari 7, memicu penurunan 86% di jumlah somatik embrio dan di 20 MM penurunan
hingga 98%, dibandingkan dengan kontrol tanpa 5-azac (gambar 5b). Menariknya, efek dari 5-azac ketika
telah Ditambahkan pada hari 14 kurang dramatis dibandingkan dengan tambahan pada hari 7 (gambar
5). di sisi lain, kami tidak mengamati terlihat merusak efek karena 5-azac dalam pembentukan dari
embrio somatik di kedua konsentrasi Ditambahkan pada hari 21; sebaliknya, itu menemukan bahwa
kehadirannya meningkatkan perkembangan PM, menunda pembentukan embriogenik struktur (gambar
5a). Namun, kehadiran 20 MM dari 5- azac meningkatkan jumlah G embrio oleh 1.6 kali lipat
dibandingkan dengan kontrol (gambar 5b). hasil ini menunjukkan bahwa efek dari 5-azac (terutama di 20
MM) Ditambahkan pada hari 21 setelah induksi, tidak hanya tampaknya melakukan sinkronisasi
embriogenik proses, tetapi juga mengurangi embrio pematangan (gambar 5). Selain itu, hasil ini juga
diamati dalam pengobatan dengan 5-azac pada hari 35, ketika kita mengamati lebih tinggi somatik
embrio pada tahap awal pembangunan, terutama G dan h, dibandingkan dengan kontrol. temuan ini
menunjukkan bahwa 5-azac dapat mengganggu perkembangan normal somatik embrio pada tahap-
tahap awal proses, mungkin dengan mempengaruhi ambang tingkat DNA metilasi. oleh karena itu,
untuk menguji hipotesis ini, kami menilai apakah gangguan-embrio pembentukan karena 5-azac
memang karena kerugian dalam DNA metilasi tingkat. yang eksplan dari hari 7 diperlakukan 10 MM dari
5-azac, setiap tujuh hari dari hari 7 sampai hari 56, dan isi dari 5 MDC dievaluasi (gambar s1). hasilnya
menunjukkan bahwa penambahan dari 5-azac drastis mengurangi kadar DNA metilasi dari 23.5% di 7 dai
14% di 56 dai (gambar s1). hasil ini menunjukkan bahwa bertahap DNA demethylation karena
penambahan dari 5-azac (10 MM) dari hari 7 setelah induksi langsung berhubungan dengan gangguan
embriogenik induksi (gambar 5). histone metilasi pola selama se hal ini diketahui bahwa histone
posttranslational modifikasi adalah fundamental kunci untuk kromatin konformasi dan peraturan
transkripsi aktivitas gen yang terkait dengan pengembangan [42,43]. oleh karena itu, kita menyelidiki
apakah, Selain DNA metilasi, global histone h3 metilasi adalah terkait dengan embriogenik respon dan
pembentukan dari embrio somatik di C. canephora (gambar 6). nuklir protein diisolasi dari eksplan
bawah embriogenik induksi di temporal tentu saja 49 hari (gambar 6a; melihat bahan dan metode) dan
dari somatik embrio dari setiap pembangunan tahap (gambar 6b). perubahan h3 metilasi terdeteksi oleh
Western blot menggunakan antibodi terhadap di- dan trimethylation dari h3k4, h3k9me2 dan
h3k27me3. kami mengamati menarik perubahan global histone metilasi pola di eksplan bawah
embriogenik kondisi. sebagai contoh, setelah embriogenik induksi (hari 7), penurunan global h3k4me3,
h3k9me2 dan h3k27me3 tanda dibandingkan dengan hari 0 diamati (gambar 6a). Menariknya, kehadiran
represif Mark h3k9me2 adalah tidak terdeteksi pada 21 dan 28 dai, Sedangkan penurunan DNA metilasi
juga diamati pada hari ini selama se proses (gambar 4a). di sisi lain, yang h3k27me3, lain represif Mark,
dipertahankan tidak berubah sampai akhir dari proses, pengecualian untuk hari 7 (gambar 6a). dalam
rangka untuk mengetahui apakah ini epigenetik tanda di h3 histone diubah di setiap pembangunan
tahap embrio, global histone h3 metilasi pola h3k4me2, h3k4me3, h3k9me2 dan h3k27me3 dari PM
untuk c tahap evaluasi (gambar 6b). kami mendeteksi perubahan dinamis di global h3k9me2 dan
h3k27me3 tanda dan terutama di PM, G dan T tahapan yang rendah. Menariknya, ini represif tanda
meningkat di h dan c tahap. di sisi lain, yang h3k4me2 dan h3k4me3 tanda yang berlimpah di seluruh
embrio somatik tahap. semua bersama-sama, hasilnya menunjukkan bahwa global histone metilasi
perubahan (terutama baik represif menandaiH3k9me2 dan h3k27me3) bersama-sama dengan DNA
metilasi (gambar 4) bisa memberikan kontribusi untuk transisi dari sel somatik ke somatik embrio.
Ekspresi gen pola selama se laporan sebelumnya telah menunjukkan bahwa lec1 dan bbm1 memainkan
peran penting selama se proses [7,10,11]. Oleh karena itu, kami mencari gen ini di C. canephora di
genbank (http: // www. Ncbi.nlm.nih.gov/unigene/library.cgi?org = CCA & tutup = 25442) dan di Sol
genomik jaringan (http://solgenomics.net/ konten / coffee.pl). Kami menemukan bahwa ORF dari
urutan gt656663.1 C. canephora mengkodekan untuk Pusat B domain dari hap3 subunit dari faktor
transkripsi lec1, diperlukan untuk DNA mengikat [11], yang memiliki tingkat tinggi kesamaan ke B
domain lain lec1 orthologs (gambar s2). Sebagai contoh, urutan ini menunjukkan 82% kesamaan untuk
kedua arabidopsis thaliana (atlec1) dan medicago truncatula (mtlec1), 83% menjadi daucus carota
(dclec1), 84% menjadi isoetes sinensis (iscaaat kotak), 86% untuk kedua brassica napus (bnlec1) dan
pistacia chinensis (pclec1), 87% untuk kedua zea Mays (zmlec1) dan Oryza sativa (oslec1) dan 95%
menjadi urutan theobroma cacao (tclec1). Di sisi lain, kami menemukan bahwa terjemahan produk dari
rangkaian gt656313.1 dan gt656297.1 C. canephora menunjukkan tingkat tinggi kesamaan ganda
apetala2 / etilena respon faktor (ap2 / erf) DNA mengikat domain dari faktor transkripsi bbm1 (Menurut
boutilier et Al. [10]. sebagai contoh, keselarasan ini urutan dengan lain orthologs dari bbm1 memiliki
95% kesamaan vitis vinifera (vvbbm1), 92% menjadi tcbbm1, 91% menjadi osbbm1, 86% menjadi
bnbbm1, 85% untuk kedua glycine Max (gmbbm1) dan atbbm1, 82% menjadi mtbbm1 dan 81% menjadi
zmbbm1. di sisi lain, telah menunjukkan bahwa wox4 fungsi untuk mempromosikan diferensiasi vaskular
procambium [16], tapi ekspresinya telah diamati terutama selama postembryogenic pengembangan
atau selama perkecambahan [17]. Namun, perannya selama se dan peraturan jelas. oleh karena itu,
kami menggunakan sgn u627534 urutan C. canephora, yang berisi homeodo utama dari wox4 (gambar
s4), yang pada asam amino tingkat memiliki tingkat tinggi kesamaan sehubungan dengan lain orthologs:
100% kesamaan solanum lycopersicum (slwox4), 99% menjadi gmwox4, 97% menjadi vvwox4, 96%
menjadi atwox4, 94% menjadi populus trichocarpa (ptwox4), 83% menjadi oswox4, 82% menjadi
zmwox4 dan 80% menjadi brachypodium distachyon (bdwox4). para wox homeodomain telah
ditemukan untuk mengikat DNA melalui heliks gilirannya Helix struktur [14]. oleh karena itu, kami
menggunakan C. canephora-dilestarikan urutan untuk melakukan ekspresi analisis lec1, bbm1 dan wox4
di berbagai embriogenik pembangunan tahap. relatif pernyataan lec1, bbm1 dan wox4 gen dievaluasi
oleh rt-PCR tes selama embriogenik induksi (0, 7, 14, dan 21 dai), serta di berbeda embriogenik tahap
(PM, G, h, T, c dan Z) (gambar 7). kami menemukan bahwa semua gen yang absen atau dinyatakan di
tingkat rendah pada hari 0, dan satu-satunya gen yang sangat dinyatakan dalam zigotik embrio (Z)
adalah bbm1. dalam kasus bbm1, tertinggi ekspresi ditemukan di embriogenik tahap PM, G dan h,
Sementara di lebih berkembang tahapan, seperti T dan c, ekspresi gen ini berkurang. selama 21 hari dari
se induksi proses, bbm1 ekspresi rendah sehubungan dengan yang ditemukan selama embrio somatik
pengembangan (gambar 7b). hasil ini menunjukkan bahwa ekspresi lec1 dan bbm1 gen yang penting
bagi diferensiasi dan pematangan embrio. bbm1 mengaktifkan jalur yang berkaitan dengan proliferasi
sel dan pertumbuhan, Sementara lec1 diperlukan untuk membujuk embriogenik program dan embrio
pematangan [10,11]. di sisi lain, ekspresi wox4 hampir tidak terdeteksi dalam berbeda embriogenik
tahapan, dan ekspresinya hanya ditemukan pada hari 0, 7, 14, 21 dan di PM (gambar 7). wox4 partisipasi
selama se belum diteliti secara rinci dalam spesies lain, tetapi selama perkecambahan somatik embrio V.
vinifera, yang wox4 transkrip lebih tinggi [17]. Selain itu, kami hasil tentang kurangnya ekspresi lec1 di Z
konsisten dengan penelitian lain di arabidopsis dan B. napus [11,44], menunjukkan bahwa lec1 tdk bisa
menjadi terlibat dalam postembryogenic peraturan karena fakta bahwa lec1 memainkan lebih peran
sentral di embrio pengembangan [11,45]. epigenetik peraturan lec1, bbm1 dan wox4 selama se karena
lec1, bbm1 dan wox4 menunjukkan diferensial Expres Sion pada awal dari se proses dan pada berbeda
embriogenik tahap (gambar 7), kami memeriksa epigenetik tanda histone h3-metilasi (h3k4me3,
h3k9me2, h3k27me3 dan h3k36me2) di gen ini oleh kromatin immunoprecipita tion (chip) pada hari 0
dan 14 di embrio pembangunan tahap PM, h, T dan c (gambar 8). kami tidak mengamati pengayaan dari
tanda yang berkaitan dengan ekspresi gen dari h3k4me3 dan h3k36me2 di salah satu gen dievaluasi.
Namun, kami menemukan bahwa h3k9me2 Mark akumulasi dari h ke c tahapan dalam urutan yang
mengkodekan untuk homeodomain dari wox4 gen (gambar s4), yang penting bagi DNA mengikat. ini
Mark akumulasi tampaknya terkait dengan kurangnya wox4 ekspresi gen ditemukan pada gambar 7,
Sementara kehadiran h3k36me2 dari 0 sampai PM menunjukkan keikutsertaannya dalam ekspresi gen
ini. dalam kasus yang h3k27me3 Mark, itu mengamati bahwa lec1 dan bbm1 gen yang diperkaya dengan
ini represif Mark di berbeda embrio tahap. sebagai contoh, di lec1 ini Mark sangat diperkaya dengan 0
hari dan saat ini hanya sedikit di kedua 14 hari dan c tahap (gambar 8); hasil ini berhubungan dengan
represi menemukan gen ini di hari-hari (gambar 7). hasil yang sama ditemukan untuk bbm1, di mana
kami menemukan bahwa genom wilayah yang dikodifikasikan untuk mengulangi 2 ap2 / erf domain
(gambar s3), yang merupakan bagian yang dibutuhkan untuk DNA mengikat [10], sangat ditandai
dengan h3k27me3, terutama pada awal induksi (0 sampai 14 hari). Selain itu, kami mengamati bahwa
daerah ini membawa tingkat moderat h3k4me3 dan h3k36me2 tanda di semua jaringan, tapi rendah
tingkat h3k9me2. hasil ini menunjukkan bahwa penurunan h3k27me3, dan kehadiran h3k4me3 dan
h3k36me2, mungkin mendukung transkripsi bbm1 dari PM untuk c tahap (gambar 7). secara
keseluruhan, wox4, lec1 dan BBM ekspresi diatur oleh histone modifikasi. 5-azacytidine mempengaruhi
ekspresi lec1 dan bbm1 karena kita menemukan bahwa DNA demethylation dihasilkan oleh 5- azac
penangkapan somatik embriogenik proses (gambar 5), kita menilai apakah ini demethylating agen juga
mempengaruhi transkripsi lec1 andbbm1, yang penting untuk membujuk embriogenik program dan
morfogenesis dari sel somatik [10,11], serta wox4 selama inisiasi se. untuk tujuan ini, yang eksplan kopi
diinkubasi dengan adanya dari 10 MM dari 5-azac, Ditambahkan setiap tujuh hari dari hari 0 sampai 21
dai (gambar 9). itu menemukan bahwa ketiga gen, lec1, bbm1 dan wox4, di bawah normal embriogenik
kondisi (gambar 9a, tanpa 5-azac), disajikan hampir pada tingkat yang sama dari hari 7 sampai 21 dai.
Namun, dengan adanya 5-azac, lec1 sangat disajikan pada hari 7 dan rendah atau hampir tidak
terdeteksi pada hari 14 21 (gambar 9b). dalam kasus bbm1, gen ini diungkapkan pada tingkat yang sama
sebagai tanpa 5-azac pada hari 7 tetapi ekspresinya hampir tidak terdeteksi pada hari 14 21. di sisi lain,
wox4 ekspresi meningkat dengan 5-azac pada hari 14 21 tetapi tidak terdeteksi pada hari 7. Meskipun
semua bersama-sama hasil ini menunjukkan diferensial peraturan lec1, bbm1 dan wox4 di hadapan 5-
azac, kami tdk bisa mengesampingkan kemungkinan kedua efek dari kematian sel diamati di eksplan
diperlakukan dengan ini demethylating agen (gambar 5a). penelitian lebih lanjut harus dilakukan dalam
rangka untuk mengetahui apakah 5-azac adalah mengaktifkan ekspresi lec1 (pada hari 7) dan wox4
(pada hari 14 21) oleh tidak langsung epigenetik mekanisme karena aktivasi histone methyltransferases.

DISKUSI

kapasitas sel somatik untuk membentuk somatik embrio dan regenerasi pabrik baru dikenal
sebagai embriogenesis somatik (se) [46]. Meskipun se telah belajar untuk waktu yang lama, proses ini
tidak sepenuhnya dipahami, dan pentingnya epigenetik Mecha nisms selama se dan di berbagai
embriogenik tahap belum ditangani. hasil disajikan di sini memberikan wawasan baru ke dalam
epigenetik peraturan diperlukan selama se dari salah satu yang paling ekonomis penting jenis kopi,
coffea canephora. dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa selama awal se di C. canephora
(gambar 1), selular diferensiasi proses dan embrio pembangunan dimodulasi oleh epigenetik mekanisme
seperti DNA metilasi (gambar 4) dan histone metilasi (gambar 6). sebagai contoh, kita mengamati bahwa
eksplan C. canephora pada hari 0 memiliki 23.8% global DNA metilasi, Sedangkan pada awaldiferensiasi
proses itu meningkat menjadi 25.4% (hari 14, gambar 4a). ini sangat menyarankan cepat selular
menanggapi secara in vitro kondisi [47,48] disertai dengan drastis kromatin renovasi [49,50]. laporan
sebelumnya telah menunjukkan bahwa embrio genic sel formasi yang terkait dengan peningkatan DNA
metilasi [20,32,33]. Namun, peningkatan DNA metilasi tidak selalu kondisi yang telah dilaporkan menjadi
penting untuk se; penurunan DNA metilasi tingkat tampaknya menjadi dasar untuk embrio
pengembangan pada beberapa spesies. sebagai contoh, selama fase dedifferentiation atau embriogenik
kalus generasi di E. senticosus dan Rosa hybrida, DNA demethyl ASI peristiwa sering [34,51]. studi baru-
baru di C. sativa dan acca sellowiana juga menunjukkan pentingnya demethylation peristiwa selama se
induksi atau sebelum awal embrio diferensiasi [20,52]. kami mengamati dua peningkatan DNA metilasi
selama se C. canephora (gambar 4a). pertama diamati dari hari 7 sampai hari 21, ketika kita mengamati
kuat efek dari 5-azac di se induksi (gambar 5), dan kedua meningkatkan diamati pada akhir dari se
proses, dari hari 35 sampai hari 56 (gambar 4a). ini menunjukkan bahwa ada sebuah DNA metilasi
dinamis di seluruh seluruh proses embrio pembentukan mengkonfirmasi peran penting dari DNA
metilasi pola selama pengembangan tanaman [53-55]. Selain perubahan dalam DNA metilasi diamati
selama se pengembangan (gambar 4a), kami menemukan menarik perubahan yang berbeda embrio
pembangunan tahap (gambar 4b). sebagai contoh, kita menemukan bahwa somatik embrio di
cotyledonary tahap mengandung tingkat tinggi DNA metilasi, Sedangkan zigotik embrio, di perusahaan
cotyledonary tahap, disajikan tingkat yang lebih rendah dari DNA metilasi (gambar 4b), yang dapat
berhubungan dengan penangkapan pembangunan selama dormant periode bahwa zigotik embrio
menderita dalam biji [56]. sebaliknya, embrio dalam c tahap terus dengan perkembangan. laporan
sebelumnya telah menunjukkan bahwa DNA metilasi pola yang terlibat dalam kendali beragam tahapan
pembangunan di kedua tanaman dan hewan [23,54]. untuk menilai bahwa DNA metilasi penting selama
se C. canephora, kami melakukan Pharma cological studi untuk mengevaluasi efek dari 5-azac selama se
proses (gambar 5). kami menemukan bahwa 5-azac Ditambahkan sejak 7 dai drastis mengurangi se
proses, dan senyawa ini menyebabkan DNA hypomethylation (gambar s1). fraga et Al. [52] menunjukkan
bahwa selama se induksi di A. sellowiana, tingkat DNA metilasimeningkatkan Bahkan di hadapan 5-azac.
Namun, dengan adanya senyawa ini mengakibatkan yang lebih rendah konversi dari embrio ke planlet.
di sisi lain, di medicago truncatula itu, mengamati bahwa penggunaan 5-azac menyebabkan hilangnya se
melalui DNA demethylation [57], hasil yang setuju dengan mereka yang ditemukan dalam penelitian
kami. oleh karena itu, tampaknya bahwa DNA metilasi memainkan peran penting dalam embrio
pembentukan di model dan non-model tanaman. di sisi lain, kami mendeteksi bahwa efek dari 5-azac
dikurangi tergantung pada hari yang senyawa ini telah Ditambahkan (gambar 5b). sebagai contoh, kita
mengamati bahwa ketika 5-azac telah Ditambahkan pada 7 atau 14 dai, yang se adalah secara drastis
terpengaruh. Namun, perlu dicatat bahwa 5-azac tampaknya melakukan sinkronisasi tahap-tahap awal
dari embrio pengembangan dan untuk mengurangi embrio pematangan (gambar 5). hasil yang sama
telah diamati di D. carota, di mana 5- azac penangkapan pengembangan dari h tahap, merangsang
sekunder embriogenesis [58]. di sisi lain, Yamamoto et Al. [32] melaporkan bahwa efek ini
demethylating agen tergantung pada embriogenik tahap di mana itu diterapkan. yang se di D. carota
ditangkap apakah itu diterapkan di 3 atau 7 dai, tapi tidak ada perbedaan dalam embriogenik respon jika
diterapkan dari 7 to14 dai. telah juga menemukan bahwa kehadiran dari 5-azac atau penggunaan yang
methyltransferase1 (met1) mutan meningkatkan pembentukan meristematik Pusat meningkatkan
menembak pembentukan dari kalus dari arabidopsis [35,59], yang menunjukkan bahwa DNA metilasi
berperan mediasi perkembangan tingkat. Namun, Meskipun banyak laporan telah menunjukkan bahwa
DNA metilasi terlibat dalam embrio dan pengembangan tanaman, mekanisme di mana itu terjadi masih
belum diketahui. kemungkinan besar, hypomethylation di seluruh genom karena efek dari 5-azac
berubah pada gen yang perlu ditekan di tertentu perkembangan waktu urutan untuk menginduksi
embrio pematangan. spesifik inhibitor metilasi efek dari 5-azac perlu dipelajari dalam rangka untuk
menguji hipotesis ini. Selain perubahan dalam DNA metilasi diamati selama se proses (gambar 4), kami
menemukan yang menarik histone metilasi pola (gambar 6) yang tampaknya terkait dengan
pengurangan DNA metilasi tingkat di 21 dan 28 dai (gambar 4a). kami diamati tidak adanya represif
Mark h3k9me2 dan peningkatan transkripsi yang berhubungan dengan tanda h3k4me2 dan h3k4me3
(gambar 6a); pada yang sama hari, penurunan pada DNA metilasi diamati. serupa epigenetik peristiwa
sebelumnya telah terbukti di mam Mali pembangunan selama awal embrio onset di zigot, di mana
kerugian yang signifikan dari DNA metilasi dan h3k9me2 terjadi [22,60]. Menariknya, kami juga
menemukan mengurangi tingkat h3k9me2 dan h3k27me3 tanda setelah embriogenik induksi pada hari 7
(gambar 6a). telah melaporkan bahwa penurunan DNA metilasi dan rendah tingkat h3k9me2 dan
h3k27me3 memungkinkan ekspresi gen yang berkaitan dengan awal sel dedifferentiation [18,36]. yang
h3k9me2 Mark telah terbukti untuk terlibat dalam heterochromatin pembentukan, melainkan
tergantung pada DNA metilasi di arabidopsis dan beras [29,61]. Selain itu, h3k9me2 berkontribusi secara
aktif untuk pembentukan dari dedifferentiated Serikat atau masuk kembali ke siklus sel [18]. tidak
seperti h3k9me2, laporan terbaru menunjukkan bahwa h3k27me3 kontrol ekspresi, 9,006 gen di
arabidopsis [37], beberapa di antaranya yang berkaitan dengan sel dan diferensiasi sel induk peraturan.
di sisi lain, itu menemukan bahwa selama transisi dari globular tahap kejantung tahap ada peningkatan
diamati di represif tanda h3k9me2 dan h3k27me3 (gambar 6b), penemuan yang juga tampaknya terkait
dengan peningkatan DNA metilasi ditemukan di sama embriogenik tahap (gambar 4b). telah
didokumentasikan bahwa peningkatan DNA metilasi perlu untuk mengubah transkripsi pola gen, karena
DNA metilasi merepresi transkripsi langsung oleh mengganggu aksesibilitas faktor transkripsi [25,42].
dalam penelitian ini, kami telah menemukan bahwa dua faktor transkripsi gen, lec1 dan BBM, disajikan
dalam berbeda embriogenik tahap (gambar 7) mungkin oleh h3k27me3 (gambar 8). ini epigenetik Mark
langsung merepresi hanya spesifik faktor transkripsi keluarga, seperti hap3 seperti dan ap2 seperti
faktor transkripsi [37], yang juga sesuai dengan gen diselidiki dalam penelitian ini, lec1 dan bbm1,
masing-masing. lec1 adalah regulator Master of embriogenesis dan ekspresi yang dibutuhkan untuk
menginduksi se [11], Sementara bbm1 sangat penting untuk proliferasi sel dan morfogenesis selama
embrio kejadian [10]. kami menemukan bahwa dianalisis daerah lec1 dan BBM kromatin di kopi yang
diperkaya oleh h3k27me3, yang merupakan epigenetik represif Mark, lokal terutama untuk euchromatin
daerah di tanaman [62,63]. kami lokal target daerah C. canephora di gen yang sama dari epigenomes
tersedia dari arabidopsis dan beras (http://epigara.biologie.ens.fr/index.html dan
http://www.ricemap.org/gmap.jsp, masing-masing) (angka s5 dan s6). itu menemukan bahwa, dalam
kasus atlec1, yang penting pengayaan h3k27me3 ada di target zona (gambar s5b), yang konsisten
dengan temuan kami (gambar 8). hasil penelitian kami menunjukkan bahwa penurunan h3k27me3
dalam urutan yang mengkodekan untuk B-domain lec1, bisa jadi penting untuk transkripsi, karena telah
diamati bahwa penghapusan h3k27me3 penting di temporal kontrol dari gen aktivasi [64]. Lee et Al. [45]
sebelumnya menunjukkan bahwa B-domain lec1 di arabidopsis diperlukan untuk embriogenesis
pembangunan. sama ini penulis menemukan bahwa substitusi asparagin 55 oleh Lisin di B-domain
sangat mengurangi pemulihan layak Bibit, menunjukkan bahwa asam amino residu kritis diperlukan
untuk lec1 fungsi. Menariknya, tidak adanya h3k27me3 di lec1, terutama selama transisi dari h tahap ke
T tahap (gambar 8), berarti bahwa lec1 bisa terlibat dalam hipokotil pemanjangan selama embrio
pertumbuhan [13]. dalam kasus bbm1, hasil penelitian kami menunjukkan bahwa kedua ap2 / erf
domain membawa tingkat tinggi h3k27me3, moderat tingkat h3k4me3 dan h3k36me2 dan rendah
tingkat h3k9me2 di semua jaringan (gambar 8). komparatif epigenetik analisis di arabidopsis (gambar s5)
serta beras (gambar s6) mengungkapkan bahwa target wilayah di bbm1 berisi dimoderasi tingkat
h3k27me3 dan rendah tingkat h3k4me3 di kedua tanaman. baru-baru ini, telah ditemukan dalam
tanaman yang sekelompok kecil gen, terutama faktor transkripsi, yang ditandai dengan baik h3k4me3
dan h3k27me3 [36]. yang sama penulis menyarankan bahwa kehadiran kedua antagonis Mark bisa
menjaga ditekan transkripsi status dalam gen, tetapi di bawah diferensiasi proses keseimbangan tanda-
tanda ini bisa memungkinkan cepat transkripsi reactiva tion. analisis bbm1 berlebih di arabidopsis dan
tembakau menunjukkan bahwa bbm1 gen mempromosikan se Bahkan dalam ketiadaan pengatur
tumbuh, dan menginduksi menembak organogenesis, masing-masing, menunjukkan bahwa bbm1
memiliki kapasitas untuk menginduksi menembak meristem kegiatan serta embriogenesis tergantung
pada genetik dan seluler lingkungan dalam sel [10,65]. di sisi lain, itu diketahui bahwa beberapa dari
wox gen anggota keluarga yang terlibat dalam peraturan embriogenik sel dan mempertahankan
meristematik sel, tetapi juga mereka yang terlibat dalam peraturan embrio polaritas [14,66]. wuschel,
seorang anggota wox gen keluarga, yang menyelenggarakan batang sel dalam menembak meristem
[67], adalah dimodulasi dengan DNA metilasi dan h3k9me2 di arabidopsis [35]. di sini kami menunjukkan
bahwa transkripsi aktivitas wox4 adalah epigenetically dimodulasi oleh h3k9me2 (gambar 8),
menunjukkan bahwa lain WUS homeoboks juga dikendalikan melalui epigenetik mekanisme. itu dicatat
bahwa deposisi h3k9me2 di wox4 gen terjadi terutama selama embrio pemanjangan, dari h ke c tahap
(gambar 8). Selain itu, kami mendeteksi bahwa dari h ke c tahap, DNA metilasi (gambar 4b) serta
h3k9me2 tingkat meningkat (gambar 6b). kami juga menemukan bahwa selama transisi dari h ke c
tahap, split dari vaskular procambium terjadi (gambar 3). vaskular procambium adalah sekelompok
meristematik sel terletak di pinggiran batang dan akar yang terkait dengan sekunder pertumbuhan [68].
oleh karena itu, diambil bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa wox4 represi ditemukan pada
tahap ini (c dan h), mungkin dengan h3k9me2, merupakan langkah penting dalam memungkinkan
embrio sumbu pemanjangan. di arabidopsis dan tomat, telah menemukan bahwa wox4 ekspresi
diperlukan untuk mempromosikan procambium diferensiasi untuk mengatur lateral pertumbuhan
tanaman [15,16]. singkatnya, kami menunjukkan bahwa di bawah embriogenik kondisi, yang sel somatik
dapat memprogram epigenetically melalui perubahan dinamis dalam DNA metilasi dan histone
modifikasi untuk mempromosikan embriogenik jalur dan pengembangan somatik embrio di C.
canephora (gambar 10). hasil penelitian kami sangat menyarankan bahwa penurunan DNA metilasi dan
pengurangan represif tanda h3k9me2 dan h3k27me3 bisa langkah penting dalam memicu selular
dedifferentiation untuk memperoleh sel totipotency, Sedangkan ulang dari tanda-tanda ini tampaknya
menjadi aturan mekanisme yang tepat embrio pembangunan. peraturan lec1 dan bbm1 ekspresi oleh
h3k27me3 Mark, bersama-sama dengan represi wox4 oleh h3k9me2, mendukung gagasan bahwa
epigenetik mekanisme berkontribusi terhadap kontrol dari awal dan embrio pembangunan selama se C.
canephora.

BAHAN DAN METODE

planlet, embriogenik induksi dan pertumbuhan kondisi coffea canephora tanaman yang dibudidayakan
di murashige & skoog [69] menengah dilengkapi dengan 29.6 MM tiamin-HCL, 550 MM Myo-inositol,
0.15 MM sistein, 16.24 MM asam nikotinat, 87.64 MM sukrosa dan 0.25% (W / v) gelrite, ph 5.8 dan
berbudaya di 2562uc di bawah standar penyinaran dari 16 / 8h (150 mmol m22 S 21). Untuk
embriogenik induksi, yang planlet dipindahkan ke yang sama menengah dilengkapi dengan 0.54 MM
naftalena asam asetat dan 2.32 MM kinetin untuk 14 hari di bawah kondisi yang sama. Plantlet daun
dipotong dan lima eksplan 0,25 cm2 ditempatkan pada media cair (dimodifikasi Yasuda) seperti yang
Dijelaskan sebelumnya [38] di hadapan 5 MM 6-benzil adenin dan berbudaya di 2562uc di bawah
kondisi gelap 55 rpm. Yang planlet diperoleh dari tiga bulan yang berusia cotyledonary somatik embrio.

MIKROSKOP ELEKTRON

somatik embrio di berbeda embriogenik tahap (proembryo genic massa, bulat, jantung, torpedo
dan cotyledonary) yang tetap dalam buffer fosfat di ph 7.3 (2 MM natrium fosfat yg berdasar satu, 2
MM natrium fosfat dibasic heptahydrate dan 2.5% glutaraldehid). Vakum diterapkan selama 10 menit
dan budaya dipertahankan pada suhu kamar selama 24 h dan kemudian disimpan di 4uc, cuci dua kali
dengan yang sama buffer tanpa glutaraldehid. Tetap jaringan yang dehidrasi dalam dinilai seri dari 10,
30, 50, 70, 85, 96 dan 100% etanol, vakum diaplikasikan pada setiap langkah selama 10 menit dan
seluruh dipertahankan selama 1 h di 4uc (dua kali). Kemudian sampel secara bertahap kering ke titik
kritis dengan co2 menggunakan rambut samdri-PVT, dan kemudian yang terpasang pada logam grill
(polaron SEM lapisan sistem e s100) dan berlapis emas menggunakan 30 MA 60 detik di 120 mtorr,
sampai lapisan 150 a˚ tercapai. sampel diamati menggunakan scanning elektronik mikroskop (geol jsm
6360 lv). gambar berada diperoleh memproyeksikan gambar di sudut + 8u dan + 8u dari optik sumbu.

HISTOLOGI
 somatik embrio di berbeda embriogenik tahap diisolasi dan tetap di faa solusi [10%
formaldehida, 5% asam asetat 50% etanol (v / v)] 48 h dan dicuci lima kali dengan buffer fosfat di ph 7.3
(2 MM natrium fosfat yg berdasar satu, 2 MM natrium fosfat dibasic heptahydrate). sampel dehidrasi
dalam dinilai seri dari 10, 30, 50, 70, 85, 96 dan 100% etanol dan vakum diaplikasikan pada setiap
langkah selama 10 menit dan seluruh dipertahankan selama 1 h di 4uc (dua kali). kemudian sampel
tertanam di jb-4 resin (jb-4embedding kit, polysciences). Blok yang dipotong menjadi 5 MM irisan
menggunakan micromh HM 325 dan ganda bernoda dengan larutan periodik asam dan Schiff yang
reaktif untuk noda dinding sel dan naphtol hitam biru untuk noda protein. gambar diperoleh
menggunakan stereoscopy mzfl III (Leica).

DNA METILASI

genom DNA dari C. canephora diekstraksi sesuai dengan protokol Dijelaskan oleh echevarrı'a-
Machado et Al. [70]. secara singkat, 100 mg eksplan bawah embriogenik induksi kondisi dikumpulkan
setiap tujuh hari dari 0 56 hari, dan dari somatik embrio di berbeda pembangunan tahap
(proembryogenic massa, bulat, jantung, torpedo, cotyledonary dan planlet) dan zigotik embrio. asam
nukleat pencernaan dan pemisahan dari nukleosida Dijelaskan secara rinci oleh de-La-pen~a et Al. [71].
secara singkat, 5 mg DNA dari masing-masing sampel dihidrolisis dan dicampur dengan 5 ML dari 10x
DNA pencernaan buffer (200 MM asam asetat, 200 MM glycine, 50mm magnesium klorida, 5 MM Seng
asetat, 2 MM kalsium klorida disesuaikan dengan natrium hidroksida untuk ph 5.3), 2 ML dari dnase
saya (d2821-Sigma, 10 U / ML) dan 1 ML dari nuklease p1 (n8630-Sigma, 1.25 U / ML). setelah semalam
inkubasi pada 37uc, sampel dicampur dengan 5 ML 100 MM NaOH dan 2 ML betis usus fosfatase alkali
(p4879-Sigma, 1 U / ML). sampel diinkubasi selama 3.5 h di 37uc dan dicampur dengan fase gerak D
(50mm amonium fosfat dibasic, 15 MM amonium asetat disesuaikan dengan asam fosfat untuk ph 4.1).
setelah itu, sampel disentrifugasi di 18,0006g dan dianalisis oleh kinerja tinggi kromatografi cair (HPLC,
agilent 1200 Series). DNA metilasi persentase yang diperoleh dari fase-terbalik kromatogram,
menggunakan puncak daerah untuk menentukan konsentrasi dari 29-deoxycytosine (dc) dan 5-metil-29-
deoxycytosine (5 MDC) dalam sampel (% 5 MDC = c 5 MDC / [c 5 MDC + c dc] 6100), di mana c adalah
konsentrasi. semua analisis dilakukan dengan tiga biologis ulangan dari berbagai DNA ekstraksi.

5-AZACYTIDINE ASSAY

embriogenik budaya C. canephora diinkubasi dengan tidak adanya (kontrol) atau kehadiran dari
10 20 MM dari 5-azacytidine (Sigma) diencerkan yang sama sedang digunakan untuk embriogenik
induksi. senyawa ini telah Ditambahkan ke dalam medium setiap tujuh hari mulai dari yang berbeda
independen titik waktu (hari 7, 14, 21 dan 35) dari se budaya. kemudian somatik embrio pada setiap
embriogenik tahap dalam kontrol dan perlakuan dengan 5-azac dihitung setelah 56 hari induksi.
persentase DNA metilasi di bawah pengaruh dari 5-azac dilakukan seperti yang Dijelaskan di atas. tiga
independen tes dievaluasi.

HISTONE ISOLASI DAN BARAT BERCAK

histon dari C. canephora diisolasi dari 0.5 G dari eksplan bawah embriogenik induksi kondisi dan
somatik embrio yang berbeda embriogenik tahap (proembryogenic massa, bulat, jantung, torpedo dan
cotyledonary), seperti yang Dijelaskan oleh nic-dapat dan de-La-pen~a [72]. secara singkat, sepuluh
mikrogram protein dipisahkan 15% SDS-gel halaman dan dihapuskan pada pvdf membran (millipore
immobilon p) untuk 3.5 h di 265 MA. membran diblokir dengan 5% non-lemak kering susu, 0.5% tween
di fosfat buffered saline (tpbs). dalam semua percobaan, millipore antibodi yang digunakan sebagai
berikut: anti-h3 (kucing. # 07-690) sebagai Loading kontrol, anti-dimetil-histone h3 [lys-4] (kucing. # 07-
030), anti-trimetil histone h3 [lys-4] (kucing. # 04-745), anti-dimetil-histone h3 [lys- 9] (kucing. # 07-441),
anti-trimetil-histone h3 [lys-27] (kucing. # 07- 449). para antibodi Primer diinkubasi pada 4uc baik untuk
satu jam atau semalam dengan konstan agitasi. setelah mencuci tiga kali selama 10 menit dengan 1x
tpbs dan satu waktu dengan PBS, membran adalah diinkubasi dengan sekunder antibodi kambing anti
kelinci IGG, HRP-konjugasi (kucing. # 12-348). sinyal deteksi dicapai dengan agen immobilon Barat HRP
substrat peroksidase solusi (millipore) mengikuti instruksi pabrik. data dari tiga independen analisis
secara konsisten memberikan hasil yang sama.

URUTAN ANALISIS DAN PRIMER RANCANGAN

untuk merancang Primer untuk memperkuat se yang berhubungan dengan gen di C. canephora,
pemilihan urutan nukleotida dilakukan, Dijelaskan oleh beberapa database yang terdaftar di tabel s1.
nukleotida keberpihakan di beberapa urutan dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak
clustalw2- beberapa sequence keselarasan (http://www.ebi.ac.uk/) dan sangat kekal wilayah dipilih
untuk Primer 'desain. Primer untuk lec1, bbm1 dan wox4 yang menyadari dengan perangkat lunak
Primer 3 plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/ primer3plus / primer3plus.cgi), dan kemudian
dianalisis melalui program online oligo Analyzer 3.1 (http://www.idtdna.com/ Analyzer / aplikasi /
oligoanalyzer / default.aspx) dan DNA kalkulator (http://www.sigma-genosys.com/calc/dnacalc.asp).
Primer yang dihasilkan untuk rt-PCR terdaftar di tabel s2.

RT-PCR ANALISIS

total RNA diekstraksi 100 mg daun eksplan bawah embriogenik induksi dan dikumpulkan pada 0,
7, 14 21 hari, dan dari somatik embrio yang diisolasi dan diklasifikasikan Menurut pembangunan tahap
(proembryogenic massa, bulat, jantung, torpedo dan cotyledonary) dan zigotik embrio di cotyledonary
tahap C. canephora digunakan sebagai perbandingan. sampel jaringan yang homogen dengan Tri reagen
(Sigma) mengikuti instruksi pabrik, dan kualitas diekstraksi RNA diverifikasi pada agarosa gel 1,5%.
kuantitas yang diverifikasi di nanodrop (thermo Fisher ilmiah). untuk cdna sintesis, reverse transkripsi
reaksi dilakukan di 20 ML volume yang mengandung 1.5 mg RNA dan 200 U dari superscripttm II reverse
transcriptase (invitrogen) sesuai dengan manufactur er instruksi. Platinum taq polymerase (1.25 U,
invitrogen), 10 MM dntps, 10 MM setiap Primer (terdaftar di tabel s2) dalam 25 ML volume digunakan
selama PCR dan kondisi yang terdaftar sebagai berikut: untuk bbm1, 95uc selama 4 menit, diikuti 35
siklus 95uc 40 SEC, 65uc 45 SEC, 72uc 90 detik dan akhir siklus 72uc selama 10 menit, karena lec1, wox4
dan ubq11, 95uc selama 5 menit, diikuti 30 siklus 95uc 40 SEC, 60uc 45 SEC, 72uc 70 detik dan akhir
siklus 72uc selama 5 menit. PCR produk yang electrophoresed di 1,5% agarosa gel dan bernoda gelred
(biotium), dan gambar diperoleh. band intensitas yang diukur menggunakan gel doctm xr + system (Bio-
RAD) dan intensitas gen tersebut di atas yang normal pada konstitutif gen ubq11. masing-masing rt-PCR
dilakukan dua kali dengan tiga biologis ulangan.
KROMATIN IMMUNOPRECIPITATION (CHIP) ANALISIS

eksplan bawah embriogenik kondisi dan somatik embrio (0 dan 14 hari, proembryogenic massa,
jantung, torpedo dan cotyledonary) yang vakum-menyusup dengan formaldehida lintas menghubungkan
solusi. chip percobaan dilakukan seperti yang Dijelaskan sebelumnya oleh de-La-pen~a El di. [73],
dengan sedikit modifikasi. pada dua biologis ulangan, yang kromatin adalah immunoprecipitated
menggunakan berikut antibodi yang diperoleh dari millipore: anti trimetil-histone h3 [lys-4] (kucing. #
04-745), anti-dimetil histone h3 [lys-9] (kucing. # 07-441), anti-trimetil-histone h3 [lys-27] (kucing. # 07-
449) dan anti-dimetil-histone h3 [lys-36] (kucing. # 07-274). PCR amplifikasi dilakukan di 25 ML volume
menggunakan kondisi berikut: untuk lec1, wox4 dan ubq11, 95uc selama 5 menit, diikuti 40 siklus 95uc
40 SEC, 60uc 50 SEC, 72uc selama 2 menit dan akhir siklus 72uc selama 10 menit dan untuk bbm1, 95uc
selama 5 menit, diikuti 40 siklus 95uc 40 SEC, 65uc 50 SEC, 72uc selama 2 menit dan akhir siklus 72uc
selama 10 menit. Primer urutan yang ditunjukkan pada tabel s3. PCR produk yang electrophoresed di
1,5% agarosa gel dan bernoda gelred (biotium) dan gambar diperoleh menggunakan gel doctm xr +
system (Bio-RAD). ubq adalah konstitutif aktif gen yang membawa kedua trimethy lated lys 4 dan
dimethylated lys 9 dari histone h3 dan telah digunakan sebagai kontrol [71,74].

ANALISIS STATISTIK

semua data yang diproses dan dianalisis dengan menggunakan analisis varians (anova). tingkat
signifikansi antara berarti nilai dilakukan menggunakan tukey tes. perbedaan dianggap signifikan di p #
0.05. data dianalisis oleh asal 8 (analisis data dan grafik perangkat lunak).

PERBANDINGAN BIOINFORMATIC ANALISIS

untuk mengevaluasi chip hasil yang dihasilkan dalam penelitian ini, yang epigenomics data
(histone modifikasi dan DNA metilasi) dari arabidopsis dan beras dianalisis melalui diakses publik
database Vincent colot untuk arabidopsis (http: // epigara.biologie.ens.fr/index.html) dan rmap-peta
seperti beras genom browser [
Keluarga Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE (SERK) terdiri dari lima pengulangan
Leu-rich (LRR) -RLKs milik subkelompok II (Hecht et al., 2001) yang mengandung lima LRR dalam domain
ekstraseluler dan menampilkan kesamaan dengan DcSERK yang dijelaskan sebelumnya. protein yang
menandai kompetensi embriogenik dalam kultur jaringan wortel (Daucus carota) (Schmidt et al., 1997).
Fitur utama yang membedakan protein SERK dari RLK lain adalah domain Pro-kaya yang mengandung
motif SPP yang terletak di antara LRR dan domain transmembran. Kehadiran domain SPP bersama-sama
dengan lima LRR digunakan sebagai kriteria untuk mengidentifikasi empat gen SERK (SERK2-SERK5) di
antara banyak gen pengkode LRR-RLK dalam database Arabidopsis (Hecht et al., 2001) . Analisis urutan
protein SERK yang berbeda menunjukkan bahwa mereka muncul melalui peristiwa duplikasi gen yang
menghasilkan dua prekursor leluhur, SERK1-SERK2 dan SERK3-SERK4-SERK5. Prekursor tersebut
selanjutnya diduplikasi dan bermutasi untuk menghasilkan lima anggota SERK saat ini (Hecht et al.,
2001; He et al., 2007). Gen SERK3 diidentifikasi sebagai BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1 (BRI1) -
ASSOCIATED KINASE1 (BAK1) melalui interaksi dengan BRI1 dalam layar ragi dua-hibrida (Nam dan Li,
2002) dan dalam layar genetik untuk penekan fenotip bri1 lemah (Li et al., 2002).