DETEKSI MOLEKULER GEN ampC PADA ISOLAT KLINIS Klebsiella

pneumoniae PENGHASIL ESBL DI RSUP SANGLAH DENPASAR

I Gusti Ngurah Krishna Priyaka1, Ni Nengah Dwi Fatmawati2*, Ni Made Adi
Tarini3
1
Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas Kedokteran Universitas Udayana
2
Departemen/SMF Mikrobiologi Klnik RSUP Sanglah
*email: nnd.fatmawati@unud.ac.id

ABSTRAK

Sifat resistensi yang dimiliki oleh bakteri merupakan salah satu masalah pada
kasus - kasus Healthcare Associated Infections (HAIs). Klebsiella pneumoniae bisa
bersifat resisten terhadap antibiotik jenis cephalosporin akibat diproduksinya enzim
AmpC yang dikode oleh gen ampC. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui prevalensi
gen ampC dari isolat klinis K. pneumoniae penghasil ESBL di RSUP Sanglah tahun 2013.
Penelitian ini menggunakan metode deskriptif cross-sectional. K. pneumoniae diisolasi
dari spesimen klinis di Instalasi Mikrobiologi Rumah Sakit Umum Pusat (RSUP) Sanglah
selama tahun 2013. Uji fenotif DDST lalu dilakukan pada sampel untuk mendeteksi
enzim ESBL. Selanjutnya uji genotif PCR dan sequencing dilakukan untuk mendeteksi
gen ampC. Dalam penelitian ini ditemukan hasil PCR 4 sampel positif dengan panjang
pita yang tidak sesuai. Salah satu sampel lalu di-sequencing untuk mengidentifikasi gen
yang terdeteksi tersebut. Uji sequencing menemukan gen yang terdeteksi adalah fragmen
gen yang mengkode enzim alpha—amylase pada K. pneumoniae. Penelitian ini
menunjukan gen ampC pada K. pneumoniae belum berhasil teramplifikasi melalui uji
genotif PCR. Empat sampel terdeteksi memiliki fragmen gen yang mengkode enzim
alpha-amylase dari hasil sequencing dan analisis. Perlu dilakukan penelitian lanjutan
dengan menggunakan kontrol positif dan primer lain yang lebih spesifik.

Kata Kunci: Klebsiella pneumoniae, HAIs, AmpC, ESBL, PCR

ABSTRACT

Resistance characteristic of bacteria is one of the many problems in Healthcare

Associated Infections (HAIs). Klebsiella pneumoniae can become resistant to
cephalosporine antibiotics by producing AmpC enzyme which is decoded by ampC gene.
This study aims to determine the prevalence of ampC gene from clinical isolates of ESBL-
producing K. pneumoniae in Sanglah General Hospital in 2013. This study used
descriptive cross-sectional method. K. pneumoniae were isolated from clinical
speciments in Microbiology Installment of Sanglah General Hospital during 2013. DDST
pheontypic test then conducted to the samples in order to detect ESBL enzyme. PCR and
sequencing was then done to detect ampC gene. The results were analyzed descriptively.
This study found 4 samples to be positive, but with bands which were inappropriate in
size. One of the samples then sequenced to identify the detected gene. The sequencing
result showed that the detected gene was a fragment of gene that decodes alpha-amylase
enzyme in K. pneumoniae. This study shows ampC gene in K. pneumoniae could not be
amplified by PCR genotypic test yet. Four samples were detected to have a fragment of
gene that decodes alpha-amylase enzyme in K. pneumoniae. Further study with positive
control and other primers is needed.
Keywords: Klebsiella pneumoniae, HAIs, AmpC, ESBL, PCR

PENDAHULUAN diantaranya adalah grup dengan sifat

Kemampuan bakteri untuk resistensi terhadap antibiotik golongan
mengembangkan sifat resistensi terhadap cephalosporin.3 Antibiotik golongan
antibiotik merupakan suatu permaslahan. cephalosporin masih merupakan obat
Sifat resistensi yang dimiliki bakteri ini pilihan untuk penanganan penyakit
berdampak signifikan pada penanganan infeksi Klebsiella.3,4
penyakit yang akan menjadi lebih sulit Enzim yang menyebabkan
dan lama, sehingga menyebabkan terjadinya resistensi terhadap antibiotik
meningkatnya biaya perawatan.1 Sifat jenis cephalosporin ini adalah enzim -
resistensi antibiotik ini juga berdampak lactamase golongan AmpC. Enzim
pada berbagai penyakit infeksi di rumah AmpC ini dapat berasal dari deregulasi
sakit atau Healthcare Associated gen kromosomal ampC atau didapatkan
Infections (HAIs).1,2 dari gen yang ditransfer antar populasi
Salah satu bakteri dengan sifat bakteri melalui plasmid yang sering
resistensi yang dikhawatirkan adalah disebu t dengan plasmid-mediated AmpC
Klebsiella pneumoniae. K. pneumoniae -lactamases. K. pneumoniae
merupakan salah satu bakteri gram merupakan salah satu bakteri yang
negatif komponen flora normal di lapisan mendapatkan gen ampC tersebut melalui
mukosa saluran pencernaan manusia.1 K. transfer gen antar plasmid.4
pneumoniae bisa menjadi resisten Enzim -lactamase jenis AmpC
terhadap antibiotik dengan cara ini juga dapat diproduksi bersamaan
memproduksi enzim -lactamase, yang dengan enzim -lactamase jenis
akan menghidrolisis cincin -lactam Extended-Spectrum--Lactamase
pada antibiotik – antibiotik jenis - (ESBL) pada satu organisme, tapi pada
lactam, seperti cephalosporin dan umumnya efek dari AmpC -lactamase
penicillin. Pada tahun 1995, Bush et al. ini akan menutupi efek dari ESBL
mengklasifikasikan enzim - enzim - tersebut, akibatnya hasil pada tes
lactamase menjadi 3 grup. Salah satu identifikasi -lactamase nanti akan
disalahinterpretasikan menjadi ESBL klinik kasus - kasus infeksi nosokomial
negatif. Hal ini akan membuat di RSUP Sanglah, Denpasar.
identifikasi dari -lactamase secara
fenotipik menjadi sulit, sehingga METODE PENELITIAN
identifikasi dan isolasi dengan Penelitian ini menggunakan
menggunakan teknik Polymerase Chain rancangan penelitian potong lintang
Reaction atau PCR masih merupakan (cross-sectional). Penelitian dilakukan
pilihan.3,4 selama 10 (sepuluh) bulan dimulai pada
Perlu dilakukan penelitian untuk bulan Februari 2015 - November 2015 di
bisa lebih memahami mekanisme Instalasi Mikrobiologi Klinik RSUP
resisten yang melibatkan gen ampC Sanglah dan Laboratorium Mikrobiologi
tersebut untuk kepentingan FK UNUD.
penatalaksanaan terapi nantinya pada Sampel penelitian adalah semua
penyakit infeksi K. pneumoniae. isolat klinis K. pneumoniae yang
Membedakan antara organisme – terisolasi periode 2013, dan
organisme yang mengekspresikan ESBL menunjukkan hasil positif ESBL yang
dari organisme – organisme yang diuji dengan metode Double Disk
mengekspresikan plasmid-mediated Synergy Test (DDST). Sampel
AmpC -lactamase juga diperlukan ditentukan secara convenient purposive
untuk kepentingan surveilans, sampling, dan ditemukan 5 isolat dengan
epidemiologi, dan kontrol infeksi di hasil ESBL positif.
rumah sakit, ditambah lagi dengan Kelima isolat tersebut lalu diisolasi
kemampuan gen ampC ini untuk menggunakan High Pure Purification
ditransfer antar populasi bakteri.4 Belum Kit (Roche®), lalu dilakukan PCR Go
tersedianya data mengenai prevalensi Green Taq (Promega®) untuk
gen ampC pada bakteri K. pneumoniae di mendeteksi gen resistensi ampC. Primer
RSUP Sanglah, Denpasar membuat yang digunakan adalah blaFOX dengan
peneliti tertarik untuk melakukan panjang 189 base pair, dengan
penelitian epidemiologi molekuler yang konsentrasi sebanyak 0,4 µl.5 PCR
bertujuan untuk mendeteksi dan dijalankan sebanyak 35 siklus, dengan
mengidentifikasi gen ampC bakteri K. suhu annealing optimal pada 58OC.
pneumoniae penghasil ESBL dari isolat
Elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan gel agarosa 2%.

Tabel 1. Deskripsi primer blaFOX5

Primer Sequence
BlaFOX
Forward AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G

Gambar 1. Produk PCR yang

Reverse CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG
menunjukan panjang pita sekitar 550 bp

Sequencing kemudian dilakukan

HASIL PENELITIAN pada salah satu sampel, yaitu u172 untuk
Sampel isolat klinis K. mengetahui gen apa yang terdeteksi
pneumoniae yang digunakan dalam tersebut. Hasil sequencing dari sampel
penelitian ini terdiri dari 5 sampel (u101, u172 diedit dan dianalisis dengan
u172, u177, u195, u248) yang diisolasi software MEGA, lalu dicocokkan
dari urin di Instalasi Mikrobiologi dengan database gen pada GenBank
Rumah Sakit Umum Pusat (RSUP) dengan menggunakan Basic Local
Sanglah selama tahun 2013. Uji genotif Alignment Search Tool (BLAST)
lalu dilakukan dengan teknik PCR (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
dilakukan untuk mendeteksi gen ampC dan didapatkan bahwa gen yang
blaFOX. Panjang pita yang diharapkan terdeteksi adalah gen yang mengkode
dari produk PCR sesuai dengan primer enzim alpha-amylase pada K.
yang digunakan adalah 189 base pair pneumoniae (Gambar 2).
4
(bp). Dari lima sampel didapatkan
empat sampel (u101, u172, u195, u248) PEMBAHASAN
yang positif namun menunjukan panjang Plasmid mediated AmpC β-
pita sekitar 550 bp, sehingga tidak sesuai lactamases dari isolat K. pneumoniae
dengan panjang yang diharapkan, seperti pertama kali dilaporkan tahun 1989 di
yang ditunjukkan pada Gambar 1. Seoul, Korea Selatan. Selanjutnya, 29
jenis gen plasmid mediated AmpC β-
lactamases sudah dilaporkan di seluruh
dunia. Plasmid mediated AmpC β-
 Gambar 2. Hasil BLAST dari hasil sequencing yang merupakan fragmen gen
pengkode alpha-amylase pada K. pneumoniae.
lactamases merupakan ancaman karena prevalensi gen ampC sebesar 5,8% dari
bersifat resisten terhadap β-lactamase K. pneumoniae penghasil ESBL.7,8
inhibitor dan jika terjadi hilangnya outer Penelitian ini belum berhasil
membrane porin dapat bersifat resisten mengamplifikasi fragmen gen ampC
terhadap karbapenem juga. Mekanisme yang dimiliki K. pneumoniae penghasil
resisten di K. pneumoniae seperti ini enzim ESBL. Deteksi gen ampC
sudah menyebabkan wabah nosokomial menggunakan primer FOXMF dan
di berbagai negara.6 FOXMR seharusnya mempunyai ukuran
Belum tersedia data mengenai amplicon sebesar 189 bp.4 Namun
prevalensi gen ampC yang dimiliki K. penelitian ini menemukan ukuran
pneumoniae penghasil enzim ESBL di amplicon sebesar 550 bp di keempat
Indonesia. Sebuah penelitian mengenai sampel (u101, u172, u195, u248). Hasil
tren resistensi antimikrobial di Asia- sequencing dan analisis menunjukan
Pasifik melaporkan prevalensi gen ampC bahwa gen yang terdeteksi ini
yang dimiliki K. pneumoniae merupakan fragmen dari gen yang
yang juga penghasil ESBL sebesar 9,6%. mengkode enzim alpha-amylase pada K.
Sedangkan di Amerika Serikat, pneumoniae. Alpha-amylase adalah
penelitian sebelumnya mendapatkan sebuah enzim protein yang
menghidrolisis polisakarida seperti pati
dan glikogen untuk menghasilkan
glukosa dan maltosa.9
Penemuan ukuran pita yang tidak
sesuai ini bisa disebabkan oleh primer
yang kurang spesifik. Kebanyakan
primer dirancang secara kualitatif dan
belum mempertimbangkan prinsip –
prinsip termodinamika dan struktural.
Primer yang ideal seharusnya mampu
menekan amplifikasi dari gen yang tidak
diinginkan.9,10 Peneliti telah melakukan
uji konfirmasi apakah primer yang
digunakan spesifik untuk gen ampC
dengan menggunakan BLAST dan hasil
menunjukkan bahwa primer spesifik
untuk ampC, namun pada penelitian ini
peneliti belum berhasil menemukan pita
189 bp yang merupakan panjang
fragmen gen ampC yang dimaksud.
Suasana PCR yang kurang
optimal juga bisa menyebabkan
didapatkannya ukuran pita yang tidak
sesuai. Suasana optimal PCR sangat
bergantung pada suhu annealing. Jika
suhu annealing terlalu rendah, annealing
primer akan menjadi tidak spesifik dan
menyebabkan amplifikasi dari segmen
DNA yang tidak diinginkan. Suhu
annealing biasanya akan berada 3-5oC
lebih rendah dari melting temperature
primer yang sudah dihitung. Banyak
rumus yang bisa digunakan untuk
menghitung melting temperature, tapi
tidak ada rumus yang benar - benar
akurat untuk semua primer.10 Peneliti
telah melakukan optimasi beberapa kali
dengan mengatur konsentrasi primer dan
suhu penempelan primer, namun selalu
didapatkan pita sepanjang 550 bp,
sehingga langkah selanjutnya dilakukan
sequencing untuk memastikan urutan
nukleotidanya.
Penemuan ukuran pita yang tidak
sesuai ini seharusnya bisa dibandingkan
dengan kontrol positif. Tapi dalam
penelitian ini sulit untuk mendapatkan
kontrol positif dari K. pneumoniae yang
memiliki gen ampC, sehingga tidak bisa
dilakukan perbandingan. Hal ini menjadi
salah satu keterbatasan dalam penelitian
ini.10
SIMPULAN DAN SARAN
Pada penelitian ini belum
ditemukan keberadaan gen ampC
(blaFOX) dari isolat klinis K. pneumoniae
dengan menggunakan uji genotif PCR.
Empat sampel terdeteksi memiliki gen
alpha-amylase dari hasil sequencing dan
analisis.
Perlu dilakukan penelitian
lanjutan mengenai prevalensi gen ampC
pada K. pneumoniae penghasil enzim
ESBL di RSUP Sanglah dengan Genes in Clinical Isolates by Using
Multiplex PCR. J Clin Microbiol.
menggunakan kontrol positif dan primer 40(6): 2153-2162.
lain yang lebih spesifik untuk 5. Yan, J., Hsueh, P., Lu, J., Chang, F.,
Shyr, J., Wan, J., dkk. 2006.
mengetahui epidemiologi molekuler,
Extended-Spectrum β-Lactamases
mekanisme resisten dan hubungan and Plasmid-Mediated AmpC
Enzymes among Clinical Isolates of
masing – masing antara gen resistensi Escherichia coli and Klebsiella
antibiotik lainnya. pneumoniae from Seven Medical
Centers in Taiwan. Antimicrob
Agents Chemother. 50(5): 1861-
1864.
UCAPAN TERIMA KASIH
6. Mohammudha, P.R., Harish, B.N.,
Peneliti ingin mengucapkan Parija, S.C. 2012. Molecular
description of plasmid-mediated
terima kasih yang sebesar – besarnya
AmpC β-lactamases among
terhadap semua pihak yang sudah nosocomial isolates of Escherichia
coli & Klebsiella pneumoniae from
membantu jalannya penelitian ini, six different hospitals in India.
terutama Bagian/SMF Mikrobiologi FK Indian J Med Res 135, January
2012: 114-119.
UNUD/RSUP Sanglah, Instalasi 7. Sheng, W.H., Badal, R.E., Hsueh,
Mikrobiologi Klinis RSUP Sanglah, dan P.R. 2013. Distribution of Extended-
Spectrum  -Lactamases, AmpC  -
Laboratorium Mikrobiologi FK UNUD. Lactamases, and Carbapenemases
Peneliti tidak memiliki konflik among Enterobacteriaceae Isolates
Causing Intra-Abdominal Infections
kepentingan dalam penelitian ini. in the Asia-Pacific Region: Results
of the Study for Monitoring
Antimicrobial Resistance Trends
(SMART). Antimicrobial Agents
DAFTAR PUSTAKA and Chemotherapy. 57(7): 2981-
2988.
1. Centers for Disease Control and
Prevention (CDC). 2013. Antibiotic 8. Alvarez, M., Tran, J.H., Chow, N.,
Resistance Threats in the United Jacoby, G.A. 2004. Epidemiology
States. Atlanta. of Conjugative Plasmid-Mediated
AmpC  -Lactamases in the United
2. World Health Organization (WHO). States. Antimicrobial agents and
2014. Antimicrobial Resistance Chemotherapy. (48)2: 533-537.
Global Report on Surveillance.
Geneva. 9. Tilley, L.P., Smith Jr., F.W.K.,
Allen, D. 2003. Stedman’s Medical
3. Dhillon, R.H.P., Clark, J. 2012. Dictionary. 27th edition. Baltimore:
ESBLs: A Clear and Present Lippincott Williams & Wilkins. p.
Danger?. Dalam: Critical Care 65.
Research and Practice, Vol. 2012:
1-11 10. Sambrook, J.F., Russell, D.W. 2001.
Molecular Cloning: A Laboratory
4. Pérez-Pérez, F.J., Hanson, N.D. Manual,Vol. 2. Third edition. Cold
2002. Detection of Plasmid- Spring Harbor Laboratory Press. p.
Mediated AmpC β -Lactamase 8.8-8.24.