Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion adalah contoh-contoh dari
kromatografi kolom. Pada metode kroma- tografi cair ini Partikel dengan dimensi yang bervariasi
digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya sedemikian rupa
sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang
seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan
untuk menambah laju aliran tanpa mengubah tinggi piringan teoretis kolom. Penurunan ukuran partikel
penunjang stasioner tidak selalu menguntungkan. Kroma tografi cair kinerja tinggi atau phy (HPLC)
berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8
mm dengan ukuran partikel penunjang 50 m, sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang
tinggi Bilà dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair/gas liquid chro- matography (GLC), maka HPLC
lebih bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara termal tidak
stabil Tetapi ditinjau dari kecepatan dan kesederhanaan, GC lebih baik. Kedua teknik ini komplementer
satu sama selektif hanya memerlukan sampel berjumlah sedikit serta keduanya dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif. digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. high performance liquid
chromatogra lainnya, keduanya efisien, sangat

Prinsip HPLC

Luas puncak kromatografi pada korva elusi dipengaruhi oleh tiga pro- ses perpindahan massa yaitu difusi
Eddy, difusi longitudinal dan transfer massa tidak setimbang. Sedangkan parameter-paramcter yang
menen tukan berlangsungriya proses-proses tersebut adalah: laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dari
ketebalan stasioner. Van Deemeter menghubung kan ketiga proses di atas dengan efisiensi kolom dalam
suatu persamaan.

Persamaan ini telah teruji dengan metode kromatografi gas. Menurut laju aliran ( Van Deemeter
hubungan antara dengan tinggi piringan dapat dinyatakan dengan: (rumus)

A suatu variabel yang berasal dari difusi Eddy, B variabel yang ber hubungan dengan difusi longitudinal,
Cmenyangkut transfer massa tidak setimbang. Hubungan antara diameter partikel rata-rata dengan
difusi Eddy (A) adalah A 21 dR , di mana A adalah faktor penjejalan kolom Sedangkan difusi longitudinal
(B) ditimbulkan sebagai akibat dari ke cenderungan molekul untuk berpindah dari bagian tengah
penampang piringan kolom yang konsentrasinya lebih tinggi ke bagian tepi piringan yang konsentrasinya
lebih rendah. Besarnya difusi longitudinal adalah B 2 D di mana adalah faktor yang merupakan ukuran
rentangan suatu molekul bebas untuk berdifusi, sedangkan D adalah koefisien difusi zat terlarut dalam
fase bergerak. Transfer massa tidak setimbang (C) akan melebarkan puncak akibat gerakan fase
bergerak yang tinggi Faktor C dalam persamaan Van Deemeter ini dapat dinyatakan dengan (rumus)

Instrumentasi, Gambar 14.3 menunjukkan diagram dasar suatu HPLC, Penampung pelarut (A, B, C) dan
sistem pengeluaran gas (D, E, F)isangatlah penting: Penampang pelarut A. B. C dapat menampung
sebanyak 2 liter (gambar)
pelarut. Gas yang terlarut pada pelarut dapat dikeluarkan dengan sistem D, E, F yang bekerja
berangkaian dengan pompa vakum Pemisahan dengan pelarut tunggal disebut elusi isokratik, sedangkan
elusi gradien dua pelarut dengan berbagai perubahan komposisi dialir kan. Suatu HPLC yang baik
seharusnya mempunyai lebih dari dua penampang pelarut. Pelarut dialirkan ke botol penyampur (M)
pada berbagai laju aliran. Sebagian besar pompa HPLC mempunyai keluaran tekanan 1000-6000 psi, dan
mampu menghasilkan aliran sampai 20 ml/ menit. Pompa jenis puntiran sekrup (screw driven pump)
dan pompa tarik dorong (reciprocating pump) sering digunakan. Screw driven pump menghasilkan
pengaliran pelarut bebas pulsa. Sedangkan reci procating pump lebih sering digunakan meskipun
menghasilkan aliran berpulsa yang kelak harus ditiadakan. Reciprocatíng pump lebih populer karena
dapat menggunakan jumlah volume yang tidak terbatas, tidak seperti dilakukan dengan sistem
reciprocating pump. Kadangkala pompa pneumatik juga digunakan. Cairan tidak mudab dikompresi
sehingga tekanan tinggi yang terbentuk pada sistem pompanya tidaklah berbahaya Prekolom berisi
penunjang stasioner yang sama tografinya, hanya saja ukuran partikelnya lebih besar. Peranan prekolom
terutama menghilangkan pengotor pada pelarut. Sampel dimasukkan screw driven pump dan juga elusi
gradien hanya dapat dengan kolom kroma dalam sistem injeksi dengan penyuntik hiperdemik. Sampel
sampai sejumlah 2-100 ul dapat ditampung dalam sistem injeksinya Seperti pada kromatografi gas cair,
suatu septum dari silikon atau teflon digunakan sehingga sistem injeksi dapat tertutup dengan
sendirinya (self sealing septum). Kolomnya dapat berupa gelas atau baja tidak berkarat. Kolom gelas
dapat menahan tekanan sampai 600 psi. Panjang kolom bervariasi dari 15-150 cm. Pengisi kolom
biasanya adalah silika gel, alumina dan elit. Pengisi kolom seperti partikel pellicular, yaitu butiran gelas
yang dilapisi dengan materi berpori seperti silika gel, alumina atau penukar ion, juga sering digunakan.
Bila ditinjau dari persamaan Van Deemeter, maka nilai C akan besar untuk jenis kolom ini, tetapi
kapasitasnya rendah. Pemisahan dengan HPLC biasanya dilakukan pada temperatur kamar Detektor
yang digunakan untuk HPLC bergantung pada tipe sampel yang dipisahkan. Dasar pengukuran UV,
absorpsi IR, pendar fluor, indeks refraksi, konduktansi, polarografi, geiger counter, spektroskopi dapat
digunakan. Kecuali indeks refraksi, detektor tersebut di atas ber- sifat sangat selektif. Detektor
konduktometer dan polarografi dipengaruhi oleh variasi laju aliran. Detektor spektroskopi tidak
dipengaruhi temperatur, sedangkan detektor UV, IR dan pendar fluor sedikit dipengaruhi perubahan
temperatur. Akurasi detektor fotometer iebih rendah daripada detektor spektrofotometer. Detektor UV
umumnya digunakan untuk analisis bahan organik bergugus fungsi Detektor indeks refraksi akan
memberikan respons terhadap semua massa massa dan radioaktivitas jenis zat telarut. Kromatogram
dicatat dengan pencatat potensiometrik yang diadapta sikan kepada detektor partikelir. Jawaban
menjadi 0,5 detik atau lebih Untuk skala penuh untuk menghindarkan distorsi kecepatan elusi. Kece-
patan harus diatur.

Penunjang

Penunjang fase diam harus tahan terhadap tekanan. Biasanya penunjang anorganik bersifat stabil dan
tahan sampai tekanan 600 at- mosfer. Struktur dengan pori-pori yang besar akan rusak bila diberi
tekanan tinggi. Penukar ion menmpunyai permeabilitas yang rendah bila diberi tekanan. Penunjang yang
baik adalah silika gel dan alumína Penunjang dengan bahan kimia di permukaannya (bonded phase)
mempunyai kelebihan karena tidak perlu dijenuhkan lagi permukaannya oleh fase cair dan tidak
memerlukan prekolom. Fase diam terikat secara kovalen dengan permukaan zat pada penunjang
sehingga diharapkan tidak mudah lepas dan mengkontaminasi efluent Penunjang dengan kemampuan
penukar ion pemakaiannya terbatas, karena mudah terkompresi, tetapi saat ini bermacam resin sintetis
yang tahan tekanan sampai 200 atmosfer sudah dapat diperoleh. Resin demikian mempunyai kapasitas
penukar penukar ion spesifik saat ini sudah mulai dipasarkan Penunjang fase diam untuk kromatografi
eksklusi lebih rumit daripada resin penukar ion. Hampir tidak tahan tekanan. Penyusutan volume akan
terjadi sehingga permeabi litasnya turun dan akibatnya efisiensi pemisahan menurun ion antara 3
sampai 5 meq/g. Resin semua tipe gel dalam kolom untuk jenis eksklusi.

Pemakaian

HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-
zat dengan kepolaran berbeda; yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC
berda sarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis kan zat berpori. Penukar ion gel silika yang dimodifikasi
secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya
lebih pendek. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada dimodifikasi secara kimia
mempunyai kapasitas tukar tinggi, vitamin- vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan.
Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya
tetap sama masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode
kolom kromatografi rezin Zipax SAX. Penukar ion gel silika yang yaitu penentuan berat molekul polimer
dan