KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)

PADA KIJING Anodonta woodiana (Lea, 1834)

RATNA PUSPITA

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
 ABSTRAK
RATNA PUSPITA. Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Kijing
Anodonta woodiana (Lea, 1834). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan SATA
YOSHIDA SRIE RAHAYU.

Anodonta woodiana merupakan kerang air tawar yang telah banyak dibudidayakan karena
kemampuannya untuk memproduksi mutiara. A. woodiana memiliki kemampuan untuk
menghasilkan nacre dan kristal prismatik penghasil mutiara. Kemampuan tersebut erat kaitannya
dengan informasi genetik yang dimiliki oleh spesies ini. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji
karakteristik gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada kijing A. woodiana asal Jawa Barat.
DNA genom diekstraksi dari otot kaki kijing A. woodiana asal Bogor dan Depok. DNA total hasil
ekstraksi dilanjutkan pada proses amplifikasi dan sekuensing gen COI. Gen COI A. woodiana
disejajarkan dengan beberapa gen COI spesies lain yaitu ingroup (famili Unionidae) dan outgroup
yang diperoleh dari GenBank. Amplifikasi gen COI berhasil dilakukan dengan ukuran 608 bp.
Penelitian ini belum mampu mengkarakterisasi gen COI A. woodiana dengan baik karena beberapa
faktor penghambat. Panjang nukleotida A. woodiana sebesar 608 bp belum dapat dijadikan sebagai
barcode dari spesies tersebut. Analisis hubungan kekerabatan pada A. woodiana menunjukkan
bahwa A. woodiana terpisah dari pengelompokkan dengan anggota famili Unionidae lainnya.

Kata kunci: Anodonta woodiana, COI, karakteristik

ABSTRACT
RATNA PUSPITA. Characteristic of Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene in Freshwater
Mussel (Anodonta woodiana Lea, 1834). Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and SATA
YOSHIDA SRIE RAHAYU.

Anodonta woodiana is one of freshwater mussel which have been widely cultivated for its
ability to produce pearls. A. woodiana has the ability to produce nacre and prismatic crystal that
produce pearls. This ability is closely related to genetic information in this species. The aim of this
study was to examine the characteristic of cytochrome oxidase subunit I (COI) gene in freshwater
mussel A. woodiana from West Java Province. Genomic DNA was extracted from tissue of A.
woodiana from Bogor and Depok. Extracted DNA continued by amplification and sequencing of
COI gene. COI gene was aligned with some COI genes from other species, ingroup (familiy
Unionidae) and outgroup obtained from GenBank. Amplified of COI gene were successfully
yielded in 608 bp. This study was not able to characterize COI gene of A. woodiana well because
there are inhibitors. Nucleotid along 608 bp can not be used as a barcode. Phylogenetic analysis of
A. woodiana showed that A. woodiana is separated from other family Unionidae.

Key words: Anodonta woodiana, COI, characteristic

KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI)
PADA KIJING Anodonta woodiana (Lea, 1834)

RATNA PUSPITA

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI)
pada Kijing Anodonta woodiana (Lea, 1834)
Nama : Ratna Puspita
NIM : G34070040

Disetujui

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Dr. S.Y. Srie Rahayu, M.Si, S. Pi
NIP. 19561102 198403 1 003 NIP. 10300012364

Diketahui

Ketua Departemen Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S

NIP. 19641002 198903 1002

Tanggal Lulus:
 PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan
Ibu Dr. S.Y. Srie Rahayu, M.Si, S.Pi selaku pembimbing atas arahan, saran, dan bimbingan selama
proses penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir.
Nurlisa A. Butet, M.Sc atas segala bantuan, nasihat, dan doanya. Terima kasih kepada Ibu,
Almarhum Bapak, serta seluruh keluarga, atas dukungan, doa, dan kasih sayangnya. Tak lupa
penulis ucapkan terima kasih kepada teman seperjuangan: Dini, Dewi, Gita, Kak Nining, dan Fery
atas bantuan dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian. Penulis berharap semoga karya
ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, Maret 2013

Ratna Puspita
 RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 25 Maret 1989 dari ayah Sukardi (Alm) dan ibu
Syahira. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari MAN
8 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Institut Pertanian
Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi. Penulis
mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM) dari DIKTI pada tahun 2009 dan BCA
pada tahun 2010-2012.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif mengikuti organisasi Himpunan Mahasiswa
Biologi (HIMABIO) dan Badan Pengawas Himpro (BPH). Selain itu, penulis pernah menjadi
asisten praktikum mata kuliah Botani Umum pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis telah
melaksanakan Praktik Lapangan pada bulan Juli-Agustus 2010 di PT. Krama Yudha Ratu Motor
dengan judul “Pengolahan Limbah Cair di PT. Krama Yudha Ratu Motor Jakarta Timur”.
 DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................vii

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................vii
PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1
Latar Belakang ........................................................................................................................ 1
Tujuan ..................................................................................................................................... 1
BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1
Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 1
Bahan ...................................................................................................................................... 1
Metode .................................................................................................................................... 1
Ekstraksi dan Purifikasi DNA .............................................................................................. 1
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA.......................................................................... 2
Perunutan Produk PCR (Sekuensing) ................................................................................... 2
Analisis Data dan Filogeni ................................................................................................... 2
HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................................... 3
Hasil ....................................................................................................................................... 3
Ekstraksi DNA Total ........................................................................................................... 3
Amplifikasi Daerah COI ...................................................................................................... 3
Sekuens dan Perunutan Produk PCR Daerah COI................................................................. 3
Analisis Filogeni ................................................................................................................. 4
Pembahasan............................................................................................................................. 4
SIMPULAN ................................................................................................................................ 5
SARAN ....................................................................................................................................... 5
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 5
 1

DAFTAR GAMBAR
Halaman

1 Hasil ekstraksi DNA total otot kijing pada gel agarosa 1.2%................................................…..3
2 Hasil amplifikasi gen COI pada gel agarosa 1.2%................................................................…..3
3 Visualisasi hasil pre-treatment produk PCR pada gel agarosa 1%........................................…..4
4 Posisi segmen gen COI A. woodiana berdasarkan gen COI M. edulis...................................…..4
5 Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 495 nukleotida COI dengan metode
Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance.......................................................4

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman

1 Pensejajaran berganda nukleotida (612 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen
Mytilus edulis yang berasal dari GenBank.............................................................................…..8
2 Pensejajaran berganda nukleotida (495 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen
lain yang berasal dari GenBank.................................................................................................10
3 Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah
COI pada A. woodiana dengan beberapa pembandingnya (ingroup dan outgroup)
yang berasal dari GenBank.…………............................................................................………17

PENDAHULUAN
Latar belakang
Kerang air tawar Anodonta woodiana
(Kijing Taiwan) merupakan salah satu
sumberdaya perikanan air tawar yang
memiliki potensi ekonomi dan ekologi yang
besar bagi masyarakat Indonesia (Hamidah
2006). Kijing bivalvia famili Unionidae ini
dapat dimakan, cangkangnya berguna untuk
bahan baku industri kancing, dan pakan
ternak. A. woodiana bersifat filter feeder,
dapat mengurangi pencemaran lingkungan
(Rahayu et al. 2013). Berdasarkan hasil
penelitian Krolak dan Zdanowski (2001),
kijing ini memiliki kemampuan sebagai
bioakumulator sehingga dapat mengurangi
kadar logam berat di Danau Konin,
Polandia.
Saat ini, kijing A. woodiana telah banyak
dibudidayakan karena kemampuannya untuk
memproduksi mutiara (Rachman et al.
2009). Secara fisiologis, A. woodiana
mempunyai kemampuan untuk
menghasilkan nacre dan kristal prismatik
penghasil mutiara (Ram dan Misra 2003).
Kualitas lapisan mutiara (nacre) merupakan
salah satu faktor yang mempengaruhi
kualitas mutiara yang dihasilkan (Rachman
et al. 2009). Kemampuan tersebut erat
kaitannya dengan faktor genetik yang
dimiliki oleh spesies ini. Oleh karena itu,
karakteristik genetik dari organisme ini
menarik untuk dipelajari. Informasi
mengenai karakteristik genom hewan ini
masih terbatas sehingga perlu dilakukan
penelitian dasar yang dapat mendukung
kemudahan penggalian informasi lebih
mendalam.
Informasi genetik dalam hewan disimpan
dalam DNA inti dan DNA organel
(mitokondria dan kloroplas) (Nuryanto dan
Solihin 2006). Penggunaan DNA
mitokondria (mtDNA) dalam studi
keragaman genetik memiliki beberapa
kelebihan. mtDNA terdapat dalam jumlah
kopi yang tinggi sehingga mudah diisolasi
untuk berbagai keperluan analisis genom.
Ukuran mtDNA relatif kecil sehingga dapat
dipelajari secara menyeluruh sebagai satu
kesatuan yang utuh (Solihin 1994). Gen
cytochrome oxidase subunit I (COI)
merupakan salah satu gen penyandi protein
di dalam genom mitokondria (mtDNA).
Gen COI digunakan untuk mempelajari
karakteristik genetik antar spesies maupun
antar individu (Hebert et al. 2003). COI juga
dapat digunakan sebagai barcode.
1
Perkembangan literatur tentang barcode
DNA menunjukkan bahwa sebuah fragmen
pendek COI dapat digunakan sebagai
penanda variasi yang secara akurat dapat
mengidentifikasi berbagai macam hewan
sampai tingkat spesies (Luo et al. 2011).
Kajian molekuler terhadap A. woodiana
di Indonesia masih sangat kurang.
Berdasarkan basis data genetik di GenBank,
belum ada data lengkap genom spesies A.
woodiana terutama asal Indonesia. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat digunakan
sebagai informasi dasar mengenai
karakteristik genetik kijing A. woodiana.
Tujuan
Penelitian bertujuan untuk mengkaji
karakteristik gen cytochrome oxidase
subunit I (COI) pada kijing Anodonta
woodiana asal Jawa Barat.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan
September 2011 hingga bulan Desember
2012, bertempat di Laboratorium Biologi
Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya
Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan
Laboratorium Terpadu Departemen Biologi.
Bahan
Bahan yang digunakan adalah otot kaki
kijing Anodonta woodiana. Sampel kijing
diperoleh dari dua tempat berbeda, yaitu
kolam Departemen Budidaya Perairan,
Institut Pertanian Bogor dan kolam Balai
Penelitian dan Pengembangan Budidaya
Ikan Hias (BPPBIH) Depok.
Metode
Ekstraksi dan Purifikasi DNA
Ekstraksi DNA total otot kijing A.
woodiana dilakukan terhadap 18 sampel asal
Bogor dan 7 sampel asal Depok. DNA A.
woodiana diekstraksi dengan menggunakan
metode CTAB. Metode ini mengikuti
metode Solihin (1997). Sampel otot yang
telah dicacah dan dimasukkan ke dalam
tabung Eppendorf 1.5 ml diberi larutan Low-
TE (1 mM Tris HCl, 10 mM EDTA)
sebanyak 500 μl. Sampel tersebut diinkubasi
pada suhu 37°C selama satu bulan. Sampel
yang telah diinkubasi lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 13000 rpm selama tiga
menit. Supernatan dibuang, pelet berupa otot
dihaluskan menggunakan mortar dan
ditambah larutan CTAB sebanyak 600 μl.

Supernatant dipindahkan ke dalam tabung
Eppendorf baru lalu ditambah Proteinase K
10 μl. Sampel diinkubasi pada suhu 55°C
selama semalam. Suspensi yang telah
diinkubasi ditambah phenol 400 μl, CIAA
400 μl, dan NaCl 5M 40 μl lalu dikocok
pelan selama 30 menit pada suhu ruang.
Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
13000 rpm selama tiga menit. Supernatan
dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf
baru, ditambah dengan 400 μl CIAA,
dikocok selama 20 menit. Setelah itu,
supernatan dipindahkan ke dalam tabung
Eppendorf baru dan ditambah etanol absolut
sebanyak 2x volume. Sampel disimpan di
dalam freezer selama semalam. Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama lima menit lalu supernatan dibuang
sehingga didapatkan endapan (DNA). Pada
endapan, ditambah 800 µl etanol 70%,
disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm
selama lima menit. Supernatan dibuang.
DNA (endapan putih) dikeringudarakan
selama 15-30 menit. Endapan ditambah 35-
100 µl larutan TE-RNAse, kemudian
diinkubasi pada suhu 370 C selama 15 menit
dan disimpan di dalam freezer.
DNA hasil ekstraksi dilihat dengan cara
dimigrasikan pada elektroforesis gel agarosa
1.2% menggunakan buffer 1xTAE (40 mM
Tris-asetat, 1 mM EDTA) selama 35 menit.
Gel agarosa diwarnai dengan ethidium
bromide (0.5 g/ml), diamati, dan difoto
menggunakan GELDOC di bawah sinar
ultraviolet 400 nm.
Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen
DNA
Amplifikasi DNA hasil purifikasi
dilakukan melalui teknik PCR (Polymerase
Chain Reaction). Fragmen DNA yang
diamplifikasi yaitu gen COI pada
A.woodiana, dengan menggunakan pasangan
primer koleksi Dr. Dedy D. Solihin, DEA
dan Ir. Nurlisa A. Butet, MSc dengan primer
forward AGF (5’-
AGCCGGCAGGTCTTTATGTAGAAGTT
AG-3’) dan primer reverse AGR (5’-
TAAACCTCCGGGTGTCCAAAAAACCA
-3’). Produk PCR yang dihasilkan nantinya
adalah sebesar 608 bp.
Komposisi pereaksi PCR terdiri atas 3 µl
DNA template, 12.5 µl Go Taq® Green 2x,
3.3 µl ddH2O, 2 µl enhancer, 2 µl MgCl2 50
mM, 1 µl dNTP, 1 µl primer forward 20
ρmol, 1 µl primer reverse 20 ρmol dan 0.2
µl Taq Polymerase (Invitrogen) dalam
volume total reaksi 25 µl.
2
Siklus PCR dilakukan sebanyak 35 kali
dengan suhu predenaturasi 94ºC selama 5
menit, denaturasi 94ºC selama 45 detik,
annealing (penempelan primer) 59ºC selama
satu menit 30 detik, ekstensi atau elongasi
72ºC selama satu menit, post-elongasi 72ºC
selama 7 menit. Mesin PCR (Termal Cycler)
yang digunakan adalah Veriti. Produk PCR
dimigrasikan pada elektroforesis gel agarosa
1.2% dan diwarnai dengan ethidium bromide
selama 60 menit. Setelah itu, divisuali-
sasikan menggunakan GELDOC di bawah
sinar ultraviolet (UV).
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Sekuensing merupakan metode yang
digunakan untuk mengetahui variasi genetik
gen COI. Pembacaan sekuens DNA
dilakukan untuk mengetahui urutan
nukleotida dan asam amino suatu gen, juga
menganalisis kekerabatan dan jalur
evolusinya (Albert et al. 1994). DNA
cetakan hasil PCR digunakan untuk reaksi
perunutan nukleotida. Produk PCR
disekuensing di PT Genetika Science,
Indonesia dengan primer forward dan
reverse.
Analisis Data dan Filogeni
Pensejajaran runutan nukleotida gen
penyandi COI dianalisis menggunakan
program Clustal W yang terdapat pada
software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007).
Runutan nukleotida gen COI A. woodiana
dengan primer forward dan reverse diedit
dan dianalisis untuk mendapatkan sekuens
DNA dari gen COI. Runutan nukleotida
yang telah diedit, disejajarkan dengan urutan
baku nukleotida dari GenBank yang satu
famili dengan Unionidae (ingroup) dengan
kode akses DQ340804.1 (A. woodiana),
GU230747.1 (A. anatina), AY655021.1
(Strophitus subvexus), JX046553.1 (Unio
crassus), JX046690.1 (Unio pictorum) dan
yang bukan famili Unionidae (outgroup)
DQ272383.1 (Margaritifera falcata),
JN243891.1 (Margaritifera margaritifera),
AY484747.1 (Mytilus edulis), JN612835.1
(Cucumerunio novaehollandiae). Analisis
filogeni menggunakan perangkat lunak
MEGA 4.0 dengan metode bootstrapped
Neighbor-Joining (NJ) memakai 1000 kali
pengulangan. Analisis dengan program
MEGA tersebut menghasilkan matriks jarak
genetik berdasarkan persamaan dan
perbedaan basa nukleotida.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi DNA Total
Ekstraksi DNA total otot A. woodiana
menunjukkan hasil yang cukup baik. Dari 18
sampel asal Bogor yang diekstraksi, 14
sampel, yaitu AB1, AB2, AB3, AB4, AB6,
AB7, AB8, AB9, AB10, AB11, AB12,
AB13, AB20, dan AB21 memiliki kualitas
DNA yang baik, ditunjukkan dengan adanya
pita DNA yang tebal. Sampel asal Depok
yang berhasil diekstraksi sebanyak empat
sampel, yaitu AD2, AD4, AD5, dan AD6.
Contoh hasil ekstraksi DNA total yang
memiliki kualitas DNA yang baik disajikan
pada Gambar 1. DNA total tersebut
selanjutnya digunakan sebagai DNA cetakan
untuk amplifikasi gen COI dengan
menggunakan teknik PCR.
1 2 3
Gambar 1 Hasil ekstraksi DNA total otot
kijing pada gel agarosa 1.2%.
1= AB1, 2= AB4, 3= AD4.
Amplifikasi Daerah COI
Amplifikasi daerah COI mtDNA
menggunakan primer AGF-AGR pada
sampel A. woodiana menghasilkan pita
tunggal berukuran 608 pb. Dari 18 sampel
yang hasil ekstraksinya baik (14 sampel asal
Bogor dan empat sampel asal Depok), hanya
lima sampel yang berhasil diamplifikasi.
Empat sampel asal Bogor dan satu sampel
asal Depok. Namun, sampel yang dapat
dianalisis lebih lanjut ke tahap sekuensing
hanya tiga sampel, yaitu AB1, AB4, dan
AD4. Hasil visualisasi amplifikasi gen COI
dapat dilihat pada Gambar 2 berikut.
3
1 2 3 4 5 6
608 bp
500 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen COI pada
gel agarosa 1.2%. 1= marker 100
bp, 2-6= AB1, AB2, AB4,
AB12, AD4.
Sekuens dan Perunutan Produk PCR
Daerah COI
Produk PCR diuji kualitasnya terlebih
dahulu melalui pre-treatment oleh jasa
pelayanan sekuens PT. Genetika Science
sebelum dilakukan proses cycle sequencing
(Gambar 3). Perunutan DNA dilakukan dari
dua arah, yaitu forward dan reverse. Dari
tiga sampel yang disekuens, dua sampel asal
Bogor yaitu AB1 dan AB4 tidak
menampakkan hasil sekuensing yang baik
sehingga tidak diikutkan dalam analisis data
dan filogeni. Sampel tersebut memiliki
panjang nukleotida yang lebih pendek dan
memiliki banyak huruf N yang menunjukkan
basa nukleotida tidak terdeteksi.
Berdasarkan hasil sekuensing dan hasil
pensejajaran (Alignment), sampel AD4
memiliki panjang nukleotida sebesar 608 bp.
Posisi segmen gen COI Anodonta woodiana
berdasarkan gen COI Mytilus edulis
(AY484747.1) dapat dilihat pada Gambar 4.
Komposisi nukleotida dari gen COI AD4
terdiri atas 40.5% basa T, 15.8% basa C,
21.7% basa adenin A, dan 22.0% basa G.
Basa yang mendominasi yaitu T dan A. Data
sekuens AD4 selanjutnya disejajarkan
dengan ingroup (famili Unionidae) dan
dengan outgroup (non famili Unionidae)
yang berasal dari GenBank. Panjang basa
nukleotida hasil pensejajaran adalah 495 nt.
Berdasarkan hasil pensejajaran berganda
diperoleh nilai conserved sebesar 33.73%
(167/495) dan nilai variable sebesar 65.25%
(323/495). Sementara itu, nilai conserved

dan nilai variable antara AD4 dengan M.
edulis masing-masing sebesar 61.60%
(377/612) dan 36.93% (226/612).
1 2 3 4
608 bp
500 bp
250 bp
Gambar 3 Visualisasi hasil pre-treatment
produk PCR pada gel agarosa
1%. 1= marker 1 kb, 2= AB1, 3=
AB4, 4= AD4.
COI M. edulis (1656 bp)
Gambar 4 Posisi segmen gen COI A.
woodiana berdasarkan gen
COI M. edulis.
Analisis Filogeni
Hubungan kekerabatan antar famili
Unionidae (A. anatina, S. subvexus, U.
crassus, dan U. pictorum) serta famili
lainnya (C. novaehollandiae, M. falcata, M.
margaritifera, dan M. edulis) dapat
dibandingkan berdasarkan jarak genetiknya.
Jarak genetiknya berkisar antara 0.387-0.435
Gambar 5 Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 495 nukleotida COI dengan metode
Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance.
4
(38.7%-43.5%). Data runutan nukleotida gen
COI A. woodiana yang berasal dari
GenBank juga disertakan dalam analisis
filogeni. Hal ini disebabkan hanya ada satu
sampel dalam penelitian ini, sehingga harus
ada data dari spesies yang sama sebagai
pembanding. AD4 dengan A. woodiana
memiliki jarak genetik sebesar 0.431
(43.1%) atau memiliki persentase kesamaan
sebesar 56.9%. Jarak genetik terkecil adalah
antara AD4 dengan M. edulis (0.387)
sedangkan jarak genetik terbesar adalah
dengan M. margaritifera (0.435).
Rekonstruksi pohon filogeni AD4
dengan spesies dari sesama famili Unionidae
dan dari famili yang berbeda berdasarkan
jarak genetiknya dapat dilihat pada Gambar
5. Pada gambar 5 dapat dilihat bahwa AD4
terletak pada nodus yang sama (nodus A)
hanya dengan M. edulis yang bukan
merupakan anggota famili Unionidae.
Sebaliknya, A. woodiana (DQ340804.1)
terletak di nodus yang berbeda (nodus B).
Pembahasan
Produk PCR yang berkualitas baik
dicirikan dengan pita tunggal yang tebal,
yang mengindikasikan bahwa kuantitas
DNA tersebut tinggi. DNA dari sampel
AB1, AB4, dan AD4 memiliki kualitas yang
baik tetapi produk PCR nya kurang baik.
Sampel asal Bogor memiliki pita tunggal
yang sangat tipis. Sementara itu, pita yang
dihasilkan oleh sampel asal Depok adalah
multistrand yang menunjukkan banyak pita
yang bukan target. Kualitas produk PCR
tersebut berhubungan dengan kualitas DNA
yang dihasilkan. Otot kaki A. woodiana yang
digunakan untuk ekstraksi DNA me-
ngandung banyak polisakarida dan protein
polifenol yang dapat mengkontaminasi

DNA dan mengganggu proses polimerase
enzimatik asam nukleat (Pereira et al. 2011).
Kualitas DNA yang bagus sangat penting di
dalam proses PCR, dimana kelebihan debris
sel dan protein dapat menghambat proses
ampilifikasi (Popa et al. 2007). Selain itu,
hasil PCR yang kurang baik mungkin
disebabkan karena primer yang digunakan
kurang spesifik. Pasangan primer AGF dan
AGR dibuat berdasarkan sekuens basa COI
M. edulis. AB1, AB4, dan AD4
kemungkinan memiliki sekuens basa
nukleotida yang berbeda dengan M. edulis,
sehingga primer tidak menempel secara
spesifik pada target.
Hambatan juga terjadi di dalam
penentuan komposisi PCR dan suhu
optimum annealing (penempelan primer)
agar DNA teramplifikasi dengan baik.
Menurut Newton dan Graham (1997), jika
suhu penempelan primer terlalu tinggi dari
suhu optimum, menyebabkan primer tidak
menempel dengan DNA cetakan. Jika suhu
penempelan primer terlalu rendah dari suhu
penempelan optimum menyebabkan mis-
priming, yaitu penempelan primer pada
tempat yang salah pada DNA cetakan
sehingga dihasilkan produk non spesifik.
Oleh karena itu, dilakukan optimasi terhadap
suhu penempelan primer.
Pendekatan filogenetik dengan jarak
genetik antar sekuens dapat digunakan untuk
menunjukkan kedekatan kekerabatan.
Persentase jarak genetik sampel AD4
dengan ingroup (A. anatina, S. subvexus, U.
crassus, dan U. pictorum) sebesar 39.1%-
40.6%. Sedangkan persentase jarak genetik
AD4 dengan outgroup (M. edulis, C.
novaehollandiae, M. falcata, dan M.
margaritifera) sebesar 38.7%-43.5%.
Berdasarkan analisis filogeni, AD4 terletak
pada nodus yang sama (nodus A) hanya
dengan M. edulis yang bukan merupakan
anggota famili Unionidae. Sebaliknya, A.
woodiana (DQ340804.1) terletak di nodus
yang berbeda (nodus B). Berdasarkan
taksonomi, seharusnya AD4 berada pada
satu nodus dengan anggota famili
Unionidae. Hal ini mungkin disebabkan
karena kesalahan dalam komposisi
nukleotida sampel AD4. Menurut Foster dan
Hickey (1997) komposisi bias di dalam
urutan DNA dapat mempengaruhi analisis
filogenetik yang berdasarkan urutan DNA
tersebut. Komposisi COI yang umum
digunakan di dalam studi filogenetik
dipengaruhi oleh perbedaan komposisi pada
tingkat DNA. Hal ini sesuai dengan
5
pendapat Bussche et al. (1998) bahwa
komposisi nukleotida yang bias dapat
mengakibatkan analisis filogenetik tidak
akurat. Salah satu faktor penyebab kesalahan
dalam komposisi nukleotida adalah
tingginya kandungan basa adenin (A) dan
timin (T). Kandungan A dan T sampel AD4
sangat dominan, yaitu 21.7% dan 40.5%.
Beberapa faktor lain yang dapat mem-
pengaruhi rekonstruksi pohon filogeni, yaitu
heterogenitas dalam tingkat substitusi antara
garis keturunan, mutasi, substitusi
nukleotida, dan komposisi dari empat basa
nukleotida. Kualitas produk PCR yang
kurang baik serta kemungkinan kesalahan
komposisi nukleotida mengakibatkan
analisis filogeni dalam penelitian ini
terganggu.
SIMPULAN
Penelitian ini belum mampu mengka-
rakterisasi gen COI A. woodiana dengan
baik. Hal ini dapat disebabkan karena faktor
kualitas DNA, kualitas produk PCR, dan
primer yang kurang spesifik sehingga
komposisi urutan nukleotida gen COI tidak
sempurna. Panjang nukleotida A. woodiana
sebesar 608 bp belum dapat dijadikan
barcode untuk spesies tersebut.
SARAN
Penambahan jumlah sampel dan lokasi
sampling perlu dilakukan agar diperoleh
urutan nukleotida gen COI yang akurat dan
untuk menguji sifat conserve COI terutama
pada tingkat individu. Desain primer spesifik
A. woodiana juga sangat dibutuhkan dalam
studi karakteristik gen COI.
DAFTAR PUSTAKA
Albert J, Wahlberg J, Leitner T, Escamilla
D, Uhlen M. 1994. Analysis of a rape
case by direct sequencing of the human
immunodeficiency virus type 1 pol and
gag genes. J. Virol 68: 5018-24.
Bussche RAVD, Baker RJ, Huelsenbeck JP,
Hillis DM. 1998. Base compositional
bias and phylogenetic analyses: a test of
the “flying DNA” hypotesis. Molecular
Phylogenetics and Evolution 13: 408-
416.
 6

Foster PG, Hickey DA. 1999. Compositional dan biologi populasi pada hewan. Hayati
bias may affect both DNA-based and 1: 1-4.
protein-based phylogenetic Solihin DD. 1997. Isolasi dan Purifikasi
reconstruction. J Mol Evol 48: 284-290. Mitochondrian (mtDNA). Bogor:
Hamidah A. 2006. Pengaruh penggunaan Laboratorium Biologi Molekuler Pusat
berbagai jenis ikan sebagai inang Penelitian Sumberdaya Hayati dan
terhadap kelangsungan hidup glochidia Bioteknologi IPB.
Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S.
Lea). Biota 11: 185-189. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary
Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard Genetics Analysis (MEGA) software
JR. 2003. Barcoding animal life: version 4.0. Mol Bio Evol 24: 1596-1599.
cytochrome c oxidase subunit 1
divergences among closely related
species. Proc R Soc 270: 96–99.
Krolak E, Zdanowski B. 2001. The
bioaccumulation of heavy metals by the
mussel Anodonta woodiana (LEA, 1834)
and Dreissena polymorpha (Pall) in the
heated Konin Lakes. Arch. Of Polish
Fisheries 9: 229-237.
Luo et al. 2011. Potential efficacy of
mitochondrial genes for animal DNA
barcoding: a case study using eutherian
mammals. BMC Genomics 12: 84-96.
Newton CR, Graham A. 1997. PCR
Introduction to Biotechnique. Second
Edition. Oxford: Bios Scientific
Publisher Ltd.
Nuryanto A, Solihin DD. 2006. Variasi
sekuens gen mitokondrial Sitokrom C
Oksidase I dari Siput Lola (Trochus
niloticus). Biosfera 23: 31-37.
Popa OP, Murariu D, Popa LO. 2007.
Comparison of four DNA extraction
methods from invasive freshwater
bivalve species (mollusca: bivalvia) in
Romanian Fauna. Grigore Antipa L:
527-536.
Pereira JC, Chaves R, Bastos E, Leitao A,
Pinto HG. 2011. An efficient method for
genomic DNA extraction from different
molluscs species. Int J Mol Sci 12: 8086-
8095.
Rachman B, Winanto T, Maskur, Sukmajaya
Y. 2009. Pengaruh kedalaman terhadap
proses pelapisan inti bulat pada kerang
air tawar (Anodonta woodiana). J Biol 6:
71-78.
Rahayu SYS, Solihin DD, Manalu W,
Affandi R. 2013. Nucleus pearl coating
process of freshwater mussel Anodonta
woodiana. Hayati J Biosci 20: 24-30.
Ram KJ, Misra G. 2003. Homogenic and
xenogenic implantation in pearl mussel.
Current Science 85: 727-729.
Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria
(mtDNA) dalam studi keragaman genetik
LAMPIRAN
 8

Lampiran 1 Pensejajaran berganda nukleotida (612 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen Mytilus edulis yang berasal dari GenBank.

#MEGA
!Title COI;
!Format
DataType=Nucleotide
NSeqs=2 NSites=612
Identical=. Missing=? Indel=-;

!Domain=Data;
[ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 TGCCGGCAGG TCTTTTTGTT GAAGTTAATC AATTGTATAA TGTGATTTTT ACGAGGCCTG CATGTTAATA TGATTTTTTT
#M._edulis AT..T.G..C AG.A...T.A A..AGAG..T GG..T..... ....G..G.. ..A.CA.AC. .C.-.A.TA. .A.....C..

[ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 ]

[ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 TTTCGTTATA CCAGTAATAA TGGGGGGGTT TGGTAATTGA CTGATTCCAA TTATAGTTGG GTGTGGGGAT ATAAGACACC
#M._edulis .GCT..A... ..GA.TC... .C.AA.CT.. .........G ........TC .AT....A.. TG..AAA... ....TTT.T.

[ 1111111111 1111111111 1111111111 1111111112 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 ]

[ 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 CACGTTTAAA TAATTTTAGC TACTGAGCCA TTCCTGGTGC TTTATTCATA GTTTTCATGT CAGCGTTGAT TGAGGGGGGG
#M._edulis ....GA.... ......G..T ..T..GTTAT C....AA... GC...ATT.. C..A.AT.A. .TTTTAGA.C G..TAAA...

[ 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222223 3333333333 3333333333 ]

[ 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 GCCGGTACTG GATGAACTCT TTACCCTCCC CTTTCTGGTT GGATCTATCA TAGAAGTCCG GCGCTGGATA TGGTTATTCT
#M._edulis .TA...G... ....G...A. ......G..A T.G....TA. ATCCT..... ...CG.G... AG.A.A...G .TC.....G.
 9

[ 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333334 ]

[ 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 TTCGTTGCAT ATTGCTGGGT TTGGTTCAAT GATAAGGTCT TTAAATTTTA TGTGTACTA- TAATTACAAG TCGTTTTTAT
#M._edulis G..C...... T.A....... .AA....TT. .G.GG.TG.. A.T......G CTA....C.A C..AA...TA C.AG.....G

[ 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 ]

[ 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 -GCTATAATT CCA--GAGCG GATACCTGTG TTTTGTTGGT CGATGTTTGT TACATCTTGG TTATTATTAT TTTCTTTACC
#M._edulis A.A..A..GG AG.AC....T ..GCTT.A.. .CC.AAG.A. .AGA...AC. GC.G.A...C .A......-- --...A.T..

[ 4444444444 4444444445 5555555555 5555555555 5555555555 5555555555 5555555555 5555555555 ]

[ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 ]
#AD4 TGTCTTGGCT GGCGGTTTAA ATATACTTCT TACTTATCGC CATATTAATA GTTCTTTTTT TCAACCCCAA GGGGGAGGGG
#M._edulis G..T..A.GA ..G...A.C. CA...A.... GTT.G....G A..T....C. CAA.A..... .G.T..AGC. ..A..G..T.

[ 5555555555 5555555555 5555555555 5555555556 6666666666 66]

[ 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 11]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 12]
#AD4 ATCCTTTATT GTTCCAACAT TTGTTTTGGT TTTATGGACA CCCCAAAGTT TA
#M._edulis .C...G.C.. ...T...... .....C..A. ...T...G.. ...TG.G..G ..
 10

Lampiran 2 Pensejajaran berganda nukleotida (495 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen lain yang berasal dari GenBank.
#MEGA
!Title COI;
!Format
DataType=Nucleotide
NSeqs=10 NSites=495
Identical=. Missing=? Indel=-;

!Domain=Data;
[ 1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556
6666666667 7777777778 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana TGCCGGCAGG TCTTTTTGTT GAAGTTAATC AATTGTATAA TGTGATTTTT ACGAGGCCTG
CATGTTAATA TGATTTTTTT
#A._woodiana_(DQ340804.1) GA....GG.. .T.GA.A.CA A.---.G.A. .GC.A...T. .TCA...A.A ...GCT.AC.
.T.-..GTA. .......C..
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) GC..T.G... .G.AA.A.G. A.---.G.G. .GC.T...T. .TCT...G.. ..TGCT.A..
.T.-..GT.. .A........
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) A...A.GGA. AT.A..G.GG ..---.G... .G........ ...T...G.. ...GCT.A..
.T.-...TA. .A........
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) AA..T.GGA. AT.G..A.G. ..---.G... .G........ ...C...G.. ..AGCT.A..
.T.-.C.TA. .......C..
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) AA..T.GGA. GT.A..G.GC ..---.G... ..C....... ...T...G.. ...GCT.A..
.T.-...TG. .......C..
#Cucumerunio_novaehollandiae AA..T.GGA. G.....A.G. ..---.G... .......... ......CG.A ...GCT.A..
.T.-...TG. .......C..
#Margaritifera_falcata AA..T.GTA. .T.G..G.GG ..---.G... .G........ C..T...G.. ...GCT.A..
.T.-...TA. .A.....C..
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) AA..T.GTTC .T.GC.G.G. ..---.G... ....A..C.. ...T...G.. ...GCT.A..
.T.-...TA. .A.....C..
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) AT..T.G..C AG.A...T.A A..AGAG..T GG..T..... ....G..G.. ..A.CA.AC.
.C.-.A.TA. .A.....C..
 11

[ 1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111

1111111111 1111111111 ]
[ 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334
4444444445 5555555556 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana TTTCGTTATA CCAGTAATAA TGGGGGGGTT TGGTAATTGA CTGATTCCAA TTATAGTTGG
GTGTGGGGAT ATAAGACACC
#A._woodiana_(DQ340804.1) .GCT.....G ..T.CT.... .A..A..T.. ...G..A..G ..TT.G..T. .......G..
....CCC... ...GC.TTT.
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) .GCT..A..G ..T.C..... .......T.. ...G.....G ..TG.G.... ..........
A..CCCA... ...TC.TTT.
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) ...G..A... ..TA...... .T..T..T.. .........G ..T.....TT .G...A....
TGC.CCT... ..GGCTTTT.
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) ...A..A... ...A...... .T..T..A.. ...G...... ..T.....TC ....GA....
TGC.CCT... ..GGCTTTT.
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) ...G..G..G ...A...... .T..C..A.. ...G...... ..T.....TC .....A....
TGC.CCT..C ...GCTTTT.
#Cucumerunio_novaehollandiae ...A..G..G ..TA.G..G. .T..T..... ...G...... ..A.....TT .A..GT.G..
.GC.CCT... ..GGCTTTT.
#Margaritifera_falcata ...G.....G ...A...... .T.....T.. .......... ..T......C ....GA....
.GC.CCC... ..GGCTTTT.
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) ...G.....G ...A....G. .T..A..T.. ...C.....G ..T.....CC ....GA....
.GC.CCT... ..GGCTTTT.
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) .GCT..A... ..GA.TC... .C.AA.CT.. .........G ........TC .AT....A..
TG..AAA... ....TTT.T.
 12

[ 1111111111 1111111111 1111111111 1111111112 2222222222 2222222222

2222222222 2222222222 ]
[ 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112
2222222223 3333333334 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana CACGTTTAAA TAATTTTAGC TACTGAGCCA TTCCTGGTGC TTTATTCATA GTTTTCATGT
CAGCGTTGAT TGAGGGGGGG
#A._woodiana_(DQ340804.1) .T..G..... ...CG.C..A .TT...TTGT CGTT....T. .GG...TT.G A..GGATGA.
..ATAC..GA G........T
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) .C........ ....G.G..A .TT...TTAT .ATT....T. .GGG..TT.. C.AAGATG..
..AT...TG. A..A.....T
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .T..A..... ......G..G .TT...CTTC ..GTGCCG.. ...G..TT.. T.G..A.G..
.TT.AC..G. G...A.A..T
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) .T..G..... ......A..G .TT...TTAC .CGTACCA.. ...G..TT.. C.G..A.G..
.TT.T...G. A...A.A..T
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .T..G..... ....C.G..G .TT..GTTGC ..GTGCCG.. ...G..TT.. T.GC.G.GA.
.GT.T...G. A...A.A...
#Cucumerunio_novaehollandiae .T.....G.. ......A..G .TT..GTTGC ..GT.CCA.. G..G..TT.G T.AC.T.G..
.TT.T..AG. ....A.T..T
#Margaritifera_falcata .C..CC.T.. C.....G..G .TT...TTGC ..GTGCC... .C.T...T.G T.A..G.GT.
.TT....AG. G...A.T..T
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .T..GC.T.. ......A..G .TT..GTTGC ..GTGCCG.. .C.T..TT.. T.A..A.GT.
.TT.T...G. G...A.T..T
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) ....GA.... ......G..T ..T..GTTAT C....AA... GC...ATT.. C..A.AT.A.
.TTTTAGA.C G..TAAA...
 13

[ 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222223

3333333333 3333333333 ]
[ 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990
0000000001 1111111112 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana GCCGGTACTG GATGAACTCT TTACCCTCCC CTTTCTGGTT GGATCTATCA TAGAAGTCCG
GCGCTGGATA TGGTTATTCT
#A._woodiana_(DQ340804.1) TGT..G.... ....G...AC ...T..A..T T.G..AAA.A AA..G.T.A. .TCT..AAT.
T.TA.A...G .A..G...T.
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) TGT....... ........A. ...T..G..T T.A...AA.A A.G.T.T... .TCTG.GATA
..TA.....G .A..A.....
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .TT.....A. .T..G..AG. A..T...... T.A..A..GA .CG.TGC... .TCTG.GG.T
T.AG.....T ...C....T.
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) .TT..G.... .T..G..AG. G..T.....T T.A.....GA ATG.GGC... .TCCG.GG.T
T.AG.A..CT ...C....T.
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .TT..A.... .T.....AG. G..T..C... T.G.....AA ATG.AGC... .TCTG.GG.T
T.AG.A...T ...C....T.
#Cucumerunio_novaehollandiae .TT..G.... .G..G...G. ...T..A..G T.G.....GA AT..TGC... .TCTG.AG.T
T..G.T...T ...CG...T.
#Margaritifera_falcata .TT....... .T..G...G. ...T..C..T T.G..AA.GA ATG.T.CA.. .TCTG.GG.T
T.TG.A...T .A.C....T.
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .TT....... .G..G...G. ......G..T T.A..AA.GA ATG...C... .TCTG.GG.T
T.TG.A..CT ...C....T.
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) .TA...G... ....G...A. ......G..A T.G....TA. ATCCT..... ...CG.G...
AG.A.A...G .TC.....G.
 14

[ 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333

3333333333 3333333334 ]
[ 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778
8888888889 9999999990 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana TTCGTTGCAT ATTGCTGGGT TTGGTTCAAT GATAAGGTCT TTAAATTTTA TGTGTACTA-
TAATTACAAG TCGTTTTTAT
#A._woodiana_(DQ340804.1) ...TC.T... T.A..A..TG ..TCA..... TCATG.A..A .......... .TAC...A.T
.GTAA.A.TA CGCG..AGTG
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) ...T.....C T.A..C..TG ..TCA..... TC.TG....A .......... .TAC.....T
..T.A.T.T. CGAAC.AATA
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) C..T..A... C.......TG C.TCG..... TT..G.TG.. G.T....... .T.C....GT
.GG.A.T.T. CG..C.CCTG
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) ...T..A... C.......TG C.TCA..T.. TT..G..G.. A.T....... .T.C....GT
.GGGA.T.T. CGA.C.CCTG
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) ...T...... C.......TG C.TC...T.. TT.GG.TG.. A.T.....C. .C.C...CGT
.GGAA.T.T. CGA.C.CCTG
#Cucumerunio_novaehollandiae ...T...... C.......TG C.TC...T.. CC.TG..G.. A.T....... .T.C...CGT
.GGGA.T.TA CG..C.G.TG
#Margaritifera_falcata ...T.....C C.......TG CGTC...T.. TT.GG..G.. A.T....... .T.CG...GT
.GG.A.T.T. CGC.CCCCTG
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) ...T.....C C....C..TG CATCC..T.. TT.GG..G.. A.T..C.... .T.CG...GT
.GG.A...TA CGT.C.CCGG
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) G..C...... T.A....... .AA....TT. .G.GG.TG.. A.T......G CTA....C.A
C..AA...TA C.AG.....G
 15

[ 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444

4444444444 4444444444 ]
[ 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556
6666666667 7777777778 ]
[ 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890
1234567890 1234567890 ]
#AD4_A._woodiana -GCTATAATT CCA--GAGCG GATACCTGTG TTTTGTTGGT CGATGTTTGT TACATCTTGG
TTATTATTAT TTTCTTTACC
#A._woodiana_(DQ340804.1) TTA....TGC TG.GC..ATT CC.TTG.T.. ...GA.CT.. TTCGTG.ACA GCAG.T....
.......G-- --.....T..
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) TTT.GCGGG. TG.GC..ATA CC.TTA.T.. ...GA.CT.. TTTA...ACG GCTGGT..A.
.A..GG..-- --.....T..
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) GTT..GTTGC .G.GC..ATT CC.TTA.T.. ...GAGCT.. TACG..AACA GCTG.T...T
.GG..GC.-- --G.C.....
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) G.T..GTTGC TG.AC..ATT CCATTA.T.. ...GAGCT.. TAC.A..AC. GCA..T...T
.AG.AGC.-- --G.......
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) G.T..GTTGC TG.AC..ATT CC.TTA.TC. ...GAGCT.. TAC....AC. GCA..T...T
.GG.AGCC-- --G....G..
#Cucumerunio_novaehollandiae G.T.GGTGGC TG.GC.TATT CCGTTG.T.. .G.G.GCT.. TACG..GACG GCGG.T...C
.GG..GC.-- --.....G..
#Margaritifera_falcata GCG..GTTGC TG.AC..ATT CCATTG.TC. .G.GAGCC.. .ACA..GACG GCT..T...T
.AG.GGCG-- --G.A..G..
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) GAG.GGTTGC TG.GC..ATT CC.TTG.TC. .G.GAGCT.. TACG..GACG GCT..T...T
.AG.GGCG-- --G.AC....
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) A.A..A..GG AG.AC....T ..GCTT.A.. .CC.AAG.A. .AGA...AC. GC.G.A...C
.A......-- --...A.T..
 16

[ 4444444444 44444]
[ 8888888889 99999]
[ 1234567890 12345]
#AD4_A._woodiana TGTCTTGGCT GGCGG
#A._woodiana_(DQ340804.1) ...A..A..A ..T.C
#Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) ...A.....A ..T.C
#Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) A..T..A... ..T.C
#Unio_crassus_France_(JX046553.1) ......A... ..T.C
#Unio_pictorum_France_(JX046690.1) ...T..A... ..T.C
#Cucumerunio_novaehollandiae ...G...... ..G.C
#Margaritifera_falcata ...T.....A ..T.C
#M._margaritifera_USA_(JN243891.1) G..T.....A ..G.C
#Mytilus_edulis_(AY484747.1) G..T..A.GA ..G..
 17

Lampiran 3 Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada A. woodiana dengan beberapa pembandingnya (ingroup
dan outgroup) yang berasal dari GenBank.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
[1]
[2] 0.431
[3] 0.391 0.211
[4] 0.398 0.342 0.319
[5] 0.400 0.335 0.317 0.126
[6] 0.406 0.342 0.331 0.143 0.112
[7] 0.404 0.337 0.342 0.199 0.170 0.174
[8] 0.418 0.344 0.317 0.174 0.170 0.166 0.197
[9] 0.435 0.348 0.331 0.182 0.172 0.180 0.195 0.108
[10] 0.387 0.420 0.416 0.414 0.402 0.404 0.412 0.418 0.412

Keterangan:
[1] Anodonta woodiana (AD4)
[2] Anodonta woodiana
[3] Anodonta anatina
[4] Strophitus subvexus
[5] Unio crassus
[6] Unio pictorum
[7] Cucumerunio novaehollandiae
[8] Margaritifera falcata
[9] M. margaritifera
[10] Mytilus edulis