TEKNIK Alfiani Guntari Mahadewi

1306370871
1

KLONING Agusta Indahning Tyas

1306447820
Daisy Christina

MODIFIKASI 130640370934
Ulina Ayu Pangesti

GEN
1306447726
Zarahmaida Taurina
1306370820

Tugas II Rekayasa Genetika

2015
Problem
• Kelompok anda bermaksud untuk mengklon gen
apoptin di dalam bakteri Escheiricia coli untuk
mempermudah proses pemurnian, ujung C-terminal
apoptin ditambahkan 12 histidin, dan untuk
mempermudah penetrasi sel ditambahkan 8 arginin
pada N-terminal. Laporkan rancangan rekayasa yang
akan anda lakukan !
2
 Apoptin
LAYOUT
3

Pemilihan
Seleksi
Vektor

Pemilihan
Transformasi
Host/Strain

Insersi
Apoptin ke Modifikasi
Plasmid
 APOPTIN 4

Apoptin dan Fungsinya Sumber Apoptin Tujuan Penggunaan Apoptin

 APOPTIN
• Apoptin adalah protein yang mengandung 121 macam asam amino dan
terdeteksi pada 14 kDa, merupakan isolasi dari virus anemia ayam (CAV).

SUMBER APOPTIN
 Virus anemia ayam (CAV), adalah virus non-enveloped dan agen penyebab penyakit
ayam anemia.
 CAV menyebabkan anemia dengan apoptosis hemocytoblasts di sumsum tulang
pada ayam.
 CAV adalah satu-satunya anggota dari genus Gyrovirus dalam keluarga
Circoviridae.
 Virus ini imunosupresif pada ayam yang baru lahir, dan menginduksi atrofi limfoid
umum, anemia berat dan peningkatan mortalitas 5

Apoptin dan Fungsinya Sumber Apoptin Tujuan Penggunaan Apoptin

 Sumber apoptin
Virus ini mentranskripsi dan
menterjemahkan tiga protein virus, VP1,
VP2 dan VP3

VP1 protein (51 kDa) adalah protein struktural tunggal CAV dan bertanggung
jawab untuk perakitan kapsid

Protein VP2 (30 kDa) merupakan protein nonstruktural yang memiliki

fosfatase dual-kekhususan protein (DSP).

Protein VP3 (13 kDa), juga disebut apoptin, adalah inducer kuat apoptosis
pada thymocytes ayam dan berbagai cell-line yang berubah pada manusia.

Apoptin dan Fungsinya Tujuan Penggunaan Apoptin

 TUJUAN • Penelitian secara in vitro telah menunjukkan bahwa
apoptin menginduksi apoptosis pada sel ganas manusia

PENGGUNAAN (Kirn et al. 2001).

• Hal ini berpotensi untuk bisa digunakan pada aplikasi
APOPTIN medis untuk mengobati kanker karena protein ini bisa
mengenali sel normal manusia yang terkena kanker dan
menginduksi agar terjadi apoptosis ketika proses
berlangsung tanpa menginduksi sel normal. Tetapi tidak
menginduksi lisis pada sel normal.

Apoptin dan Fungsinya Sumber Apoptin

 PEMILIHAN 8

VEKTOR

Vektor yang Digunakan Syarat Pemilihan Vektor

pUC19 9
Pemilihan Vektor pUC19
untuk Kloning Gen Apoptin
 Mudah dibedakan dari non rekombinannya berdasarkan perbedaan
warna koloni pada media pertumbuhan.
 Memiki circular double stranded DNA dan mempunyai 2686 bp (base
pairs).
 Cepat bereplikasi
 Mudah diseleksi dengan metode white/blue color selection
 Memenuhi beberapa syarat vektor yang baik dalam teknik kloning
sederhana.

10

Syarat Pemilihan Vektor

 Syarat Vektor yang Baik
dalam Teknik Kloning Sederhana
Memiliki origin of replication, sebagai syarat replikasi.
• Origin of Replication Vektor pUC19 -> oriV.

Mempunyai 2 gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid

ke dalam sel inangnya nanti.
• Amphicilin dan lacZ.

Ukuran yang sesuai

• Memiliki ukuran yang relatif kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan
mudah melintasinya.

Memiliki multiple cloning site (MCS) dalam menjalankan fungsinya.

• Sekuen Multiple cloning site berada pada bagian 5’ dari lacZ gene yang mengkodekan untuk amino, bagian
N terminal dari beta-galactosidase (LacZ) dari E.coli. Daerah MCS berada dalam lacZ gene (kodon 6 – 7
lacZ digantikan oleh MCS), di mana bermacam jenis sisi restriksi untuk beberapa restriksi endonuklease itu
ada. 11

Vektor yang Digunakan

PEMILIHAN STRAIN
BAKTERI E COLI
12

UNTUK APOPTIN
E. Coli strain DH5α
Strain host • Vektor mudah di transfeksikan kedalam vector yang
telah dipilih sebelumnya, yaitu pUC19

seperti apa • Mampu mengekspresikan gen pengkode yang

terdapat pada vektor

yang • Memiliki bagian 3‘ dari gen lacZ (gen yang

dibutuhkan
menyandikan bagian terminal karboksi utuh)
• Memiliki tingkat efisiensi transformasi yang baik

? • Berkualitas baik dalam perbanyakan plasmid

E. coli strain DH5α 13

• Susunan gen sederhana
Strain DH5α

• Laju pertumbuhannya cepat (± 1/24 generasi per 20 menit), sehingga fase log
+
berlangsung selama satu malam saja
• Dapat dikultivasi pada medium kultur biasa dan umum digunakan dalam kloning
sederhana
• Memiliki tingkat efisiensi transformasi yang tinggi (diatas 1x109 cfu/μg)
• Mampu mengekspresikan dengan baik berbagai gen asing yang mengkode protein
target

• Dapat membuat replikasi plasmid berjalan dengan stabil

14
 Strain DH5α
• Sinyal transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik
• Ekspresi gen-gen heterolog di E.coli cenderung lemah
• Seringkali protein rekombinan justru terakumulasi dan degradasi protein produk
cenderung cepat

Sehingga, dalam cloning ini ia digunakan hanya untuk kloning, tidak untuk
pengekspresian gen

15
 MODIFIKASI 16

PROTEIN

Proterin Agrinin dan Histidine Strategi Design Primer PCR Purifikasi

 Agrinin
• Arginine, or L-arginine as it is called with its L-
structure, is a semi-essential amino acid

17

Protein Agrinin dan Purifikasi

Strategi Design Primer PCR
Histidine
 Histidine
• Histidine is the amino acid that exhibits the strongest
interaction with immobilized metal ion matrices, as
electron donor groups on the histidine imidazole ring
readily form coordination bonds with the immobilized
transition metal
• Penambahan histidin pada DNA rekombinan umum
dilakukan. Hal tersebut bertujuan memudahkan pada saat
purifikasi protein yang diinginkan.
• Metode ini dinamakan Histidine tagging.
• Prinsipnya memanfaatkan afinitas histidin terhadap
beberapa media yang mengandung logam bermuatan
seperti kobalt atau nikel. Protein rekombinan yang
mengandung histidin akan cenderung berinteraksi ionik
dengan logam-logam 18

Protein Agrinin dan Purifikasi

Strategi Design Primer PCR
Histidine
 His-tag is one of the most widely applied tags for recombinant protein
expression and purification. It is also used for binding assay to detect
protein-protein interactions by a pull-down assay or in conjunction with
anti-His antibody as IP/Co-IP assay. The three new high quality mAb
based assay products will provide convenient, easy, and robust tools for
different purposes, including purification and detection of His-tagged
fusion-protein for downstream assays, enrichment and screening of His-
tagged fusion-protein mutants, and Co-IP & screening of interacting
proteins.

19

Proterin Agrinin dan Purifikasi

Strategi Design Primer PCR
Histidine
 Menentukan
Enzim
Restriksi
Enzim Restriksi

• HindIII (AAGCTT)
• BamHI (GGATCC)

20
 Menambahkan Histidine dan Arginin

Ekstensi 5' (12 His Tag)

• Ada dua cara dalam menyisipkan histidine, yakni

sebelum kodon start dan setelah kodon start.
• Pada kasus ini, sebanyak 12 His tag disisipkan tepat
sebelum kodon start, dikarenakan bagian forward primer
akan disambungkan di C-Terminal gen apoptin.
• The C-terminus (also known as the carboxyl-
terminus, carboxy-terminus, C-terminal tail,C-terminal
end, or COOH-terminus) is the end of an amino
acid chain (protein orpolypeptide), terminated by a
free carboxyl group (-COOH)
21

Proterin Agrinin dan Histidine Design Primer PCR Purifikasi

 Menambahkan Histidine dan Arginin
Eksistensi 3’ (8 Arg Tag)

• The N-terminus (also known as the amino-

terminus, NH2-terminus, N-terminal
end or amine-terminus) refers to the start of
a protein or polypeptide terminated by an amino
acid with a free amine group (-NH2).
• sebanyak 8 His tag disisipkan tepat sebelum kodon
stop, dikarenakan bagian reversh primer akan
disambungkan di N-Terminal gen apoptin.

22

Proterin Agrinin dan Histidine Design Primer PCR Purifikasi

 • Forward Primer :
- BamH1 : AAGCTT
Forward primer:
- Start Kodon : ATG
- Histidine : AGG AGA • 5’ – AAGCTT – ATG – AGG AGA AGG AGA
AGG AGA AGG AGA AGG
AGA AGG AGA AGG AGA– AAC GCT CTC CAA
- GOI : AAC GCT CTC CAA GAA GAT ACT CCA – 3’
GAA GAT ACT CCA
Reverse primer :
• Reverse Primer :
- HindIII : GGATCC • 5’ - GGATCC - TTA – CTG GTG CTG GTG CTG
- Stop Kodon : TTA GTG CGT GTG CTG GTG CTG GTG – TTA CAG
- Histidine : CTG GTG TCT TAT CGC CTT CTT GCG – 3’
CTG GTG CTG GTG CGT
GTG CTG GTG CTG GTG
- GOI : TTA CAG TCT TAT
CGC CTT CTT GCG
23

Proterin Agrinin dan Histidine Strategi PCR Purifikasi

PCR
Denaturasi
• Pada tahap ini, larutan yang berisi gen apoptin yang telah ditambahkan dengan Histidin-tag dan
Arginin-tag, didenaturasi pada suhu kurang lebih 90-95˚C.
• Denaturasi adalah pemanasan yang menyebabkan dua rantai DNA terpisah. Akibatnya, kedua
rantai DNA dari gen apoptin menjadi terpisah. Pada sisi yang ingin kita modifikasi,
ditempatkanlah primer yang sesuai dengan desain kita.
Annealing
• Pada tahap ini, larutan diturunkan temperatur ke 60˚C. Hal ini akan menyebabkan primer mengikat
pada DNA. Proses inilah yang dikenal sebagai proses annealing. Ikatan yang dihasilkan akan stabil,
jika primer dan segmen DNA bersifat komplemen

24

Proterin Agrinin dan Histidine Strategi Design Primer Purifikasi

 Con’t PCR
Ekstensi
• Suhu larutan dinaikan kembali menjadi kurang lebih 72˚C. Lalu enzim polymerase dimasukan dan
nukleotida ke dalam larutan ini. Suhu ini merupakan temperatur optimal bagi enzim polymerase.
Karena, pada tahap ini akan terjadi penambahan nukleotida untuk mengembangkan rantai DNA
sehingga setiap ikatan terbentuk antara primer dan segmen DNA .

Pengulangan
• Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan. Hal ini menyebabkan untai DNA yang baru
dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA
menjadi untai DNA yang baru.
• Hasil dari PCR ini berupa sejumlah cetakan gen apoptin dengan Histidin-tag dan Arginin-tag.
25

Proterin Agrinin dan Histidine Strategi Design Primer Purifikasi

 Click Video

26

Proterin Agrinin dan Histidine Strategi Design Primer PCR

Insersi Gen 27

Apoptin
Termodifikasi ke
Plasmid pUC 19
Prinsipnya ialah restriksi dan
insersi

• Pemilihan Enzim Restriksi

Restriksi Gen • Pemilihan Buffer
Apoptin • Pencampuran
Modifikasi dan • Inkubasi dan Heat Kill
Restriksi pUC19

Insersi Gen
• Ligasi Apoptin Apoptin ke
• Penambahan Larutan Buffer dalam Vektor
• Penambahan pelarut
• Penambahan DNA Ligase 28

• Inkubasi campuran larutan

Restriksi Gen Apoptin Modifikasi dan Restriksi pUC19
Pemilihan Enzim Restriksi

29

Protokol Restriksi Pemilihan Buffer

 Restriksi Gen Apoptin Modifikasi dan Restriksi pUC19

Pemilihan buffer

fungsi

untuk mempertahankan pH pada nilai tertentu agar DNA

tidak terdegradasi dengan penambahan bahan lainnya

harus sesuai

enzim restriksi memiliki optimasi kondisi reaksi

yang berbeda sesuai dengan buffer-nya

30

Restriksi Plasmid Protokol Restriksi

Sumber :www.yeastern.com

Menggunakan buffer
B, karena kedua enzim
restriksi memiliki
aktivitas enzim 100.

31

Restriksi Plasmid Protokol

 Restriksi Gen Apoptin Modifikasi dan Restriksi pUC19

Pencampuran

Enzim
Restriksi
BamHI dan
HindIII
Potassium
Acetate
Buffer B

20 mM
Tris- 50 mM
Acetate CH3CO2K 10 mM
pH 7,9 Mg(C2H3O2) 32
2

Restriksi Plasmid Pemilihan Buffer

 Restriksi Gen Apoptin Modifikasi dan Restriksi pUC19

Pencampuran
Menambahkan

DNA yang BSA (Bovine dH2O

Serum
hendak Albumine)
dipotong

untuk meminimalisir enzim

Sudah ada
yang tertinggal pada
enzim
permukaan tersebut dengan restriksi
mencegah adhesi enzim pada dan buffer
microtube dan permukaan
tipis pipet
Semua komponen tersebut dicampur 33
perlahan dengan mikropipet

Restriksi Plasmid Pemilihan Buffer

 Restriksi Gen Apoptin Modifikasi dan Restriksi pUC19

Inkubasi dan Heat Kill

Setelah semua komponen

dicampur, campuran diinkubasi
dalam temperatur suhu tubuh
manusia, yakni 37oC selama 1 jam

Untuk menginaktif enzim, heat kill campuran tersebut pada suhu 70oC
selama 15 menit setelah inkubasi.

34

Restriksi Plasmid Pemilihan Buffer

Penambahan Enzim Penambahan T4
Penambahan Penambahan ddH2O
Alkaline Fosfatase DNA Ligase
Buffer

Inkubasi

35

Restriksi Plasmid Pemilihan Buffer

Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor
LIGASI APOPTIN

Penambahan Enzim 5' - terminal fosfat

dihapus sehingga
Alkaline Fosfatase berubah menjadi
5’OH
enzim yang terlibat dalam
penghapusan gugus fosfat
untuk mencegah self-ligation
dari vektor atau menghalangi
Sekarang mungkin
plasmid yang telah dilinearkan untuk memasukkan
untuk menjadi sirkular kembali DNA asing melalui
(masalah eksperimen kloning) partisipasi ligase DNA
sehingga dapat diselipkan gen yang
ingin di kloning
36

Protokol
Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor

LIGASI APOPTIN berubah

menjadi 5’OH
Penghilangan
(diharapkan
gugus P pada
vektor hanya
ujung 5’
berikatan
dengan insert)

akan tetapi
3’OH pada
3’OH insert
vektor akan
tidak dapat
menyambung
menyambung
pada 5’P insert
ke vektor

karena 5’P vektor telah

berubah menjadi 5’OH
sehingga terjadi nick
atau celah 37

Protokol
 Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor
PENAMBAHAN LARUTAN BUFFER

Berfungsi untuk mempertahankan nilai pH agar DNA

tidak terdegradasi dengan adanya penambahan zat lain

Menggunakan 10X Buffer yang mengandung 300mM Tris-

HCl (pH 7.8 at 25°C), 100mM MgCl2, 100mM DTT dan
10mM ATP.

Kebanyakan buffer enzim restriksi akan bekerja jika

menggunakan buffer yang dilengkapi dengan ATP .

38

Ligasi
 Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor
PENAMBAHAN PELARUT
ddH2O atau double distilled water

Berfungsi untuk melarutkan DNA yang

akan kita kloning
Kelebihannya : Tidak mengandung
EDTA yang dapat menghambat reaksi
enzimatis
Kekurangannya : timbul peluang untuk
berubahnya pH
Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA
memiliki sifat asam lemah, yang dalam
waktu lama dapat menyebabkan
degradasi DNA/RNA. Oleh karena itu
dilakukan penambahan buffer di awal.
39

Ligasi
 Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor
PENAMBAHAN DNA LIGASE
DNA ligase ditambahkan paling akhir karena kondisi larutan
harus disesuaikan agar ligasi berjalan efektif.

DNA LIGASE berasal dari E.Coli

enzim yang mengkatalisis pembentukan

ikatan fosfodiester antara ujung 5’-fosfat dan
3’-hidroksil pada DNA yang mengalami nick
yang dapat terjadi saat replikasi DNA,
rekombinasi dan kerusakan

T4 DNA Ligase
enzim ligase yang dihasilkan
oleh bakteri E. coli yang telah
terinfeksi virus T4 Bakteriofage 40

Ligasi
 DNA Ligase dan T4 DNA Ligase

Persamaan Perbedaan

• Mempunyai peran yang sama dalam • Terletak pada kofaktornya:

pembentukan ikatan phosphodiester – Kofaktor E.coli DNA Ligase adalah NAD+
antar nukleotida pada DNA yang akan
– Kofaktor T4 DNA Ligase adalah ATP
disambung

Jenis DNA ligase yang digunakan pada kloning adalah T4 DNA

Ligase

Kofaktor nya adalah ATP . Jadi, proses ligasi DNA T4 butuh buffer yang
mengandung ATP seperti yang telah ditambahkan sebelumnya 41

Ligasi
 MEKANISME
DNA LIGASE
hidrolisis kofaktor, yaitu
NAD+ atau ATP
menghasilkan kompleks enzim-
adenylate AMP
-melepaskan pyrofosfat inorganik (Ppi) jika kofaktor ATP,
-melepaskan nicotinamide mononucleotide (NMN) jika
kofaktor NAD+

menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP

sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA
iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan
42
melepaskan AMP dan enzim adenylate

Ligasi Protokol
 Insersi Gen Apoptin ke dalam Vektor
INKUBASI CAMPURAN LARUTAN
Suhu optimum aktivitas DNA ligase adalah pada suhu 37°C
namun pada suhu tersebut akan menyebabkan :
• ikatan hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip menjadi
tidak stabil
• kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan
tersebut
Sehingga mengakibatkan denaturasi

Alternatif
inkubasi pada suhu yang diturunkan antara
4 dan 15°C dengan waktu inkubasi yang
diperpanjang (selama 1 malam)
Ligasi yang bertujuan untuk kloning
dilakukan pada suhu 4 °C semalaman, atau
pada suhu ruang selama 30 menit hingga
beberapa jam
43

Ligasi
TRANSFORMASI 44
TRANSFORMASI
Penyisipan pUC 19 ke dalam E.coli
Transformasi adalah proses mentransfer DNA eksogen ke
dalam sel.

Metode kimia dengan menggunakan muatan

Metode Kimia dan

memanfaatkan CaCl2 listrik untuk

Elektroporasi
Heat Shock

dan heat shock untuk memfasilitasi

mempromosikan penyerapan DNA.
masuknya DNA ke
dalam sel.

45
Transformasi Kimia Menggunakan Kalsium Klorida

DNA asing dapat dengan mudah diintroduksi ke sel

bakteri apabila DNA plasmid telah diberi perlakuan
dengan sel kompeten.
Sel kompeten dibuat dengan cara memberi perlakuan kation
divalen, seperti kalsium klorida (CaCl2) ke sel.
DNA plasmid kemudian dicampur dengan sel kompeten
tersebut.
Sel kompeten kemudian diberi perlakuan kejutan panas
(heat shock) pada suhu 42 °C, sehingga mengandung
antibiotik untuk diidentifikasi. 46
 Metode Kimia dan Heat Shock
Molekul CaCl2 akan menyebabkan sel-sel
bakteri membengkak dan membentuk
sferoplas yang kehilangan protein
periplasmiknya sehingga dinding sel menjadi
bocor

DNA akan membentuk kompleks resisten

DNase dengan ion-ion Ca2+ yang terikat
pada permukaan sel

Kompleks Ca2+ ini

kemudian diambil oleh
sel selama perlakuan 47
kejut panas diberikan
Preparasi Sel Kompeten jika Digunakan Metode Heat Shock

Mengambil 4 ml dari kultur sebelumnya dan memindahkan ke

Mengambil 1 koloni bakteri dalam botol berukuran 1-2 liter yang berisi 400 ml medium
Eschericia coli, dan Luria Bertani cair, dan lakukan inkubasi di dalam incubator
melakukan pembiakan. shaker 250 OD mencapai 0,375 pada panjang gelombang 590
nm.

Membagi kultur menjadi 8

sama rata dan
memasukkannya ke dalam
tabung berisi 50 ml larutan
polypropylene yang sudah
didinginkan.
Melakukan pengocokan sel Membuang supernatant dan
selama 7 menit dengan memasukan resuspensi ke
kecepatan 3.000 rpm pada dalam 10 ml larutan CaCl2
suhu 4oC tanpa jeda. yang sudah didinginkan.

Membuat aliquot 0,1-0,25 ml

Melakukan pengocokan kembali selama 5 di dalam eppendorf tube
menit dengan kecepatan 2.500 rpm pada yang sudah didinginkan di
suhu 4oC, lalu membuang supernatant dan dalam wadah berisi es atau
memasukan resuspensi ke dalam 10 ml segera memasukannya ke 48
larutan CaCl2 dingin. dalam lemari pendingin
dengan suhu -80oC.
Tahapan Transformasi Metode Heat Shock

Mengambil 50 μl sel kompeten dan menambahkannya Dikejutpanaskan (heat shock)

dengan 10 μl hasil ligase, sehingga proses transformasi pada suhu 42°C selama 45
bakteri diawali dengan pembuatan sel kompeten. detik sehingga membran sel
Pencampuran sel kompeten dan DNA insert diinkubasi akan terbuka dan vektor
bersama dengan larutan kalsium klorida (CaCl2) yang dapat masuk ke dalam host
terdapat pada TFB. cell.

Setelah itu dilakukan inkubasi di

dalam es selama 5 menit. Kemudia
Melakukan pengocokan sel Tahap akhir
campuran ditambahkan dengan
selama 7 menit dengan adalah bakteri
100 μl YT dan diinkubasi kembali
kecepatan 3.000 rpm pada disebar di atas
pada suhu 37o C pada shaker
suhu 4oC tanpa jeda. media padat.
kecepatan 250 rpm selama 20
menit.

49
Teknik Elektroporasi

50
 Perbedaan antara
Teknik Kimiawi dan
Elektroporasi
Indikator Perbedaan Teknik Kimiawi Elektroporasi
Waktu transformasi lama Cepat
Efisiensi rendah Tinggi
Biaya Lebih murah Lebih mahal
Sensitivitas Tidak bermasalah Sensitif terhadap garam
sehingga dapat merusak sampel

Penambahan konsentrasi Dapat ditambahkan konsentrasi Tidak dapat ditambahkan

lebih banyak konsentrasi lebih banyak karena
berisiko jika ditambahkan
garam 51
3 Kemungkinan
Setelah
Elektroporasi
sel inang sama sekali tidak berhasil vektor berhasil masuk tetapi tidak
ditransformasi (tidak ada vektor yang dengan disisipi oleh gene of interest
masuk) dalam kasus ini adalah gen apoptin

A B

vektor berhasil disisipi oleh gen

apoptin dan berhasil masuk ke
dalam sel inang

C 52
Screening Host Cell (Eschericia coli) yang
Berhasil Ditransformasi

Screening

Transformas
Ekspresi
i

Colony PCR dan Blue- Kromatagrafi afinitas &

White Screening SDS-PAGE
53
Screening Transformasi
Definisi Screening Transformasi:
Metode yang dilakukan untuk melakukan penyeleksian terhadap vector
rekombinan hasil dari cloning dengan melihat apakah proses transformasi
telah berjalan sesuai dengan baik.
Metode yang Digunakan:
Colony PCR

54
Colony PCR

Tujuan

Kompenen yang Dibutuhkan

Untuk memastikan panjang
dari gen insert yang tersisip Dibutuhkan primer (reverse dan Tahapan Tambahan
sudah sesuai seperti yang
diinginkan atau belum.
forward) yang dapat
mengamplifikasi bagian gen Hasil dari PCR koloni
insert. kemudian dapat dilanjutkan
Pada plasmid pUC19 yang telah dengan proses elektroforesis,
memiliki situs primer universal sehingga dapat diketahui
M13 dimana primer ini dapat panjang dari produk PCR
digunakan untuk mengamplifikasi karena panjang sisi Multiple
sisi Multiple Cloning Site yang Cloning Site dan gen insert
merupakan lokasi dimana gen telah diketahui dan dapat
insert dimasukkan. dilakukan pemilihan koloni
yang memiliki panjang gen 55
insert yang benar.
 Screening Transformasi

Metode yang Digunakan:

White-Blue Screening

Plasmid yang digunakan pada proses cloning ini

memungkinkan untuk melakukan teknik ini karena
plasmid ini memiliki gen LacZ dan sisi Multiple Cloning
Site atau MCS yang berada pada LacZ tersebut.

Koloni-koloni host cell yang telah ditransformasi akan

memiliki dua warna, yaitu biru dan putih.
Screening dapat dilakukan dengan memilih sebagian
koloni yang berwarna putih untuk dibuat replica atau
library dimana koloni yang berwarna putih
menunjukkan bahwa telah ada gen yang tersisip ke
dalam sisi Multiple Cloning Site atau MCS dari
plasmid pUC18.
56
Screening Ekspresi
Definisi Screening Ekspresi:
Metode diakukan untuk mengecek keberadaan protein apoptin yang
dihasilkan oleh Sel Rekombinan

Tahapan Screening

Kromatografi
SDS-PAGE
Afinitas

57
Screening Ekspresi: Kromatografi Afinitas

Penambahan asam amino, domain fungsional, ataupun

protein keseluruhan untuk membantu rekayasa dan
purifikasi DNA.

Salah satu fusion tag yang paling umum dikenal sebagai

tag 6His atau tag PolyHis (residu histidin), yang akan
mengikat ion logam seperti nikel atau kobalt pada kolom
kromatografi. Apoptin yang memiliki PolyHis akan dapat
dipisahkan dari molekul lain dalam kolom kromatografi
afinitas

58
Screening Ekspresi: SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

(SDS-PAGE) merupakan metode yang dapat dilakukan untuk
memisahkan protein menurut ukurannya.
Dengan mencocokan hasil protein terpurifikasi dengan
marker, apoptin dapat dideteksi.
59
TEKNIK 60

SELEKSI
 SELEKSI ANTIBIOTIK
Masukkan gen
penyandi antibiotik
resisten pada DNA
PRINSIP: Bakteri plasmid yang kita Bakteri yang tidak
tidak dapat hidup transformasikan. berhasil disusupi oleh
pada media yang
TUJUAN: bakteri plasmid akan mati
mengandung
hostnya menjadi dengan sendirinya.
antibiotik
tahan hidup di media
yang mengandung
antibiotik

61
 Seleksi
antibiotik
Plasmid puc19 memiliki AmpR sehingga dapat mengetahui apakah plasmid telah
masuk ke dalam host melalui seleksi antibiotik.

62
 BLUE • Blue White Screen adalah teknik seleksi yang akan
mengetahui apakah GOI berhasil masuk ke dalam

WHITE plasmid.
• Teknik ini berhubungan dengan mekanisme kerja LacZ

SCREEN • LacZ adalah Enzim yang dapat memecah substrat

seperti X-gal (suatu galaktosa yang dimodifikasi)
menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-
chloro-3-hydroxyindol yang selanjutnya dioksidasi
menjadi 5,5′-dibromo-4,4′-dichloro-indigo yang
berwarna biru.

63
BLUE WHITE SCREEN

64
 BLUE • Jika insert berhasil disisipkan
(diligasikan) dengan vektor
WHITE • otomatis gen lacZ-nya akan terdisrupsi
SCREEN (rusak)
• ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan
indigo yang berwarna biru
• koloni bakteri akan berwarna putih
• Hanya koloni putih yang tumbuh pada
media yang mengandung antibiotik
dan X-Gal sajalah yang kemungkinan
mengandung gen yang kita
65
transformasikan
 BLUE WHITE SCREEN
Plasmid puc19 memiliki lacZ sehingga
teknik biru-putih dapat digunakan
untuk mengetahui GOI berhasil masuk
atau tidak kedalam plasmid.

66
REFERENSI
• https://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/

• http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html

• http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html

• http://www.biocyclopedia.com/index/biotechnology/genes_genetic_engineering/tools_of_genetic_engineering/biotech_enzyme_example.php

• http://www.genscript.com/his_tagged_protein_detection_purification.html

• http://www.bio-rad.com/featured/en/his-tag-purification.html

• http://opal.msu.montana.edu/cftr/Diary/histag.htm

• http://www.iba-lifesciences.com/Double-tag_His-tag.html

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2909483/

• http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?categoryId=11440&catalogId=10101&productId=&top=Y&storeId=11784&langId=-1

• http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay?categoryId=11440&catalogId=10101&productId=&top=Y&storeId=11784&langId=-1

• https://www.neb.com/products/c2529-nico21de3-competent-e-coli

• https://www.neb.com/products/c2530-bl21-competent-e-coli#pd-description

• http://www.invivogen.com/pselect-his-tag

• https://www.addgene.org/plasmid-protocols/annealed-oligo-cloning/

• http://oxfordgenetics.com/dna-component-information/peptide-tag-options/flag-tag-plasmid-vector-information

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC136915/pdf/1400.pdf
67
• https://lifescience.roche.com/campaigns/DeveloperTips/protein-purification/his-tag.html