PLASMID

1. Apakah pengertian Plasmid?

Jawab : Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang
berantai ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak
mengandung gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah
mengalami modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi
genetik. Plasmid terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot.
Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada
organisme yang akan direkayasa.
2. Apakah fungsi plasmid?
Jawab : Fungsi plasmid adalah sebagai pembawa sifat non-esensial bagi
pertumbuhan bakteri. Esensial disini berarti berperan secara langsung dalam
metabolisme dan segala aktivitas biologis yang menyokong pertumbuhan
bakteri. Umumnya plasmid memiliki gen-gen pembawa sifat resisten
terhadap antibiotik. Antibiotik sendiri, seperti yang Anda tahu, tidak selalu
ada dalam lingkungan, hingga keberadaan gen-gen tersebut tidak esensial.
Fungsi plasmid juga merupakan faktor penentu nomenklatur atau penamaan
plasmid. Plasmid Ti contohnya, yang diberi nama sesuai kemampuan plasmid
tersebut menginduksi tumor pada tumbuhan, membentuk crown gal
sedangkan pSym adalah gen yang bertanggung jawab dalam proses
pembentukan bintil akar spesies bakteri Rhizobium pada legum-leguman.
3. Bagaimana ciri-ciri plasmid?
Jawab : Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :
a) berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)
b) dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti
c) terdapat di luar kromosom
d) secara genetik dapat ditransfer secara stabil
4. Berdasarkan tujuan penggunaannya dibagi berapa jeniskah plasmid?
Sebutkan!
Jawab : beradasarkan tujuan penggunaannya plasmid dibagi menjadi 2 yaitu
1) Plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19
 dan pBR 322 dan 2) Plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang
digunakan adalah plasmid Ti.
5. Apakah syarat yang harus dimiliki plasmid agar dapat digunakan sebagai
vektor?
Jawab : syarat yang harus dimiliki oleh plasmid yaitu
1) ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya
2) mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai
masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang
3) mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam
salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan
fragmen DNA asing
4) memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel
inang.
6. Sebutkan jenis-jenis vektor plasmid!
Jawab : Jenis-jenis vektor plasmid yaitu
a) Vektor Ekspresi: Mereka digunakan untuk mengekspresikan protein non-
diri dalam sel inang. Mereka juga dapat digunakan untuk mengekspresikan
gen yang berfungsi dalam genom inang. Mereka berisi urutan promotor
bersama dengan urutan terminator transkripsi dan gen yang disisipkan.
Daerah promoter mendorong transkripsi memasukkan gen ke dalam
transkrip RNA, dan urutan terminator transkripsi berhenti setelah gen telah
ditranskrip untuk mencegah generasi transkrip panjang yang bisa, pada
gilirannya, menyebabkan kesalahan RNA.
b) Vektor Kloning: Ini adalah jenis vektor yang digunakan untuk tujuan
memperkenalkan gen ke dalam sel inang. Setelah gen ini berhasil
dikloning dan diungkapkan dalam sel inang melalui transformasi, dapat
dimanipulasi sesuai kebutuhan selama percobaan. Ini tidak setiap gen
khusus terpisah dari MCS, gen reporter, dan penanda seleksi.
c) Vektor Shuttle: Mereka adalah vektor khusus yang dapat berkembang biak
dan mengekspresikan memasukkan gen pada dua sistem host yang
berbeda. Hal ini memungkinkan para ilmuwan untuk mempelajari efek
dari produk gen dalam dua lingkungan host yang berbeda. Vektor shuttle
 yang paling umum adalah mereka yang dapat berkembang dalam
Saccharomyces cerevisiae dan Escherichia coli.
7. Bagaimana penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika?
Jawab : Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan
kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses
penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah
sebagai berikut :
1) penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada
beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan
untuk prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme
eukariot.
2) bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat
pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai
tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya
plasmid pada sel inang
3) apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka
langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong
plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama
dengan pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal :
EcoR1
4) langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang
sesuai pada daerah potongannya
5) plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat
tertentu, yang telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama
dengan pemotong plasmid.
8. Untuk melakukan pemotongan pada plasmid digunakan suatu enzim yang
bernama enzim restriksi. Bagaimana prinsip kerja ensim rektriksi?
Jawab : Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama
dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara
plasmid dan DNA asing yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim
restriksi adalah:
 a) Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi.
Enzim pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada
situs tersebut.
b) Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan
poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca
dengan arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula
nukleotidanya.
c) Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung
kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).
9. Bagaimana cara membentuk plasmid rekombinan/
Jawab : Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat
DNA asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing
tersebut dengan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai
sambungan antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut
mengandung sifat tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara
sederhana prosedur untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan
sebagai berikut:
1) menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu
2) menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor
3) pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzim
restriksi semisal dari E. Coli
4) pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim
restriksi yang sama yaitu E. Coli
5) hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid
dngan menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase
akan mengikat ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan
fosfodiester sehingga plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa
bersatu
6) terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat
tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk
memperoleh organisme transgenik.
10. Bagaimana proses penggunaan plasmid untuk mengkloning bakteri?
Jawab : Proses penggunaan plasmid bakteri untuk mengklon gen adalah
sebagai berikut :
a) DNA plasmid diisolasi dari bakteri dan DNA berisi gen yang dinginkan
dari jenis sel lain misalnya gen yang mengkode suatu hormon.
b) Sepotong DNA yang berisi gen tersebut diselipkan ke dalam salah satu
plasmid, yang kemudian menghasilkan DNA rekombinan
c) Plasmid rekombinan dikembalikan ke sel bakteri
d) Sel bakteri ditumbuhkan dalam kultur, kemudian membentuk klon sel.
DNA asing yang disambungkang ke dalam plasmid tidak merusak
kemampuan plasmid untuk bereplikasi di dalam sel bakteri dan gen yang
diinginkan direplikasi bersama dengan plasmid begitu sel inangnya
menjadi banyak. Dapat dikatakan gen itu telah diklon.
e) Identifikasi klon bakteri yang membawa gen yang diinginkan tersebut.
f) Aplikasi terakhir dari pengklonan gen dalam bakteri
 PEMURNIAN DNA

1. Apa yang dimaksud dengan DNA?

Jawab : DNA merupakan asam nukleat yang berada di dalam dan/atau di luar
inti sel (nukleus). Substansi ini dimiliki oleh semua organisme hidup (virus
pengecualian).
2. Bagaimana struktur DNA?
Jawab : Struktur DNA yang digambarkan oleh Watson dan Crick dari hasil
foto Rosalind Franklin yaitu berupa untaian double helix dengan gula – fosfat
terletak di luar struktur double helix dan basa – basa nitrogen menghadap ke
sebelah dalam struktur double helix.
3. Bagaimana peran DNA?
Jawab : Peran DNA secara umum di dalam sel adalah sebagai materi genetik,
dengan kata lain DNA menyimpan blueprint bagi setiap aktivitas sel. Materi
genetik tersebut adalah suatu faktor pembawa sifat organisme yaitu gen. Gen
dapat diidentifikasi dan direkayasa apabila telah diambil dari sumbernya yaitu
DNA. Gen pun dapat ditransfer dari individu satu ke individu yang lain.
4. Apa yang dimaksud dengan isolasi DNA?
Jawab : Isolasi DNA adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai
dalam mempelajari teknik biologi sel. Teknik ini diawali dengan perusakan
dinding sel (tumbuhan) dan lisis membran sel yang merupakan upaya
pemecahan sel, serta presipitasi DNA yang akan dipisahkan (purifikasi
DNA). Perusakan dinding sel biasanya menggunakan nitrogen cair yang
memiliki suhu -169˚C. Penggunakan nitrogen cair ini dimaksudkan untuk
membekukan sel, setelah sel beku lalu sel dirusak (digerus) sampai benar
benar halus dengan mortar agar dinding sel rusak. Lisis membran sel yaitu
proses untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Teknik ini umumnya
dilakukan menggunakan larutan deterjen kationik yaitu CTAB. Hal ini
dikarenakan waktu isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif
lebih mudah.
5. Bagaimana prinsip-prinsip dalam isolasi DNA?
 Jawab : Prinsip – prinsip yang digunakan untuk mengisolasi DNA yaitu
pelisisan, ekstraksi, pengendapan, dan pemurnian. Pelisisan yang dimaksud
yaitu menghancurkan dinding sel atau membran sel sehingga DNA di dalam
sel tersebut dapat keluar dari sel. Pelisisan tersebut dapat dilakukan dengan
menggunakan NLS maupun melalui pemanasan. Ekstraksi merupakan
penghancuran sel. Ekstraksi dapat dilakukan secara mekanik yaitu dengan
menumbuk sel tersebut. Prinsip selanjutnya yaitu pengendapan. Pengendapan
atau presipitasi bertujuan untuk memisahkan supernatant dengan pellet.
Pengendapan tersebut dapat menggunakan sentrifugator.
6. Apakah reagent-reagent yang dapat digunakan dalam isolasi DNA?
Jawab : Reagent-reagent yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA
yaitu Nitogen Cair, Polyvinyl Pyrrolidone (PVP), Bufer CTAB,
Mercaptoethanol, CHISAM, isopropanol dingin, bufer Tris-EDTA (TE),
RNAse, dan ethanol 70%. Sedangkan alat-alatnya adalah sebagai berikut,
yaitu Mortar dan Pestle, Tabung Nitrogen, Tube Eppendorf 1,5 ml atau 2 ml,
mikropipet, oven, freezer, mesin elektrofotometer, mesin spektrofotometer,
mesin sentrifuse, pipet tip 1000 µl dan 20 µl.
7. Apakah tujuan dari pemurnian (purifikasi) DNA?
Jawab : Pemurnian (purifikasi) DNA bertujuan untuk menghilangkan
beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol), polisakarida, RNA
dan juga protein.
8. Bagaimana cara pemurnian DNA?
Jawab : Pemurnian dari kontaminan protein dan RNA dilakukan
menggunakan senyawa kloroform isoamilalkohol, asam asetat, dan enzim
RNAse. Senyawa kloroform isoamilalkohol dan asam asetat berfungsi
mendenaturasi protein sedangkan enzim RNAse berfungsi melisiskan RNA
dari ekstrak DNA tersebut. Presipitasi (pemekatan) DNA dilakukan
menggunakan isopropanol dingin yang bertujuan agar DNA tersebut
mengendap/mengumpul sekaligus memisahkannya dari garam-garam mineral
sisa CTAB. Pelet hasil presipitasi oleh isopropanol ini dibersihkan
menggunakan alkohol 70%. Pemurnian ini merupakan tahapan paling penting
dalam Isolasi DNA. Karena bila ada kontaminan selain DNA maka hasil
 isolasi DNA yang dilakukan diangap gagal. Kontaminasi ini dapat
menurunkan kualitas DNA hasil isolasi dan mengakibatkan data yang didapat
tidak valid.
9. Bagaimana proses ekstraksi DNA?
Jawab : Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan
tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell
walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan
DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA
telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul
berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA
adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-
komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting
untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus
dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi. Secara kimiawi penghancuran
sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA
(ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA
berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini
berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan
aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). Pada manusia, hanya
sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih
efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu
sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan
menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat)
dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan
terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum,
lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan
lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel
darah putih diambil dengan klinipette.
10. Bagimana prinsip kerja isolasi DNA kromosom?
Jawab : Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom
dari komponen-komponen sel lain. Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur
mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan
detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut
ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase
(yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah
DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk
menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA
kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.
 MANIPULASI DARI DNA MURNI

1. Berapa kah struktur yang dimiliki DNA?

Jawab : Struktur DNA terdiri dari ada tiga struktur. Struktur tersebut antara
lain struktur primer, struktur sekunder, dan struktur tersier.
2. Apa yang dimaksud dengan struktur primer DNA?
Jawab : Struktur primer DNA adalah polimer dari monomer nukleotida.
Setiap nukleotida terdiri dari satu basa nitrogen berupa senyawa puri dan
pirimidin, satu gula pentosa berupa 2’-deoksi-D-ribosa dalam bentuk
furanosa, dan satu molekul fosfat.
3. Apa yang dimaksud dengan struktur tersier DNA?
Jawab : Kebanyakan DNA merupakan molekul lingkar. Konformasi ini
terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk struktur tertutup yang
tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang diisolasi dari bakteri,
virus dan mitokondria seringkali berbentuk superkoil, selain itu DNA dapat
berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang bebas.
4. Apa yang dimaksud dengan manipulasi DNA?
Jawab : DNA rekombinan– teknik yang memungkinkan penggabungan 2
molekul DNA yang berbeda, memperbanyaknya, dan memodifikasinya.
Isolasi potongan DNA diluar genomnya dan memperbanyaknya diluar selnya.
Komponen yang terlibat: enzim restriksi endonuklease dan DNA ligase.
5. Jelaskan macam-macam manipulasi DNA!
Jawab : Adapun macam-macam teknik/teknologi yang termasuk dalam
manipulasi DNA antara lain:
1) Teknologi DNA rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini
adalah suatu ilmu yang mempelajari pembentukan kombinasi materi
genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu
vektor sehingga memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami
perbanyakan dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel
inang. Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya
melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-masing gen dan
mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan
 diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat
dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
2) Teknik kultur jaringan merupakan suatu cara alternatif perbanyakan
tanaman secara vegetatif yang hasilnya lebih cepat, seragam dan banyak.
Perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan (in vitro) dilakukan
untuk tanaman yang bernilai ekonomi tinggi dan pemenuhan kebutuhan
akan bibit tanaman. Teknik ini memberikan peluang baru dalam proses
pembibitan. Bibit yang dihasilkan berasal dari bagian tanaman yang
digunakan sebagai eksplan, di mana satu bagian kecil hasil potongan
eksplan dapat menghasilkan ribuan benih bibit tanaman dengan proses
penggojokan.
3) Teknologi hibridoma
Teknik hibridoma adalah teknik pembuatan sel yang dihasilkan dari fusi
antara sel B limfosit dengan sel kanker. Sifat dari sel hibridoma ini adalah
imortal. Proses pembuatan dari sel hibridoma adalah sebagai berikut,
pertama-tama dilakukan proses imunisasi dengan menggunakan antigen
tertentu. Kemudian dipisahkan sel B-limfosit dari organ limpa, lalu sel ini
difusikan dengan sel kanker immortal. Tahapan fusi sel hibridoma ini
dilakukan dengan membuat membran sel menjadi lebih permeabel. Sel
hibrid hasil fusi inilah yang disebut sebagai sel hibridoma yang merupakan
sel imortal yang dapat menghasilkan antibodi.
6. Enzim-enzim apa sajakah yang berperan dalam manipulasi DNA?
Jawab : Enzim-enzim yang berperan dalam manipulasi DNA: 1) Nuklease
yang memotong, memendekan atau mendegradasi molekul asam nukleat, 2)
Ligase menyambung asam nukleat menjadi satu, 3) Polimerase membuat kopi
dari molekul, 4) Enzim modifikasi, menambah atau menghilangkan gugus
kimiawi dan 5) Topoisomerase, mengubah atau membuat DNA berlilitan
(supercoil) dari DNA sirkular.
7. Apa yang dimaksud dengan teknik DNA rekombinan?
Jawab : Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk
menghasilkan sifat baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan
DNA genom. Teknik DNA rekombinan merupakan kumpulan bertujuan
 untuk merekombinasi gen dalam tabung reaksi. Teknik DNA rekombinan
meliputi isolasi DNA, teknik memotong DNA, teknik menggbung DNA dan
teknik untuk memasukan DNA ke dalam sel hidup. Teknologi DNA
rekombinan atau sering disebut juga rekayasa genetika ini adalah suatu ilmu
yang mempelajari pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan
cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya terjadinya integrasi dan mengalami perbanyakan dalam
suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.
8. Apakah manfaat dari rekayasa genetika?
Jawab : Manfaat rekayasa genetika ini diantaranya adalah dimungkinkannya
melakukan isolasi dan mempelajari fungsi masing-masing gen dan
mekanisme kontrolnya. Selain itu, rekayasa genetika juga memungkinkan
diperolehnya suatu produk dengan sifat tertentu dalam waktu lebih cepat dan
jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
9. Bagaimanakah perkembangan dari rekayasa genetic pada hewan?
Jawab : telah banyak proses rekayasa genetika yang dilakukan pada hewan
salah satunya yaitu sebagai berikut.
a) Ayam pengasil Tetrasiklin. Penemuan ini merupakan terobosan baru
dalam mengembangkan boureaktor yang mampu menghasilakan
viofarmasi dalag dalam jumlah kuantitas yang besar. Terasiklin merupakan
antibiotic yang diperlukan dalam dunia medis untuk men-treatment pasien.
Selama ini tetrasiklin digasilkan dari mikroorganisme. Dari penemuan ini,
diharapkan ayam transgenic mampu menghasilkan tetrasiklin dalam
jumlah yang lebih banyak serta lebih hemat dalam proses pembuatannya.
b) Sapi Penghasil Omega 3. Omega 3 merupakan salah zat yang penting bagi
manusia. Dalam pendekata ekonomi, maka dapat dihasilkan omega 3
dengan cara merekayasa sapi menjadi hewan transgenic penghasil omega
3.
c) Tikus Trasgenik Resisten Terhadap Infeksi Bakteri. Resistensi suatu
bakteri terhadap antibiotic merupakan masalah yang serirs bagi dunia
medis dan farmasi. Untuk itu diperlukan suatu hewan yang mampu
menghasilkan antibiotic .
10. Mengapa rekayasa pada tumbuhan lebih cepat dari rekayasa hewan atau
manusia?
Jawab : Rekayasa genetika pada tanaman lebih cepat berkembang
dibandingkan dengan rekayasa pada hewan dan manusia yaitu karena
tumbuhan mempunyai sifat totipotensi (setiap potongan organ tumbuhan
dapat menjadi tumbuhan yang sempurna). Hal ini tidak dapat terjadi pada
hewan, kita tidak dapat menumbuhkan seekor tikus dari potongan kepala atau
ekornya. Alasan kedua karena petani merupakan potensi besar bagi varietas-
varietas baru yang lebih unggul, sehingga mengundang para pebisnis untuk
masuk ke area ini.
 KLONING PADA BAKTERI ESCHERICA COLI

1. Apa yang dimaksud dengan kloning?

Jawab : Kloning dalam biologi adalah proses menghasilkan populasi serupa
genetik individu identik yang terjadi di alam saat organisme seperti bakteri ,
serangga atau tanaman bereproduksi secara aseksual . Kloning dalam
bioteknologi mengacu pada proses yang digunakan untuk membuat salinan
DNA fragmen ( kloning molekuler ), sel (kloning sel), atau organisme.
2. Apa sajakah jenis-jenis dari kloning?
Jawab : Terdapat beberapa jenis kloning yaitu, Kloning DNA Rekombinan,
Kloning Kesehatan (Terapeutic Cloning), Kloning Reproduksi (Reproductive
Cloning).
3. Apakah manfaat dari kloning?
Jawab : Kloning memiliki beberapa manfaat yaitu : Untuk pengembangan
ilmu pengetahuan, Untuk mengembangkan dan memperbanyak bibit unggul,
Untuk tujuan diagnostik dan terapi , Menolong atau menyembuhkan pasangan
infertil mempunyai turunan, Melestarikan Spesies Langka, Meningkatkan
pasokan makanan. Namun ada juga beberapa efek negative dari kloning ini.
4. Bagaimana langkah-langkah dalam kloning?
Jawab : Cloning umumnya digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA
yang mengandung seluruh gen , tetapi juga dapat digunakan untuk
memperkuat setiap urutan DNA seperti promotor , non-coding sequences dan
DNA secara acak terfragmentasi. Kloning dari setiap fragmen DNA dasarnya
melibatkan empat langkah
1) fragmentasi – pemutusan sebuah untai DNA
2) ligasi - perekatan bersama potongan-potongan DNA dalam urutan yang
diinginkan
3) transfeksi - memasukkan potongan-potongan yang baru terbentuk DNA ke
dalam sel
4) penyaringan/seleksi - memilih keluar sel yang berhasil transfected dengan
DNA baru
5. Apakah yang dimaksud dengan bakteri E.coli?
Jawab : E. coli merupakan singkatan dari Escherichia coli yang mengacu
pada sekelompok bakteri yang biasanya ditemukan dalam makanan dan
air. Kebanyakan dari bakteri ini tidak berbahaya, tetapi beberapa jenis dapat
menyebabkan penyakit. Penyakit akibat E. coli timbul saat bakteri ini
melepaskan racun yang dinamakan Sehiga sehingga membuat orang
sakit. Racun E. coli paling sering menyebabkan masalah perut dan usus,
seperti diare dan muntah. Sebagian kecil kasus infeksi bisa mengancam jiwa,
sementara penderita yang lain akan pulih setelah sekitar satu minggu. Anak-
anak, orang-orang dengan gangguan sistem kekebalan tubuh, dan orang tua
berada pada risiko tertinggi akibat serangan E. coli.
6. Bagaimana ciri-ciri dari bakteri e-coli?
Jawab : Morfologi dan ciri-ciri pembeda Escherichia coli yaitu: (1)
merupakan batang gram negatif, (2) terdapat tunggal, berpasangan, dan dalam
rantai pendek, (3) biasanya tidak berkapsul, (4) tidak berspora, (5) motil atau
tidak motil, peritrikus, (6) aerobik, anaerobik fakultatif dan (7) penghuni
normal usus, seringkali menyebabkan infeksi.
7. Apakah manfaat dari bakteri e-coli?
Jawab : Bakteri E. Coli yang berada di dalam usus besar manusia berfungi
untuk menekan pertumbuhan bakteri jahat, dia juga membantu dalam proses
pencernaan termasuk pembusukan sisa-sisa makanan dalam usus besar.
Fungsi utama yang lain dari E. Coli adalah membantu memproduksi vitamin
K melalui proses pembusukan sisa makan. Vitamin K berfungsi untuk
pembekuan darah misalkan saat terjadi perdarahan seperti pada luka/mimisan
vitamin K bisa membantu menghentikannya.
8. Mengapa bakteri e-coli dapat digunakan dalam kloning?
Jawab : terdapat beberapa faktor yang dilihat yaitu faktor genetik
kederhanaan yang dimilik e-coli, laju pertumbuhan e-coli, keselamatan,
kemampuan untuk host DNA asing pada e-coli dan faktor konjugasi dan
genome sequence.
9. Bagaimana cara kloning pada bakteri e-coli?
Jawab : Rekayasa genetik dengan menggunakan plasmid bakteri E. coli dapat
dilakukan sebagai berikut.
1) Menentukan gen yang diinginkan untuk disisipkan, misalnya gen
pengkode hormone insulin dari sel-sel pankreas manusia atau gen
pengkode hormone pertumbuhan dari kelenjar pituitari. Kromosom sel-sel
pankreas dikeluarkan dengan memecah membran plasma. Membran
plasma ini dipecah dengan diberi kejutan listrik atau dengan pemberian zat
kimia yaitu polietilen glikol atau kalsium klorida (CaCl2), sehingga
kromosom dapat keluar dari sel pankreas.
2) Kromosom yang diinginkan tadi dipotong dengan menggunakan enzim
restriksi endonuklease untuk melepaskan bagian DNA yang diinginkan,
kemudian memurnikan DNA tersebut. Elektroforesis dapat juga digunakan
untuk persiapan memurnikan fragmen DNA tertentu, selain digunakan
untuk menganalisis.
3) Mengektraksi plasmid dari sel bakteri. Plasmid dipisahkan dari sel dengan
cara memecah dinding sel bakteri. Hal ini dapat dilakukan dengan
menggunakan deterjen atau dengan enzim lisozim, kemudian dilisis
dengan natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. DNA
kromosom akan menggumpal dan dinetralisir dengan natrium asetat. DNA
plasmid ini akan menggumpal membentuk jaring-jaring dan dengan mudah
mengendap. Untuk memisahkan DNA ini dilakukan sentrifugasi.
4) Cairan yang mengandung plasmid ini dijenuhkan dengan pengendapan
etanol. DNA plasmid yang dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid yang
berbentuk lingkaran itu dipotong dengan enzim restriksi endonuklease
yaitu enzim yang sama digunakan untuk memotong DNA pankreas. Enzim
ini memecah ikatan fosfodiester pada molekul DNA. Endonuklease
memecah asam nukleat pada posisi internal, sedangkan enzim eksonuklase
memecah molekul DNA dari ujung molekulnya.
5) Kemudian pemasangan gen pengkode yang diinginkan tadi ke dalam
plasmid dengan menggunakan enzim ligase yang fungsinya
menggabungkan ikatan fosfodiester antara fragmen ujung-ujung yang
terpotong tadi. Proses penyambungan tersebut disebut ligasi. Karena enzim
 yang digunakan untuk memotong DNA sel pankreas dan plasmid sama
jenisnya, akan menghasilkan ujung-ujung yang lengket yang sama
strukturnya, sehingga penyambungannya akan menyatu sempurna. Suhu
optimum untuk ligasi adalah 37oC, tetapi ikatannya tidak stabil. Ligasi
akan berhasil jika dilakukan pada suhu 4o-150oC.
6) Plasmid yang telah disisipi gen pengkode yang diinginkan itu dimasukkan
ke dalam sel bakteri coli dengan cara tranformasi. Transformasi dilakukan
dengan memasukkan bakteri E. coli ke dalam larutan CaCl2 sehingga
terbentuk lubang-lubang sementara, sehingga plasmid dapat masuk ke
dalam sel bakteri. Diharapkan bakteri yang telah disisipi gen tersebut
mewarisi sifat gen baru, sehingga bakteri yang telah disisipi dengan gen
pengkode insulin dapatm memproduksi insulin.
7) Langkah selanjutnya adalah mengembangbiakkan bakteri hasil rekayasa
dalam tabung fermentasi yang berisi medium untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan bakteri E. coli untuk memproduksi insulin dalam
jumlah yang banyak. Insulin yang terbentuk kemudian dipisahkan dari
senyawa yang lain.
10. Bagaimana cara membuat insulin dengan menggunakan bakteri e-coli?
Jawab : Adapun langkah-langkah yang dilakukan yaitu sebagai berikut.
1) Pada proses pembuatan insulin ini, langkah pertama adalah mengisolasi
plasmid dari E. coli. Plasmid adalah salah satu bahan genetik bakteri yang
berupa untaian DNA berbentuk lingkaran kecil. Selain plasmid, bakteri
juga memiliki kromosom. Keunikan plasmid ini adalah: ia bisa keluar-
masuk ‘tubuh’ bakteri, dan bahkan sering dipertukarkan antar bakteri.
2) Pada langkah kedua ini plasmid yang telah diisolir dipotong pada segmen
tertentu menggunakan enzim restriksi endonuklease. Sementara itu DNA
yang di isolasi dari sel pankreas dipotong pada suatu segmen untuk
mengambil segmen pengkode insulin. Pemotongan dilakukan dengan
enzim yang sama.
3) DNA kode insulin tersebut disambungkan pada plasmid menggunakan
bantuan enzim DNA ligase. Hasilnya adalah kombinasi DNA kode insulin
dengan plasmid bakteri yang disebut DNA rekombinan.
4) DNA rekombinan yang terbentuk disisipkan kembali ke sel bakteri.
5) Bila bakteri E. coli berbiak, maka akan dihasilkan koloni bakteri yang
memiliki DNA rekombinan.