Buku Ajar
disusun oleh:
Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, Apt., M.Si.
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
BUKIT JIMBARAN
KATA PENGANTAR
Dengan mengucapkan syukur ”Om Awighnam Astu Nahma Sidham” semoga tiada aral yang
melintang dan memperoleh wara nugraha Ida Sang Hyang Widhi Wasa. Bahan ajar ini disusun agar
dapat memperkaya literatur dan memberi gambaran tentang Analisis Toksikologi Forensik. Analisis
toksikologi forensik adalah integrasi berbagai disiplin ilmu diantaranya kimia analisis dan prinsip-
prinsip dasar toksikologi, yang mencangkup aplikasi dan telaah tentang racun, yang berhubungan
dengan tindakan melawan hukum ”kriminal”.
Pada tulisan ini diawali dengan sub bahasan: ”Pengantar Menuju Ilmu Forensik” yang menjelaskan
definisi forensic science dan bidang ilmu yang tercangkup dalam forensik sains, kemudian
dilanjutkan dengan sub bahasan ”Pengantar Toksikologi” yang memberi gambaran tentang
pengertian ilmu toksikologi dan sejarah perkembangan ilmu toksikologi. Agar mahasiswa lebih
mengerti bagaimana tokson dapat menimbulkan efek keracunan pada sub bahasan berikutnya
dibahas ”Fase Kerja Toksik”. Sub bahasan ”Analisis Toksikologi Forensik” dibahas dalam bab IV,
karena sebagaian besar sampel analisis toksikologi merupakan materi biologi, maka dalam bab
berikutnya dibahas sifat dan cara penanganan materi biologi dalam analisis toksikologi. Bab
berikutnya membahas metode analisis yang digunakan dalam penyelenggaraan analisis toksikologi
forensik.
Sangat disadari tulisan ini masih jauh dari sempurna, namun langkah/usaha sekecil apapun akan
sangat berarti sebagai daya awal untuk langkah yang lebih besar. Menyadari hal tersebut penulis
sangat mengharapkan masukan dan saran, dari berbagai pihak guna menyempurnakan materi ini.
Saran dan masukan dapat dialamatkan ke penulis
Jimbaran, Juli 2008
Hormat kami
ttd
Penulis
PENGANTAR TOKSIKOLOGI
Biologi Patologi
Kimia Fisiologi
Toksikologi
Matematika Kesehatan masyarakat
Pengantar Toksikologi 11
zat tokson. Perubahan biologis yang − dalam industri makanan sebagai zat
diakibatkan oleh zat tokson dapat diungkap tambahan baik langsung maupun tidak
melalui bantuan ilmu patologi, immonologi, langsung,
fisiologi. Untuk mengetahui efek berbahaya − dalam pertanian sebagai pestisida zat
dari suatu zat kimia pada suatu sel, jaringan pengatur pertumbuhan, peyerbuk
atau organisme memerlukan dukungan ilmu bantuan, dan zat tambahan pada
patologi, yaitu dalam menunjukan wujud makanan hewan,
perubahan / penyimpangan kasar, mikroskopi, − dalam bidang industri kimia sebagai
atau penyimpangan submikroskopi dari pelarut, komponen, dan bahan antara
normalnya. Perubahan biologi akibat paparan bagi plstik serta banyak jenis bahan
tokson dapat termanisfestasi dalam bentuk kimia lainnya.
perubahan sistem kekebakan (immun) tubuh, Di dalam industri kimia juga dipelajari
untuk itu diperlukan bidang ilmu immunologi pengaruh logam (misal dalam dalam
guna lebih dalam mengungkap efek zat toksik pertambangan dan tempat peleburan), produk
pada sistem kekebalan organisme. minyak bumi, kertas dan pulpa, tumbuhan
beracun, dan racun hewan terhadap kesehatan.
Mengadopsi konsep dasar yang dikemukakan
oleh Paracelcius, manusia menggolongkan LOOMIS (1979) berdasarkan aplikasinya
efek yang ditimbulkan oleh zat tokson menjadi toksikologi dikelompokkan dalam tiga
konsentrasi batas minimum memberikan efek, kelompok besar, yakni: toksikologi lingkungan,
daerah konsentrasi dimana memberikan efek toksikologi ekonomi dan toksikologi forensik.
yang menguntungkan (efek terapeutik , lebih Toksikologi lingkungan lebih memfokuskan
dikenal dengan efek farmakologi), batas telaah racun pada lingkungan, seperti
konsentrasi dimana sudah memberikan efek pencemaran lingkungan, dampak negatif dari
berbahaya (konsetrasi toksik), dan konstrasi akumulasi residu senyawa kimia pada
tertinggi yang dapat menimbulkan efek lingkungan, kesehatan lingkungan kerja.
kematian. Agar dapat menetapkan batasan Toksikologi ekonomi membahas segi manfaat
konsentrasi ini toksikologi memerlukan dan nilai ekonomis dari senobiotik. Tosikologi
dukungan ilmu kimia analisis, biokimia, forensik menekunkan diri pada aplikasi ilmu
maupun kimia instrmentasi, serta hubungannya toksikologi untuk kepentingan peradilan. Kerja
dengan biologi. Ilmu statistik sangat diperlukan utama dari toksikologi forensik adalah analisis
oleh toksikologi dalam mengolah baik data racun baik kualitatif maupun kuantitatif sebagai
kualitatif maupun data kuantitatif yang nantinya bukti dalam tindak kriminal (forensik) di
dapat dijadikan sebagai besaran ekspresi pengadilan.
parameter-parameter angka yang mewakili
Masih dijumpai subdisiplin toksikologi lainnya
populasi.
selain tiga golongan besar diatas, seperti
Bidang yang paling berkaitan dengan toksikologi analisis, toksikologi klinik,
toksikologi adalam farmakologi, karena ahli toksikologi kerja, toksikologi hukum, dan
farmakologi harus memahami tidak hanya efek toksikologi mekanistik.
bermanfaat zat kimia, tetapi juga efek
Untuk menegakan terapi keracunan yang
berbahayanya yang mungkin diterapkan pada
spesifik dan terarah, diperlukan kerjasama
penggunaan terapi. Farmakologi pada
antara dokter dan toksikolog klinik. Hasil
umumnya menelaah efek toksik, mekanisme
analisis toksikologi dapat memastikan
kerja toksik, hubungan dosis respon, dari suatu
diagnose klinis, dimana diagnose ini dapat
tokson.
dijadikan dasar dalam melakukan terapi yang
2.3. Cakupan dan Subdisiplin Toksikologi cepat dan tepat, serta lebih terarah, sehingga
ancaman kegagalan pengobatan (kematian)
Toksikologi sangat luas cakupannya. Ia
dapat dihindarkan. Analisis toksikologi klinik
menangani studi efek toksik “toksisitas” di
dapat berupa analisis kualitatif maupun
berbagai bidang, LU (1995) mengelompokkan
kuantitatif. Dari hasil analisis kualitatif dapat
ke dalam empat bidang, yaitu:
dipastikan bahwa kasus keracunan adalah
− bidang kedokteran untuk tujuan
memang benar diakibatkan oleh instoksikasi.
diagnostik, pencegahan, dan terapeutik,
Sedangkan dari hasil analisis kuantitatif dapat
Pengantar Toksikologi 12
diperoleh informasi tingkat toksisitas pasien. Tidak jarang pemakaian pestisida yang tidak
Dalam hal ini diperlukan interpretasi sesuai dengan atuaran, atau berlebih justru
konsentrasi toksikan, baik di darah maupun di memberi beban pencemaran terhadap
urin, yang lebih seksama. Untuk mengetahui lingkungan, perubahan ekosistem, karena
tepatnya tingkat toksisitas pasien, biasanya pembasmian pada salah satu insteksida akan
diperlukan analisis toksikan yang berulang baik berefek pada rantai makanan dari organisme
dari darah maupun urin. Dari perubahan tersebut, sehingga dapan juga mengakibatkan
konsentrasi di darah akan diperoleh gambaran berkurangnya atau bahkan musnahnya
apakah toksisitas pada fase eksposisi atau predator insek tersebut. Pemakaian pestisida,
sudah dalam fase eleminiasi. telah ditengarai mengakibatkan mutasi
genetika dari insektisida tersebut, sehingga
Keracunan mungkin terjadi akibat pejanan
pada akhirnya melahirkan mutan insek yang
tokson di tempat kerja. Hal ini mungkin dapat
justru resisten terhadap pestisida jenis
mengkibatkan efek buruk yang akut maupun
tertentu. Pemakaian pertisida yang tidak benar
kronik. Efek toksik yang ditimbulkan oleh
juga merupakan salah satu penginduksi
kesehatan dan keselamatan kerja merupakan
toksisitas kronik (menahun). Petani
masalah bidang toksikologi kerja. Toksikologi
berkeinginan mendapatkan untung yang tinggi
kerja merupakan subbagian dari toksikologi
dari hasil pertaniannya, tidak jarang
lingkungan.
penyemprotan pestisida berlebih justru
Toksikologi hukum mencoba melindungi dilakukan pada produk pertanian satu-dua hari
masyarakat umum dari efek berbahaya tokson sebelum panen, dengan tujuan buah atau daun
dengan membuat undang-undang, peraturan, sayuran tidak termakan insek sebelum panen,
dan standar yang membatasi atau melarang dengan jalan demikian akan diperoleh buah
penggunaan zat kimia yang sangat beracun, atau sayuran yang ranun, tidak termakan oleh
juga dengan menentukan syarat penggunaan insek. Namun tindakan ini justru
zat kimia lainnya. Gambaran lengkap tentang membahayakan konsumen, karena pestisida
efek toksik sangat diperlukan untuk kemungkinan dapat terakumulasi secara
menetapkan peraturan dan standar yang baik. perlahan di dalam tubuh konsumen, melalui
Profil semacam itu hanya dapan ditentukan konsumsi buah atau sayuran yang sebelumnya
lewat berbagai jenis penelititan toksikologi diberikan pestisida sebelum panen.
yang relevan, dan ini membentuk dasar bagi
Banyaknya kasus keracunan masif akut dan
toksikologi hukum.
keracunan kronis, yang diakibatkan oleh
2.4. Perkembangan Mutahir Toksikologi pencemaran lingkungan akibat proses
Dalam perkembangan beradaban modern, produksi. Seperti pada tahun 1930 di Detroit,
masyarakat menuntut perbaikan kondisi Mich. kontaminasi ginger jake oleh Tri-o-kresil,
kesehatan dan kehidupan, diantaranya mengakibatkan neurotksis, telah
makanan bergizi, mutu kesehatan yang tinggi, mengakibatkan keracunan syaraf pada 16 ribu
pakaian, transportasi. Untuk memenuhi tujuan penduduk.
ini, berbagai jenis bahan kimia harus Di London, pada tahun 1952, terjadi
diproduksi dan digunakan, banyak diantaranya peningkatan jumlah kematian penduduk akibat
dalam jumlah besar. Diperkirakan berribu-ribu penyakit jantung dan paru-paru. Hal ini
bahan kimia telah diproduksi secara komersial disebabkan oleh kontaminasi udara oleh
baik di negara-negara industri maupun di Belerang dioksida dan partikel tersuspensi,
negara berkembang. Melalui berbagai cara yang merupakan limbah buangan pabrik di
bahan kimia ini kontak dengan penduduk, dari Ingris pada saat itu.
terlibatnya manusia pada proses produksi,
Penyakit Minamata di Jepang pada tahun 1950-
distribusi ke konsumen, dan terakhir pada
an diakibatkan karena pembuangan limbah
tingkat pemakai.
industri yang mengandung metil merkuri ke
Meningkatnya jumlah penduduk dunia teluk Minamata, yang mengakibatkan ikan di
menuntut, salah satunya meningkatnya jumlah teluk tersebut terkontaminasi oleh metil
produksi pangan. Dalam hal ini diperlukan merkuri. Ikan terkontaminasi ini dikonsumsi
bahan kimia, seperti pupuk, pestisida,rebisida. oleh penduduk disekitar teluk, mengakibatkan
Pengantar Toksikologi 13
deposisi (pengendapan) metil merkuri di dalam Karena banyaknya orang yang terpejan dengan
tubuh. Metil merkuri adalah senyawa toksik bahan-bahan kimia ini, maka kita harus
yang mengakibatkan penyakit neurologik berat, berupaya mencari pengendalian yang tepat
salah satunya mengakibatkan kebutaan. sebelum terjadi kerusakan yang hebat. Karena
itu, bila mungkin, ahli toksikologi modern harus
Pada akhir 1950-an sampai awal tahun 1960-an,
mencoba mengidentifikasikan berbagai
di Eropa Barat terjadi kasus keracunan yang
indikator pejanan dan tanda efeknya terhadap
dikenal dengan kasus Talidomid. Talidomid
kesehatan yang dini dan reversibel. Hal ini
adalah senyawa kimia yang pertama disintesa
penting untuk menentukan ketentuan
untuk obat menekan rasa mual, muntah.
keputusan, pada saat yang tepat untuk
Karena efeknya tersebut pada waktu itu banyak
melindungi kesehatan masyarakat baik sebagai
diresepkan pada ibu-ibu hamil, dengan tujuan
individu yang bekerja maupun masyasakat
menekan mual-mutah yang sering muncul pada
yang terpejan. Pencapaian di bidang ini telah
trimester pertama pada kehamilan. Efek
terbukti dapat membantu para mengambil
samping yang muncul dari pemakaian ini
keputusan (pemerintah) yang
adalah terlahir janin dengan pertumbuhan
bertanggungjawab dalam menjalankan
organ tubuh yang tidak lengkap, belakangan
surveilan medik yang sesuai pada pekerja atau
diketahui bahwa salah satu dari bentuk rasemat
masyarakat yang terpejan. Contoh yang
Talidomid ini memberikan efek menghambat
menonjol adalah penggunaan penghambat
tertumbuhan organ tubuh pada janin di masa
kolinesterase sebagai indikator pejanan
kandungan.
pestisida organofosfat dan berbagai parameter
Salah satu contoh, kasus pencemaran biokimia untuk memantau pejanan timbal.
lingkungan di Indonesia akibat proses produksi Menggunakan indikator biologi seperti jenis
adalah kasus teluk Buyat. Sampai saat ini ikan tertentu untuk memantau tingkat cemaran
masih kontropersial didiskusikan. limbah cair insdustri sebelum dinyatakan aman
Kejadian-kejadian di atas dan peristiwa tragis untuk dilepaskan ke lingkungan. ”Petanda
keracunan masif lainnya telah menghasilkan biologik” semacam itu dimaksudkan untuk
program pengujian yang lebih intensif, yang mengukur pejanan terhadap toksikan atau
telah mengungkapkan beragamnya sifat dan efeknya di samping untuk mendeteksi
sasaran efek toksik. Pada gilirannya ini kelompok masyarakat yang retan.
menuntut lebih banyak penelitian pada hewan, Kemajuan yang dicapai dalam bidang biokimia
lebih banyak indikator toksisitas, persyaratan dan toksikokinetik, toksikologi genetika,
yang lebih ketat sebelum suatu bahan kimia imunotoksikologi, morfologik pada tingkat
baru dapat dilepas pemakaiannya ke subsel, serta perkembangan ilmu
masyarakat, serta melakukan evaluasi dan biologimolekular berperan dalam memberikan
pemantauan efek toksik senyawa kimia yang pengertian yang lebih baik tentang sifat,
telah beredar dan dimanfaatkan oleh tempat, dan cara kerja berbagai toksikan.
masyarakat. Oleh karena itu, ada kebutuhan Misalnya perkembangan bidang ilmu tersebut
untuk mempermudah tugas penilaian dapat memberikan berbagai metode uji
toksikologik atas begitu banyak bahan kimia, toksikologi secara invitro, dimana target uji
dimana prosedur pengujian toksisitasnya langsung pada tingkat sel, seperti uji senyawa
menjadi semakin komplek. Untuk memenuhi yang mengakibatkan kerusakan sel hati
kebutuhan ini, beberapa kreteria telah diajukan ”hepato toksik” dapat dilakukan langsung pada
dan dipakai untuk memilih menurut kultur sel hati secara invitro, atau uji toksikan
prioritasnya bahan kimia yang akan diuji. yang mempunyai sifat sebagai karsinogen juga
Disamping itu, ”sistem penilaian berlapis” dapat dilakukan pada kultur sel normal, disini
memungkinkan keputusan dibuat pada dilihat tingkat pertumbuhan sel dan perubahan
berbagai tahap pengujian toksikologik, DNA yang dialamai oleh sel akiat pejanan
sehingga dapat dihindarkan penelitian yang toksikan uji. Banyak lagi metode uji invitro
tidak perlu. Prosedur ini sangat berguna dalam yang sangat bermanfaat dalam menunjang
pengujian karsinogenisitas, mutagenisitas, dan perkembangan ilmu toksikologi itu sendiri.
imunotoksisitas karena besarnya biaya yang
terlibat dan banyaknya sistem uji yang tersedia.
Pengantar Toksikologi 14
Salah satu wujud perlindungan kesehatan prikemanusiaan, maka lebih sering digunakan
masyarakat, ahli toksikologi akan selalu terlibat organ terisolasi, jaringan biakan, sel, dan
dalam menentukan batas pejanan yang aman bentuk-bentuk kehidupan yang lebih rendah.
atau penilaian resiko dari pejanan. Batas Sistem ini memiliki banyak keuntungan, seperti
pejanan yang aman mencangkup ”asupan pengujian yang lebih cepat dan lebih murah,
(intake) harian yang diperbolehkan, dan ”nilia miningkatkan keragaman penelitian
ambang batas” dari toksikan yang masih dapat terutamanya yang berkaitan dengan
ditolerir, sedangkan penilaian resiko digunakan mekanisme keracunan. Dengan meningkatnya
dalam hubungan dengan efek bahan yang tuntutan ini akan mendorong perbaikan
diketahui tidak berrabang batas atau ambang prosedur pengujian yang lebih sederhana dan
batasnya tak dapat ditentukan. Penentuan ini handal, seperti misal pengujian karsinogen “uji
merupakan penelitian menyeluruh tentang sifat kanker”, uji mutagenesis, menggunakan
toksik, pembuktian dosis yang aman, “petanda biologik” (biomarker) yaitu kultur sel
penentuan hubungan dosis-efek dan dosis- kanker.
respon, serta penelitian toksokinetik,
Mingkatnya kebutuhan akan uji toksikologik,
biotransformasi.
namun pada kenyataannya terdapat
Meluasnya bidang cakupan dan makin keterbatasan akan fasilitas dan sumber daya
banyaknya subdisiplin toksikologi seperti manusia yang memenuhi syarat, Oleh sebab itu
digambarkan di atas memberikan gambaran maka data toksisitas yang dihasilkan dimana
tersendiri tentang kemajuan akhir dalam saja sebaiknya dapat diterima secara
toksikologi. international. Agar data-data tersebut dapat
diterima secara umum, kama data tersebut
2.5. Prospek Masa Depan
harus memenuhi standar tertentu. Untuk itu
Kemajuan di bidang bioteknologi pertanian, lembaga terkemuka dunia mengeluarkan
telah terbukti memberikan bebagai kemajuan standar seperti yang dikeluarkan oleh Lembaga
jika dibandingkan pertanian konvensional. pengawas obat dan makanan Amerika (FDA)
Melalui rekayasa genetika pada tanaman mengeluarkan “Good Laboratory Practice” ,
pertanian telah terbukti diperoleh bibit unggul, dimana standar ini dapat diterima secara
yang dibandingkan dengan pertanian international.
konvensional sangat sedikit membutuhkan
Pada akhirnya, ahli toksikologi harus terus
tanah, merupakan andalan dalam
memperbaiki prosedur uji untuk mengurangi
meningkatkan pasokan makanan kita. Kemanan
hasil positif palsu dan negatif palsu, dan terus
makanan semacam ini membutuhkan evaluasi
melakukan penelitian yang dirancang untuk
keamanan yang memadai.
meningkatkan pemahaman yang lebih baik
Bersama dengan ilmu-ilmu lain, toksikologi akan pentingnya efek toksik sehingga penilaian
dapat menyediakan bahan kimia alternatif yang keamanan/resiko berbagai tokson dapt
lebih aman untuk pertanian, industri, dan dilakukan dengan hasil lebih memuaskan.
kebutuhan konsumen melalui penentuan Bahan Bacaan:
hubungan strukter-toksisitas. Pengurangan 1. Lu, F.C., 1995, Toksikologi Dasar, Asas,
sifat toksik mungkin dapat dicapai dengan Organ Sasaran, dan Penilaian Resiko,
mengubah toksisitas sasaran atau dengan Nugroho, E. (terj.), UI Press, Jakarta
mengubah sifat toksokinetiknya. Toksikologi 2. Loomis, T.A., 1978, Toksikologi Dasar,
juga berperan dalam pengembangan obat baru, Donatus, A. (terj.) IKIP Semarang Press,
sudah menjadi prasat dalam pengembangan Semarang
obat baru harus dibarengi baik uji toksisitas 3. Ariens,E.J., Mutschler,E., Simonis,A.M.,
akut maupun toksisitas krinis, dengan 1985, Toksikologi Umum, Pengantar,
persyaratan uji yang ketat. Penilaian tentang Wattimena,Y.R.(terj.), Gadjah Mada
keamanannya merupakan tantangan dang University Press,Yogyakarta.
tunggung jawab toksikologi.
4. Ling, L.J., 2000, Toxikology Secrets, Hanley
Karena imbauan masyarakat untuk mengurangi & Belfus, Inc. Philadelphia
penggunaan hewan coba dengan alasan
Pengantar Toksikologi 15
BAB III
FASE KERJA TOKSIK
Dua aspek yang perlu diperhatikan dalam merupakan hasil sejumlah besar proses biologi
menelaah interaksi senobitika dengan yang komplek. Secara umum kerja toksik dapat
organisme hidup yaitu: kerja senobiotika pada digambarkan dalam rantai kerja yang terdiri
organisme dan reaksi atau efek yang dari: fase eksposisi, toksokinetik dan fase
ditimbulkan. Kerja toksik pada umumnya toksodinamik (lihat. Gam. 3.1).
I II III
Zat aktif Interaksi
Zat aktif
- Bentuk - Adsorpsi tersedia untuk tokson-
tersedia untuk
farmasetik memberikan reseptor
diabsorpsi - Distribusi
Kontak/ hancur efek dalam organ
Efek
Penggunaa - efektor
- Zat aktif Ketersediaan Ketersediaa
melarut Metabolism n biologik
Farmasetik
e
Ekskresi
Fase: Fase: Fase:
Eksposisi Toksokinetik Toksodinamik
ke m
iv km
D p
Ap Am
ku p
Up
) (e )
k m D ivp − ke p t − ke mt konsentrasinya seperti yang tertulis dalam
Am (t ) = −e (3.4)
(k em − ke p persamaan (3). Tranformasi persamaan
tersebut ke daerah Laplace memberikan
Banyak xenobiotika di dalam tubuh tidak persamaan berikut ini:
mengikuti model satu kompartemen, sehingga np αi
[ p](s ) = D p ∑
iv
( ) (3.5)
p
dalam melakukan analisis matematik metabolit
i =1 s + λi p
kinetik xenobiotika seperti ini akan sangat
komplek. Masalah ini akan lebih mudah
Menurut persamaan (3.1), maka profil konsentrasi metabolit primer adalah:
[m]( s) = I m ( s) fd m ( s) (3.8)
np αi p n m αi
[m](s) = F p_m CL p Ψ p_m (s) D ivp ∑ (
s + λi ) ∑ s +
m
λ ( )
(3.9)
i =1
p i =1 im
10 10
Konsentrasi (mg/ml)
Konsentrasi (mg/ml)
0,1 0,1
0,01 0,01
0,001 0,001
0 60 120 180 240 0 120 240 360 480 600 720
Fase Distribusi
Waktu (min) Waktu (min)
Gambar 3.2: Kurva konsentrasi-waktu xenobiotika A (kiri) dengan metabolitnya B (kanan) mengikuti
hukum kinetika orde ke pertama.
A setelah intravenus, profil konsentrasinya mengikuti model disposisi dua-kompartemen,
dimana setelah injeksi A sangat cepat terdistribusi (fase distribusi), yang ditandai dengan
penurunan konsentrasi yang sangat cepat, kemudian diikuti dengan fase elminasi, pada saat
ini terjadi kesetimbangan kecepatan trasport antara kedua kompartemen. Waktu paruh (t½)
fase eliminasi biasanya digunakan oleh toksikolog forensik untuk menghitung/meraka kapan
xenobiotika ”drug” pada waktu awal ”initial time” pemakaian.
Dari persamaan di atas tampak bahwa untuk dalam clearance dengan tetapan laju eliminasi
laju eliminasi orde ke pertama, t½ adalah pada fase terminal (λz),
konstan. Tanpa perlu memperhatikan berapa
jumlah atau konsentrasi xenobiotika pada V ß = Varea = CL (3.13)
λz
keadaan awal, maka waktu yang diperlukan
untuk berkurang menjadi separuhnya adalah Volume distribusi area dipengaruhi oleh laju
konstan eliminasi obat pada fase terminal dan clearance
total obat dari dalam tubuh. Perubahan ini
Volume distribusi (Vd) adalah volume virtual,
mungkin diakibat oleh perubahan fungsi organ
dimana kelihatannya suatu xenobiotika
tubuh (ginjal, hati). Sedangkan volume
Fase Kerja Toksik 24
distribusi pada keadaan tunak tidak oksidasi membentuk bentuk bromobenzen
dipengaruhi perubahan eliminasi obat. epoksid. Bromobenzen epoksid akan terikat
secara kovalen pada makromlekul jaringan hati
dan mengakibatkan nekrosis hati.
Oksidasi Konjugasi
Reduksi dengan:
Hidrolisis - asam glukoronat
- sulfat
- asetat
l t ti
Gabar 3.3: Proses dan reaksi penting dalam biotransformasi
menghasilkan suatu gugus fungsi, yang
3.6.1. Reaksi Fase I
selanjutnya pada fase ke II akan terkonjugasi
Reaksi fase I ini juga disebut dengan reaksi
a. Reaksi oksidasi
fungsionalisasi, sebab melalui reaksi fase ini
(oksidasi, reduksi atau hidrolisis)
Fase Kerja Toksik 25
Reaksi oksidasi mempunyai peranan penting substrat (R-H) menjadi R-OH begitu juga
pada biotransformasi, khususnya reaksi-reaksi oksidasi CYP-450Fe3+ .
yang melibatkan sistem enzim oksidase,
Substrat xenobiotika bereaksi dengan bentuk
monooksigenase dan dioksigenase. Oksidase
teroksidasi CYP-450Fe3+ membentuk komplek
mengoksidasi melalui masuknya oksigen
enzim-subtrat. Sitokrom P-450 reduktase
(elektron). Melalui mono-oksigenase akan
mendapatkan satu elektron dari NADPH, yang
dimasukkan satu atom oksigen ke dalam
akan mereduksi komplek dari CYP-450Fe3+—
xenobiotika dan molekul oksigen yang lainnya
xenobiotika. Bentuk reduksi dari komplek CYP-
akan direduksi menjadi air. Berbeda dengan
450Fe2+—xenobiotika bereaksi dengan molekul
dioksigenase, kedua atom oksigen akan
oksigen dan kemudian mendapatkan elektron
dimasukkan ke dalam xenobiotika. Sistem
yang ke dua dari NADPH, yang diperoleh dari
enzim yang yang mengkatalisis rekasi
flavoprotein reduktase yang sama, membentuk
oksigenase ini memerlukan sistem sitokrom P-
species oksigen terakivasi. Langkah terakhir
450 dan NADPH-sitokrom P-450 reduktase,
satu atom oksigen terlepas sebagai H2O dan
NADPH dan molekul oksigen.
atom oksigen yang lain ditransfer ke dalam
Oksidasi pada sitokrom P-450 sangat substrat dan bentuk teroksidasi CYP-450Fe3+
memegang peranan penting dalam terregenerasi.
biotransformasi xenobiotika. Sitokrom P-450 Sistem enzim CYP-450 monooksigenase
adalah hemoprotein dengan suatu kharakter mengkata-lisis reaksi seperti berikut (I:
puncak absorpsi dari bentuk terreduksi CO- inaktivasi efek toksik, A: aktivasi efek toksik) :
kompleknya pada panjang gelombang 450 nm.
Enzim sitokrom P-450 terletak di retikulum 1. Hidroksilasi dari rantai karbon dan alkilen:
endoplasmik dari beberapa jaringan. Sistem R-CH2-CH2-CH3 → R-CH2-CH2-CH2-OH atau R-
enzim yang mengkatalisis reaksi ini dikenal CH2-CHOH-CH3
dengan mikrosomal oksidasi fungsi campur contoh:
I : Butan → Butanol
(microsomal mixed-function oxidase, MFO).
Etilbenzol → Fentilbenzol
Reaksi oksidase multi level ini digambarkan
Tetrahidrokanabinol (THC) → 11-OH-THC
secara skematis pada gambar 3.4.
A: Hexan → 2,6-Hexandiol (→ Hexandion)
R-OH 2. Hidroksilasi dari aromatik menjadi fenol
I: Fenitoin → Hidroksifenition
Fe3+ R-H
F e 3+
OH 3. Hidroksilasi alkilamin
Fe3+
R
. I: Imipramin → Desimipramin
IOI
RH
F e 3+ Diazepam → Nordiazepam
H2O NADPH + H+ NADPH + H+ RH Lidokain → Monoetilglisinsilidid
Fp Cocain → Norcocain
CYP b5
e e A: Dimetilnitroamin → Metilnitrosoamin
Fe 2+ 4. Hidroksilasi dari alkileter, alkiltiol
RH R-CH2O(S)-CH3 → R-CH2(s)OH + HCHO
+ 2 H*
I : Papaverin → O-Desmetilpapaverin
Fe3+ A: Kodein → Morphin
O22- O2
RH
Fe3+ Fe2+
5. Epoksidasi dari alifatis atau aromatis rantai
O2- O2
ganda
RH RH O
RCH=CHR RHC CHR
Gambar 3.4. Sistem Sitokrom P-450 O
4.1. Pendahuluan
Secara umum tugas toksikolog forensik adalah
Toksikologi forensik adalah salah satu dari membantu penegak hukum khususnya dalam
cabang ilmu forensik. Menurut Saferstein yang melakukan analisis racun baik kualitatif
dimaksud dengan Forensic Science adalah ”the maupun kuantitatif dan kemudian
application of science to low”, maka secara menerjemahkan hasil analisis ke dalam suatu
umum ilmu forensik (forensik sain) dapat laporan (surat, surat keterangan ahli atau saksi
dimengerti sebagai aplikasi atau pemanfaatan ahli), sebagai bukti dalam tindak kriminal
ilmu pengetahuan tertentu untuk penegakan (forensik) di pengadilan. Lebih jelasnya
hukum dan peradilan. toksikologi forensik mencangkup terapan ilmu
alam dalam analisis racun sebagi bukti dalam
Guna lebih memahami pengertian dan ruang
tindak kriminal, dengan tujuan mendeteksi dan
lingkup kerja toksikologi forensik, maka akan
mengidentifikasi konsentrasi dari zat racun dan
lebih baik sebelumnya jika lebih mengenal apa
metabolitnya dari cairan biologis dan akhirnya
itu bidang ilmu toksikologi. Ilmu toksikologi
menginterpretasikan temuan analisis dalam
adalah ilmu yang menelaah tentang kerja dan
suatu argumentasi tentang penyebab
efek berbahaya zat kimia atau racun terhadap
keracunan dari suatu kasus. Menurut
mekanisme biologis suatu organisme. Racun
masyarakat toksikologi forensik amerika
adalah senyawa yang berpotensi memberikan
“society of forensic toxicologist, inc. SOFT”
efek yang berbahaya terhadap organisme. Sifat
bidang kerja toksikologi forensik meliputi:
racun dari suatu senyawa ditentukan oleh:
- analisis dan mengevaluasi racun penyebab
dosis, konsentrasi racun di reseptor, sifat fisiko
kematian,
kimis toksikan tersebut, kondisi bioorganisme
- analisis ada/tidaknya alkohol, obat terlarang
atau sistem bioorganisme, paparan terhadap
di dalam cairan tubuh atau napas, yang dapat
organisme dan bentuk efek yang ditimbulkan.
mengakibatkan perubahan prilaku
Tosikologi forensik menekunkan diri pada (menurunnya kemampuan mengendarai
aplikasi atau pemanfaatan ilmu toksikologi kendaraan bermotor di jalan raya, tindak
untuk kepentingan peradilan. Kerja utama dari kekerasan dan kejahatan, penggunaan
toksikologi forensik adalah melakukan analisis dooping),
kualitatif maupun kuantitatif dari racun dari - analisis obat terlarang di darah dan urin pada
bukti fisik dan menerjemahkan temuan kasus penyalahgunaan narkotika,
analisisnya ke dalam ungkapan apakah ada psikotropika dan obat terlarang lainnya.
atau tidaknya racun yang terlibat dalam tindak
Tujuan lain dari analisis toksikologi forensik
kriminal, yang dituduhkan, sebagai bukti dalam
adalah membuat suatu rekaan rekostruksi
tindak kriminal (forensik) di pengadilan. Hasil
suatu peristiwa yang terjadi, sampai sejauh
analisis dan interpretasi temuan analisisnya ini
mana obat atau racun tersebut dapat
akan dimuat ke dalam suatu laporan yang
mengakibatkan perubahan prilaku
sesuai dengan hukum dan perundangan-
(menurunnya kemampuan mengendarai, yang
undangan. Menurut Hukum Acara Pidana
dapat mengakibatkan kecelakaan yang fatal,
(KUHAP), laporan ini dapat disebut dengan
atau tindak kekerasan dan kejahatan).
Surat Keterangan Ahli atau Surat Keterangan.
Jadi toksikologi forensik dapat dimengerti 4.2 Bilamana memerlukan pemeriksaan
sebagai pemanfaatan ilmu tosikologi untuk toksikologik
keperluan penegakan hukum dan peradilan.
Dalam tabel berikut ini digambarkan kasus-
Toksikologi forensik merupakan ilmu terapan
kasus yang umumnya di negara maju
yang dalam praktisnya sangat didukung oleh
memerlukan pemeriksaan toksikologi forensik.
berbagai bidang ilmu dasar lainnya, seperti
Kasus-kasus tersebut dapat dikelompokkan ke
kimia analisis, biokimia, kimia instrumentasi,
dalam tiga kelompok besar yaitu:
farmakologi-toksikologi, farmakokinetik,
a) kematian akibat keracunan, yang meliputi:
biotransformasi.
kematian mendadak, kematian di penjara,
kematian pada kebakaran, dan kematian
Analisis Toksikologi Forensik 31
medis yang disebabkan oleh efek samping yang tidak memenuhi standar kesehatan
obat atau kesalahan penanganan medis, (kasus-kasus forensik farmasi).
b) kecelakaan fatal maupun tidak fatal, yang Dari sekian contoh kasus-kasus yang perlu
dapat mengancam keselamatan nyawa
dilakukan pemeriksaan toksikologik, lalu timbul
sendiri ataupun orang lain, yang umumnya
pertanyaan: Siapa yang memutuskan untuk
diakibatkan oleh pengaruh obat-obatan,
melakukan pemeriksaan tersebut dan siapa yang
alkohol, atau pun narkoba,
berkompeten untuk melakukan pemeriksaan
c) penyalahgunaan narkoba dan kasus-kasus tersebut? Sudah barang tentu yang memutuskan
keracunan yang terkait dengan akibat
untuk melakukan adalah tim penyidik dan yang
pemakaian obat, makanan, kosmetika, alat
melakukan adalah seorang yang berkompeten
kesehatan, dan bahan berbahaya lainnya,
yaitu “toksikolog forensik”. Lalu dimana lembaga
toksikolog forensik tersebut di negara kita?
Tabel 4.1. Kasus-kasus toksikologi forensik yang melibatkan
Jenis Kasus Pertanyaan yang muncul Litigasi
Kematian yang tidak wajar Apakah ada keterlibatan obat atau Kriminal: Pembunuhan
(mendadak) racun sebagai penyebab kematiannya? Sipil: klaim tanggungan asuransi,
tuntunan kepada fabrik farmasi atau kimia
Kematian di penjara Kecelakaan, pembunuhan yang Kriminal: pembunuhan
melibatkan racun atau obat terlarang? Sipil: gugatan tanggungan dan
konpensasi terhadap pemerintah
Kematian pada kebakaran Apakah ada unsur penghilangan jejak Kriminal: pembunuhan
pembunuhan? Sipil: klaim tanggungan asuransi
Apa penyebab kematian: CO, racun,
kecelakaan, atau pembunuhan?
Kematian atau timbulnya efek Berapa konsentrasi dari obat dan Malpraktek kedokteran, gugatan terhadap
samping obat berbahaya metabolitnya? fabrik farmasi
akibat salah pengobatan Apakah ada interaksi obat?
Kematian yang tidak wajar di Apakah pengobatannya tepat? Klaim Malpraktek, tindak kriminal,
rumah sakit Kesalahan terapi? pemeriksaan oleh komite ikatan profesi
kedokteran (”IDI”)
Kecelakaan yang fatal di Apakah ada keterlibatan racun, alkohol, Gugatan terhadap ”employer”,
tempat kerja, sakit akibat atau obat-obatan? Memperkerjakan kembali
tempat kerja, pemecatan Apakah kematian akibat ”human eror”?
Apakah sakit tsb diakibatkan oleh
senyawa kimia di tempat
kerja?Pemecatan akibat terlibat
penyalahgunaan Narkoba?
Kecelakan fatal dalam Meyebabkan kematian? Kriminal: Pembunuhan, kecelakaan
menyemudi Adakah keterlibatan alkohol, obat- bermotor
obatan atau Narkoba? Sipil: klaim gugatan asuransi
Kecelakaan, atau pembunuhan?
Kecelakaan tidak fatal atau Apakah kesalahan pengemudi? Kriminal: Larangan Mengemudi dibawah
mengemudi dibawah Mengemudi dibawah pengaruh obat- pengaruh Obat-obatan atau Narkona
pengaruh obat-obatan obatan atau Narkoba? Sipil: gugatan pencabutan atau
pengangguhan SIM
Penyalahgunaan Narkoba Penyalahgunaan atau pasient yang Kriminal:
sedang mengalami terapi rehabilitasi Sipil: rehabilitasi
narkoba
Farmaseutikal dan Obat Identifikasi bentuk sediaan, kandungan Kriminal: pengedaran obat ilegal.
palsu, atau tidak memenuhi sediaan obat, penggunaan obat palsu. Sipil: tuntutan penggunan obat palsu
syarat standar ”Forensik terhadap dokter atau yang terkait
Farmasi”
Sumber: Finkle, B.S., (1982), Progress in Forensic Toxicology: Beyond Analytical Chemistry, J. Anal. Tox. (6):
57-61
4.3. Langkah-langkah analisis toksikologi Secara umum tugas analisis toksikolog
forensik forensik (klinik) dalam melakukan analisis
Analisis Toksikologi Forensik 32
dapat dikelompokkan ke dalam tiga tahap yaitu: Spesimen untuk analisis toksikologi forensik
1) penyiapan sampel “sample preparation”, 2) biasanya diterok oleh dokter, misalnya pada
analisis meliputi uji penapisan “screening test” kasus kematian tidak wajar spesimen
atau dikenal juga dengan “general unknown dikumpulkan oleh dokter forensik pada saat
test” dan uji konfirmasi yang meliputi uji melakukan otopsi. Spesimen dapat berupa
identifikasi dan kuantifikasi, 3) langkah terakhir cairan biologis, jaringan, organ tubuh. Dalam
adalah interpretasi temuan analisis dan pengumpulan spesimen dokter forensik
penulisan laporan analisis. memberikan label pada masing-masing
bungkus/wadah dan menyegelnya. Label
Berbeda dengan kimia analisis lainnya (seperti:
seharusnya dilengkapi dengan informasi:
analisis senyawa obat dan makanan, analisis
nomer indentitas, nama korban, tanggal/waktu
kimia klinis) pada analisis toksikologi forensik
otopsi, nama spesimen beserta jumlahnya.
pada umumnya analit (racun) yang menjadi
Pengiriman dan penyerahan spesimen harus
target analisis, tidak diketahui dengan pasti
dilengkapi dengan surat berita acara menyeran
sebelum dilakukan analisis. Tidak sering hal ini
spesimen, yang ditandatangani oleh dokter
menjadi hambatan dalam penyelenggaraan
forensik. Toksikolog forensik yang menerima
analisis toksikologi forensik, karena seperti
spesimen kemudian memberikan dokter
diketahui saat ini terdapat ribuan atau bahkan
forensik surat tanda terima, kemudian
jutaan senyawa kimia yang mungkin menjadi
menyimpan sampel/spesimen dalam lemari
target analisis. Untuk mempersempit peluang
pendingin “freezer” dan menguncinya sampai
dari target analisis, biasanya target dapat digali
analisis dilakukan. Prosedur ini dilakukan
dari informasi penyebab kasus forensik
bertujuan untuk memberikan rantai
(keracunan, kematian tidak wajar akibat
perlindungan/pengamanan spesimen (chain of
keracunan, tindak kekerasan dibawah
custody).
pengaruh obat-obatan), yang dapat diperoleh
dari laporan pemeriksaan di tempat kejadian Beberapa hal yang perlu diperhitungkan dalam
perkara (TKP), atau dari berita acara penyidikan tahapan penyiapan sampel adalah: jenis dan
oleh polisi penyidik. sifat biologis spesimen, fisikokimia dari
spesimen, serta tujuan analisis. Dengan
Sangat sering dalam analisis toksikologi
demikian akan dapat merancang atau memilih
forensik tidak diketemukan senyawa induk,
metode penanganan sampel, jumlah sampel
melainkan metabolitnya. Sehingga dalam
yang akan digunakan, serta memilih metode
melakukan analisis toksikologi forensik,
analisis yang tepat. Penanganan sampel perlu
senyawa matabolit juga merupakan target
mendapat perhatian khusus, karena sebagian
analisis.
besar sampel adalah materi biologis, sehingga
Sampel dari toksikologi forensik pada sedapat mungkin mencegah terjadinya
umumnya adalah spesimen biologi seperti: penguraian dari analit.
cairan biologis (darah, urin, air ludah), jaringan
Pemilihan metode ekstraksi ditentukan juga
biologis atau organ tubuh. Preparasi sampel
oleh analisis yang akan dilakukan, misal pada
adalah salah satu faktor penentu keberhasilan
uji penapisan sering dilakukan ekstraksi satu
analisis toksikologi forensik disamping
tahap, dimana pada tahap ini diharapkan
kehadalan penguasaan metode analisis
semua analit dapat terekstraksi. Bahkan pada
instrumentasi. Berbeda dengan analisis kimia
uji penapisan menggunakan teknik
lainnya, hasil indentifikasi dan kuantifikasi dari
“immunoassay” sampel tidak perlu diekstraksi
analit bukan merupakan tujuan akhir dari
dengan pelarut tertentu.
analisis toksikologi forensik. Seorang
toksikolog forensik dituntut harus mampu Sampel urin pada umumnya dapat langsung
menerjemahkan apakah analit (toksikan) yang dilakukan uji penapisan dengan menggunakan
diketemukan dengan kadar tertentu dapat teknik immunoassay. Namun tidak jarang harus
dikatakan sebagai penyebab keracunan (pada mendapatkan perlakuan awal, seperti
kasus kematian). pengaturan pH dan sentrifuga, guna
menghilangkan kekeruhan. Pemisahan sel
4.3.1. Penyiapan Sampel darah dan serum sangat diperlukan pada
persiapan sebelum dilakukan uji penapisan
Analisis Toksikologi Forensik 33
pada darah. Serum pada umumnya dapat 4.3.2. Uji Penapisan “Screening test”
langsung dilakukan uji penapisan
Uji penapisan untuk menapis dan mengenali
menggunakan teknik immunoassay. Tidak
golongan senyawa (analit) dalam sampel. Disini
jarang sampel darah, yang diterima sudah
analit digolongkan berdasarkan baik sifat
mengalami hemolisis atau menggupal, dalam
fisikokimia, sifat kimia maupun efek
hal ini darah dilarutkan dengan metanol, dan
farmakologi yang ditimbulkan. Obat narkotika
kemudian disentrifuga, sepernatannya dapat
dan psikotropika secara umum dalam uji
langsung dilakukan uji penapisan
penapisan dikelompokkan menjadi golongan
menggunakan teknik immunoassay.
opiat, kokain, kannabinoid, turunan amfetamin,
Ekstraksi satu tahap sangat diperlukan apabila turunan benzodiazepin, golongan senyawa anti
uji penapisan tidak menggunakan teknik dipresan tri-siklik, turunan asam barbiturat,
immunoassay, misal menggunakan turunan metadon. Pengelompokan ini
kromatografi lapis tipis dengan reaksi berdasarkan struktur inti molekulnya. Sebagai
penampak bercak tertentu. Atau juga ekstraksi contoh, disini diambil senyawa golongan opiat,
bertingkat “metode Stas-Otto-Gang” untuk dimana senyawa ini memiliki struktur dasar
melalukan pemisahan analit berdasarkan sifat morfin, beberapa senyawa yang memiliki
asam-basanya. struktur dasar morfin seperti, heroin, mono-
asetil morfin, morfin, morfin-3-glukuronida,
Metode ekstraksi dapat berupa ekstraksi cair-
morfin-6-glukuronida, asetilkodein, kodein,
cair, menggunakan dua pelarut yang terpisah,
kodein-6-glukuronida, dihidrokodein serta
atau ekstraksi cair-padat. Prinsip dasar dari
metabolitnya, serta senyawa turunan opiat
pemisahan ekstraksi cair-cair berdasarkan
lainnya yang mempunyai inti morfin.
koefisien partisi dari analit pada kedua pelarut
atau berdasarkan kelarutan analit pada kedua Uji penapisan seharusnya dapat
pelarut tersebut. Pada ekstraksi cair-padat mengidentifikasi golongan analit dengan
analit dilewatkan pada kolom yang berisi derajat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi,
adsorben fase padat (SPE, Si-Gel C-18, relatif murah dan pelaksanaannya relatif cepat.
Extrelut®, Bund Elut Certify®, dll), kemudian Terdapat teknik uji penapisan yaitu: a)
dielusi dengan pelarut tertentu, biasanya diikuti kromatografi lapis tipis (KLT) yang
dengan modifikasi pH pelarut. dikombinasikan dengan reaksi warna, b) teknik
immunoassay. Teknik immunoassay umumnya
Penyiapan sampel yang baik sangat diperlukan
memiliki sifat reabilitas dan sensitifitas yang
pada uji pemastian “identifikasi dan
tinggi, serta dalam pengerjaannya memerlukan
kuantifikasi”, terutama pada teknik
waktu yang relatif singkat, namun alat dan
kromatografi. Karena pada umumnya materi
bahan dari teknik ini semuanya harus diimpor,
biologik merupakan materik yang komplek,
sehingga teknik ini menjadi relatif tidak murah.
yang terdiri dari berbagai campuran baik
Dibandingkan dengan immunoassay, KLT
senyawa endogen maupun senyawa eksogen
relatif lebih murah, namun dalam
“xenobiotika”. Penyiapan sampel umumnya
pengerjaannya memerlukan waktu yang relatif
meliputi hidrolisis, ekstraski, dan pemurnian
lebih lama.
analit. Prosedur ini haruslah mempunyai
efesiensi dan selektifitas yang tinggi. a) teknik immunoassay
Perolehan kembali yang tinggi pada ekstraksi
Teknik immunoassay adalah teknik yang
adalah sangat penting untuk menyari semua
sangat umum digunakan dalam analisis obat
analit, sedangkan selektifitas yang tinggi
terlarang dalam materi biologi. Teknik ini
diperlukan untuk menjamin pengotor atau
menggunakan “anti-drug antibody” untuk
senyawa penggangu terpisahkan dari analit.
mengidentifikasi obat dan metabolitnya di
Pada analisis menggunakan GC/MS, penyiapan dalam sampel (materi biologik). Jika di dalam
sampel termasuk derivatisasi analit secara matrik terdapat obat dan metabolitnya (antigen-
kimia, seperi salilisasi, metilisasi, dll. target) maka dia akan berikatan dengan “anti-
Derivatisasi ini pada umumnya bertujuan untuk drug antibody”, namun jika tidak ada antigen-
meningkatkan volatilitas analit atau target maka “anti-drug antibody” akan
meningkatkan kepekaan analisis. berikatan dengan “antigen-penanda”. Terdapat
berbagai metode / teknik untuk mendeteksi
Analisis Toksikologi Forensik 34
ikatan antigen-antibodi ini, seperti “enzyme Uji ini bertujuan untuk memastikan identitas
linked immunoassay” (ELISA), enzyme analit dan menetapkan kadarnya. Konfirmatori
multiplied immunoassay technique (EMIT), test paling sedikit sesensitif dengan uji
fluorescence polarization immunoassay (FPIA), penapisan, namun harus lebih spesifik.
cloned enzyme-donor immunoassay (CEDIA), Umumnya uji pemastian menggunakan teknik
dan radio immunoassay (RIA). kromatografi yang dikombinasi dengan teknik
detektor lainnya, seperti: kromatografi gas -
Pemilihan teknik ini sangat tergantung pada
spektrofotometri massa (GC-MS), kromatografi
beban kerja (jumlah sampel per-hari) yang
cair kenerja tinggi (HPLC) dengan diode-array
ditangani oleh laboratorium toksikologi. Misal
detektor, kromatografi cair - spektrofotometri
dipasaran teknik ELISA atau EMIT terdapat
massa (LC-MS), KLT-Spektrofotodensitometri,
dalam bentuk single test maupun multi test.
dan teknik lainnya. Meningkatnya derajat
Untuk laboratorium toksikologi dengan beban
spesifisitas pada uji ini akan sangat
kerja yang kecil pemilihan teknik single test
memungkinkan mengenali identitas analit,
immunoassay akan lebih tepat ketimbang
sehingga dapat menentukan secara spesifik
teknik multi test, namun biaya analisa akan
toksikan yang ada.
menjadi lebih mahal.
Prinsip dasar uji konfirmasi dengan
Hasil dari immunoassay test ini dapat dijadikan
menggunakan teknik CG-MS adalah analit
sebagai bahan pertimbangan, bukan untuk
dipisahkan menggunakan gas kromatografi
menarik kesimpulan, karena kemungkinan
kemudian selanjutnya dipastikan identitasnya
antibodi yang digunakan dapat bereaksi
menggunakan teknik spektrfotometrimassa.
dengan berbagai senyawa yang memiliki baik
Sebelumnya analit diisolasi dari matrik
bentuk struktur molekul maupun bangun yang
biologik, kemudian jika perlu diderivatisasi.
hampir sama. Reaksi silang ini tentunya
Isolat akan dilewatkan ke kolom CG, dengan
memberikan hasil positif palsu. Obat batuk
perbedaan sifat fisikokima toksikan dan
yang mengandung pseudoefedrin akan
metabolitnya, maka dengan GC akan terjadi
memberi reaksi positif palsu terhadap test
pemisahan toksikan dari senyawa
immunoassay dari anti bodi- metamfetamin.
segolongannya atau metabolitnya. Pada
Oleh sebab itu hasil reaksi immunoassay
prisipnya pemisahan menggunakan GC, indeks
(screening test) harus dilakukan uji pemastian
retensi dari analit yang terpisah adalah sangat
(confirmatori test).
spesifik untuk senyawa tersebut, namun hal ini
b) kromatografi lapis tipis (KLT) belum cukup untuk tujuan analisis toksikologi
KLT adalah metode analitik yang relatif murah forensik. Analit yang terpisah akan memasuki
dan mudah pengerjaannya, namun KLT kurang spektrofotometri massa (MS), di sini
sensitif jika dibandungkan dengan teknik bergantung dari metode fragmentasi pada MS,
immunoassay. Untuk meningkatkan sensitifitas analit akan terfragmentasi menghasilkan pola
KLT sangat disarankan dalam analisis spektrum massa yang sangat kharakteristik
toksikologi forensik, uji penapisan dengan KLT untuk setiap senyawa. Pola fragmentasi
dilakukan paling sedikit lebih dari satu sistem (spetrum massa) ini merupakan sidik jari
pengembang dengan penampak noda yang molekular dari suatu senyawa. Dengan
berbeda. Dengan menggunakan memadukan data indeks retensi dan spektrum
spektrofotodensitometri analit yang telah massanya, maka identitas dari analit dapat
terpisah dengan KLT dapat dideteksi dikenali dan dipastikan.
spektrumnya (UV atau fluoresensi). Kombinasi Dengan teknik kombinasi HPLC-diode array
ini tentunya akan meningkatkan derajat detektor akan memungkinkan secara simultan
sensitifitas dan spesifisitas dari uji penapisan mengukur spektrum UV-Vis dari analit yang
dengan metode KLT. Secara simultan telah dipisahkan oleh kolom HPLC. Seperti
kombinasi ini dapat digunakan untuk uji pada metode GC-MS, dengan memadukan data
pemastian. indeks retensi dan spektrum UV-Vis analit,
maka dapat mengenali identitas analit.
4.3.3. Uji pemastian “confirmatory test”
Disamping melakukan uji indentifikasi
potensial positif analit (hasil uji penapisan),
Analisis Toksikologi Forensik 35
pada uji ini juga dilakukan penetapan kadar Heroin menurut UU no 22 tahun 1997 termasuk
dari analit. Data analisis kuantitatif analit akan narkotika golongan I, namun metabolitnya
sangat berguna bagi toksikolog forensik dalam (morfin) masuk ke dalam narkotika golongan II.
menginterpretasikan hasil analisis, dengan Dilain hal kodein (narkotika golongan III) di
kaitannya dalam menjawab pertanyaan- dalam tubuh akan sebagian termetabolisme
pertanyaan yang muncul baik dari penyidik menjadi morfin. Namun pada kenyataannya
maupun hakim sehubungan dengan kasus heroin illegal juga mengandung acetilkodein,
yang terkait. Misal analisis toksikologi forensik yang merupakan hasil asetilasi dari kodein,
ditegakkan bertujuan untuk memastikan sehingga dalam analisis toksikologi forensik
dugaan kasus kematian akibat keracunan atau pada pembuktian kasus penyalahgunaan
diracuni, pertanyaan-pertanyaan yang mungkin heroin ilegal akan mungkin diketemukan morfin
muncul pada kasus ini adalah: dan kodein. Menurut UU narkotika ini (pasal 84
- senyawa racun apa yang terlibat? dan 85), menyatakan bahwa penyalahgunaan
- berapa besar dosis yang digunakan? narkotika golongan I, II, dan III memiliki
- kapan paparan tersebut terjadi (kapan racun konsekuensi hukum yang berbeda, sehingga
tersebut mulai kontak dengan korban)? interpretasi temuan analisis toksikologi
- melalui jalur apa paparan tersebut terjadi forensik, khususnya dalam kaitan menjawab
(jalur oral, injeksi, inhalasi)? pertanyaan narkotika apa yang telah
dikonsumsi, adalah sangat mutlak dalam
Dalam praktis analisis menggunakan teknik
penegakan hukum.
GC-MS, LC-MS, atau HPLC-Diode array detektor
memerlukan biaya analisis yang relatif mahal Terdapat beberapa pertanyaan yang harus
ketimbang KLT-Spektrofotodensitometri. dijawab oleh toksikolog forensik dalam
Sehingga disarankan dalam perencanaan melakukan analisis:
pengadaan /pemilihan peralatan suatu a. Senyawa apa yang terlibat dalam tindak
laboratorium toksikologi seharusnya kriminal tersebut (senyawa apa yang
mempertimbangkan biaya operasional menyebabkan keracunan, menurunnya
penanganan sampel. Hal ini pada kenyataannya kemampuan mengendarai kendaraan dalam
sering menjadi faktor penghambat dalam berlalulintas, atau narkoba apa yang telah
penyelenggaraan laboratorium toksikologi. disalah gunakan)?
Karena pada kenyataanya telah diatur dalam b. Berapa besar dosisnya?
KUHAP, bahwa biaya yang ditimbulkan akibat c. Efek apa yang ditimbulkan?
pemeriksaan atau penyidikan dibebankan pada d. Kapan tubuh korban terpapar oleh senyawa
negara, namun pada kenyataanya sampai saat tersebut?
negara belum mampu memikul beban tersebut. e. Pertanyaan-pertanyaan tersebut dapat
terungkap dari hasil analisis toksikologi dan
4.4. Interpretasi temuan analisis didukung oleh penguasaan ilmu pendukung
Temuan analisis sendiri tidak mempunyai lainnya seperti farmakologi dan toksikologi,
makna yang berarti jika tidak dijelaskan makna biotransformasi, dan farmakokinetik.
dari temuan tersebut. Seorang toksikolog Data temuan hasil uji penapisan dapat
forensik berkewajiban menerjemahkan temuan dijadikan petunjuk bukan untuk menarik
tersebut berdasarkan kepakarannya ke dalam kesimpulan bahwa seseorang telah terpapar
suatu kalimat atau laporan, yang dapat atau menggunakan obat terlarang. Sedangkan
menjelaskan atau mampu menjawab hasil uji pemastian (confirmatory test) dapat
pertanyaan yang muncul berkaitan dengan dijadikan dasar untuk memastikan atau
permasalahan/kasus yang dituduhkan. menarik kesimpulan apakah sesorang telah
Berkaitan dengan analisis penyalahgunaan menggunakan obat terlarang yang dituduhkan.
obat-obatan terlarang, mengacu pada hukum Pernyataan ini terdengar sangatlah mudah,
yang berlaku di Indonesia (UU no 5 th 1997 namun pada praktisnya banyak faktor yang
tentang spikotropika dan UU no 22 th 1997 mempengaruhi.
tentang Narkotika), interpretasi temuan analisis Untuk lebih jelasnya disini akan diberikan
oleh seorang toksikolog forensik adalah suatu perumpamaan kasus, misal dari hasil uji
merupakan suatu keharusan (Wirasuta, 2005). penapisan menggunakan teknik immunoassay
Analisis Toksikologi Forensik 36
diperoleh dalam sampel darah dan urin penyalahgunaan narkotika, merupakan petujuk
tertuduh memberikan reaksi positif terhadap paparan melalui injeksi.
golongan opiat. Hasil ini tidak cukup untuk
Ditemukannya toksikan dalam konsentrasi
membuktikan (menuduh) terdakwa telah
yang cukup tinggi baik di saluran pencernaan
mengkonsumsi obat terlarang narkotika
maupun di darah, dapat dijadikan cukup bukti
golongan opiat, karena obat batuk
untuk menyatakan toksikan tersebut sebagai
dekstrometrofan mungkin memberikan reaksi
penyebab kematian. Seorang toksikolog
positif. Dilain hal senyawa golongan opiat
forensik dituntut juga dapat menerangkan
terdistribusi ke dalam golongan narkotika I
absorpsi toksikan dan transportasi/distribusi
sampai III, dimana menurut UU Narkotika,
melalui sirkulasi sistemik menuju organ-
penyalahgunaan golongan tersebut memiliki
jaringan sampai dapat menimbulkan efek yang
konsekuen hukum yang berbeda. Metabolit
fatal. Interpretasi ini diturunkan dari data
glukuronida dari morfin dan kodein tidak
konsentrasi toksikan baik di darah maupun di
dimasukkan ke dalam senyawa narkotika.
jaringan-jaringan.
Kenyataan ini akan membuat interpretasi
toksikologi forensik, yang hanya berdasarkan Hasil analisis urin biasanya kurang berarti
data hasil analisis uji penapisan, menjadi lebih dalam menentukan efek toksik/psikologi dari
komplek. suatu toksikan. Secara umum hasil analisis
urin menyatakan adanya paparan toksikan
Dilain hal banyak senyawa obat, dimana
sebelum kematian. Dari jumlah volume urin dan
metabolitnya memungkinkan memberi reaksi
konstelasi jumlah toksikan dan metabolitnya di
positif (reaksi silang) terhadap test anti-
dalam kantung kemih, dengan berdasarkan
amfetamin-antibodi. Senyawa obat tersebut
data laju eksresi toksikan dan metabolitnya,
antara lain: a) golongan obat bebas yang
maka dimungkinkan untuk menurunkan
digunakan sebagai dekongestan dan anoreksia,
informasi lamanya waktu paparan telah terjadi
seperti: efedrin, pseudoefedrin dan
sebelum kematian (Wirasuta 2004).
fenilpropanolamin; b) golongan keras (dengan
resep): benzofetamin, fenfluramine, Kebanyakan efek farmakologik/psikologi
mefentermin, fenmeterzine, dan fentermine; c) xenobiotika berhubungan dengan tingkat
obat / senyawa obat, dimana amfetamin atau konsentrasinya di darah dan tempat kerjanya
metamfetamin sebagai metabolitnya, seperti: (reseptor). Oleh sebab itu tingkat konsentrasi di
etilamfetamin, clobenzorex, mefenorex, darah adalah sebagai indikator penting dalam
dimetilamfetamin, dll (United Nation, 1995). mencari faktor penyebab kematian/keracunan.
Dalam menginterpretasikan tingkat konsentrasi
Pada interpretasi hasil analisis pada kasus
di dalam darah dan jaringan sebaiknya
kematian, seorang toksikolog forensik dituntut
memperhatikan tingkat efek spikologis yang
mampu menjawab pertanyaan spesifik seperti:
sebenarnya dan semua faktor yang
rute pemakaian toksikan, apakah konsentrasi
berpengaruh dari setiap tingkat konsentrasi
toksikan yang ditetapkan cukup sebagai
yang diperoleh dari spesimen. Interpretasi
menyebabkan kematian atau penyebab
tingkat konsentrasi dalam darah dan jaringan
keracunan. Penetapan rute pemakaian
dapat dibagi menjadi tiga katagori: normal atau
biasanya diperoleh dari analisis berbagai
terapeutik, toksik, dan lethal. Tingkat
spesimen, dimana pada umumnya konsentrasi
konsentrasi normal dinyatakan sebagai
toksikan yang lebih tinggi ditemukan di daerah
keadaan, dimana tidak menimbulkan efek
rute pemakaian. Jika ditemukan toksikan dalam
toksik pada organisme. Tingkat konsentrasi
jumlah besar di saluran pencernaan dan hati,
toksik berhubungan dengan gejala
maka dapat ditarik kesimpulan bahwa paparan
membahayankan nyawa, seperti: koma, kejang-
melalui jalur oral. Demikian juga apabila
kejang, kerusakan hati atau ginjal. Tingkat
konsentrasi yang tinggi ditemukan di paru-paru
konsentrasi kematian dinyatakan sebagai
atau pada organ viseral lainnya
konsentrasi yang dapat menyebabkan
mengindikasikan paparan melalui inhalasi.
kematian. Contoh: sianida pada konsentrasi
Bekas suntikan yang baru pada permukaan
yang tinggi (0,17-2,22 mg/l, diketemukan pada
tubuh (seperti telapak tangan, lengan, dll), yang
kematian akibat keracunan sianida), dinyatakan
ditemukan pada kasus kematian akibat
sebagai penyebab keracunan. Sedangkan pada
Analisis Toksikologi Forensik 37
konsentrasi yang sangat kecil (0,004 mg/l pada Melalui pengamatan ulang riwayat kasus,
orang sehat dan 0,006 mg/l pada perokok), memperhatikan semua faktor toksokinetik,
sianida berperan dalam pembentukan vitamin toksodinamik, dan dengan membandingkan
B12. Dalam jumlah kecil sianida juga hasil analisis dengan laporan kasus yang sama
diabsorpsi dan dibangkitkan selama merokok. dari beberapa pustaka atau pengalaman
Oleh sebab itu mendeteksi sianida di darah sendiri, seorang ahli toksikologi membuat
pada tingkat dibawah konsentrasi toksik, masih interpretasi akhir dari suatu kasus.
dapat ditolerir sebagai tanpa efek toksik.
Contoh-contoh di atas dengan jelas
Beberapa logam berat, seperti arsen, timbal,
memaparkan, bahwa hasil reaksi positif dengan
dan merkuri tidak diperlukan untuk fungsi
teknik immunoassay belum cukup bukti untuk
normal tubuh. Keberadaan logam tersebut
memastikan/menuduh seseorang telah
dibawah tingkat konsentrasi toksik
mengkonsumsi obat terlarang. Lebih lanjut
mengindikasikan bahwa korban telah terpapar
berikut ini diberikan ilustrasi kasus dan
logam berat akibat polusi lingkungan.
interpretasi dari hasil analisis toksikologi
Faktor-faktor yang mempengaruhi respon forensik yang lengkap:
individu terhadap tingkat konsentrasi toksik Contoh: Ilustrasi kasus toksikologi forensik
(seperti: usia, jenis kelamin/status hormonal, (data dikutif dari kasus yang masuk ke Institut
berat badan, status nutrisi, genetik, status of Legal Medicine of Goerg August University,
immunologi, kelainan patologik dan penyakit Göttingen, Germany):
bawaan, kelainan fungsi organ, sifat Berdasarkan Berita Acara Pemeriksaan dari
farmakokinetik dari toksikan) seharusnya juga penyidik dilaporkan telah diketemukan mayat di
dipertimbangkan dalam menginterpretasikan kamar mandi sebuah cafe. Dilengan kanannya
hasil analisis, yang bertujuan mencari faktor masih tertancap jarum suntik. Hasil otopsi
penyebab keracunan. Faktor lain yang juga melaporkan terdapat baik bekas suntikan yang
harus mendapat perhatian adalah fenomena masih baru maupun yang sudah menua
farmakologi seperti toleransi. Toleransi adalah dilengan kanan dan kiri, telapak tangan, kaki.
suatu keadaan menurunnya respon tubuh Terdapat udema paru-paru, dan bau aromatis
terhadap toksikan sebagai hasil paparan yang dari organ tubuh seperti saluran cerna. Dokter
berulang sebelumnya, biasanya dalam waktu spesialis Forensik menyimpulkan kematian
yang lama. Penurunan respon dapat diduga diakibatkan oleh keracunan obat-
diakibatkan oleh adaptasi selular pada suatu obatan.
konsentrasi toksikan, yang dapat berakibat Hasil analisis toksikologi forensik:
pada penekanan efek farmakologis yang Uji skrining menggunakan teknin immonoassay
diinginkan. Hal ini sering dijumpai pada kasus test (EMIT) terdeteksi positif golongan opiat
kematian akibat menyalahgunaan heroin, dan benzodiazepin. Dari penetapan kadar
dimanakan ditemukan tumpang tindih rentang alkohol di darah dan urin terdapat alkohol 0,1
konsentrasi morfin di darah pada kasus “lethal promil dan 0,1 promil.
related heroine (0,010 - 2,200 µg/ml, rataan: Pada uji konfirmasi dengan menggunakan alat
0,277 µg/ml)” dan “non-lethal related heroine GC-MS diperoleh hasil:
(0,010 -0,275 µg/ml, rataan: 0,046 µg/ml)” - darah sebelum di hidrolisis: - morfin: 0,200
(Wirasuta 2004). Konsetrasi morfin yang tinggi µg/ml, - kodein: 0,026 µg/ml
mungkin tidak mengakibatkan efek toksik pada - darah setelah hidrolisis: - morfin: 0,665 µg/ml,
junkis yang telah berulang memakai heroin, - kodein: 0,044 µg/ml
sedangkan pada konsentrasi yang sama - urin sebelum hidrolisis: - 6-asetilmorfin: 0,060
mungkin menimbulkan efek kematian pada µg/ml, - morfin: 0,170 µg/ml, - kodein: 0,040
orang yang baru menggunkan. Bahaya µgml
kematian sering dijumpai pada pemakaian - urin setelah hidrolisis : - morfin: 0,800 µg/ml, -
dosis tinggi oleh pencadu, yang memulai kodein: 0,170 µg/ml
kembali menggunakan heroin setelah lama Golongan benzodiazepin yang terdeteksi di
berhenti menggunakannya, dimana dosisnya darah adalah: diazepam: 1,400 µg/ml;
didasarkan pengalaman pribadi saat efek nordazepam: 0,086 µg/ml; oxazepam: 0,730
tolerasi masih timbul. µg/ml; temazepam: 0,460 µg/ml
Cairan Biologik 42
paling tua adalah mengendapkan proteinnya, semua protein yang ada dalam plasma. Akhir-
dan mengisolasi filtrat yang terjadi. Protein akhir ini banyak digunakan asetonittril, yang
terdenaturasi oleh pengendapan, dan ikatan dapat digunakan untuk analisis obat
obat-protein dirusak dan diharapkan obat tetap antikuvulsan dan analgetik, pada mana plasma
dalam larutan. Pereaksi asam yang populer dicampur dengan volume sama asetonitril,
untuk pengendapan protein adalah asam larutan dijenuhkan natrium bisulfat-natrium
triklorasetat, asam perklorat, dan asam klorida, kemudian larutan sebelah atasnya
tungstat. Akan tetapi pereaksi yang merupakan dapat digunakan untuk analisis.
asam kuat ini dapat mempunyai efek merugikan
Protein juga dapat didenaturasi menggunakan
pada obat yang hendak diekstraksi dan
enzim proteolitik. Walaupun enzim seperti ini
penggunaannya harus diuji terlebih dahulu
sering digunakan pada penyimpanan jaringan
dengan senyawa murni/standard, dan jangan
untuk analisis, enzim substilisin telah berhasil
digunakan langsung sebagai pereaksi umum.
digunakan untuk merusak protein plasma.
Selain itu dapat juga digunakan aluminium
Penemuan kembali sejumlah obat seperti
klorida atau amonium sulfat. Aluminium klorida
benzodiazepin, fenitoin dan asam salisilat dari
merupakan pereaksi yang paling aman untuk
plasma lebih efisien jika digunakan enzim ini,
mengendapkan protein dalam darah total.
dibandingkan dengan prosedur ekstraksi
Penemuan kembali yang rendah disebabkan
langsung. Hidrolisis menggunakan enzim
baik oleh mengendapnya obat dengan protein
adalah sangat berguna untuk prosedur skrining
atau oleh degradasi.
umum jika tidak mungkin untuk
Ketidak stabilan obat pada pH rendah di atas mengoptimasikan prosedur ekstraski yang
dengan penggunaan pelarut organik untuk biasa untuk obat tertentu. Sejumlah enzim lain
denaturasi dan mengendapkan protein. Dapat yang juga dapat digunakan dapat dilihat pada
digunakan metanol atau etanol dan paling tidak tabel berikut
dua volume etanol untuk mengendapkan
Tabel 5.1. Enzim proteolitik yang dapat digunakan pada penyiapan sampel biologik untuk analisis obat
Obat yang hedak dianalisis Enzim
Amitriptilin Subtilisin, tripsin, proteinase
Klorpormazine Substilisin, papain, ketodase, tripsin, protease
Diazepam Tripsin, proteinase, substilisin, ketodase
Difenhidramin Substilisin, ketodase, papain
Fenobarbaital Tripsin, protease
Fenitoins Substilisin, tripsin, proteinase
Walaupun plasma merupakan cairan yang amat protein, ikatannya adalah reversibel. Oleh
kompleks, komposisinya sangat stabil, bahkan karena itu pada pH yang tepat, sampel dapat
juga dalam pasien, pH plasma jarang terletak langsung diekstraksi dengan pelarut organik.
diluar 7,3 - 7,5 dan protein total serta Jika partisi bentuk yang tak terinonisasi ke
konsentrasi garamnya dapat dikontrol. dalam pelarut organik cukup tinggi, maka
Sebaliknya kandungan lemaknya dapat kesetimbangan ikatan dapat digeser
bervariasi, yang seringkali dipengaruhi waktu sedemikian hingga memberikan ekstraksi yang
dan sifat makanan. Lemak ini dapat efesien ke dalam pelarut organik. Caranya
mempengaruhi analisis dan terutama untuk adalah dengan menambahkan dapar yang
sampel yang berlemak, memerlukan tahap sesuai dengan volume sama, kemudian
partisi spesifik untuk menghilangkan lipida. diekstraksi dengan 2-3 kali volume pelarut
organik. Keuntungan dari cara ini adalah bahwa
Yang harus juga, diketahui adalah bahwa
tidak diperlukannya tahap filtrasi atau
perubahan dalam konstituen plasma dapat
dekantasi dan dapat digunakan sebagai
memberi impact pada level obat dalam plasma,
prosedur rutin untuk sejumlah besar sampel.
dan berbeda dengan faktor yang menggangu
Pemecahan ikatan protein-obat ini dapat juga
analisis.
dengan kolom adsorben untuk memekatkan
Ekstraksi juga dapat dilakukan tanpa obatnya yang kemudian dielusi dengan pelarut
mendenaturasi protien terlebih dahulu. organik. Adsorben yang digunakan harus
Walaupun obat terikat kuat dengan plasma cukup kuat untuk merebut obat dari proteinnya
Cairan Biologik 43
serta cukup lemah untuk melepaskan obat tidak boleh dikocok melainkan tabung dibolak-
pada waktu dielusi. Sebagai adsorben dapat balik secara pelahan-lahan.
digunakan arang aktif, beberapa jenis resin
Pemilihan tabung, harus hati-hati dan cocok
seperti XAD-2 dan S-X3.
untuk fraksi darah yang diperiksa agar
Yang perlu juga diperhatikan pada plasma atau senyawa obat terjamin kemantapanya untuk
serum adalah kemungkinan adanya enzim yang dianalisa. Untuk analisa plasma dan serum
dapat melanjutkan degradasi obat, terutama diperhatikan zat tambahan yang digunakan
esterase yang dapat menguraikan ester sehingga gangguan pada tahap analisis dapat
menjadi asam bebas dan alkohol. Sifat dan ditekan sekecil mungkin. Seperti contoh Tris(2-
aktivitas estrase ini dapat tergantung dari butoksi-etil)fosfat (TBEP), suatu pengental
pasiennya. yang terdapat pada tutup tabung pengental,
ternyata dapat mendesak beberapa ikatan obat
c) Urine
dengan protein, menyebabkan obat masuk ke
Urine, tidak seperti plasma, bebas dari protein dalam eristrosit. Sehingga memberi kesalahan
dan lipida, karena itu umumnya dapat langsung dalam penentuan obat dalam plasma.
diekstraksi dengan pelarut organik.
Jika darah atau serum yang hendak dianalisis
Dibandingkan dengan plasma atau serum,
perlu segera dipisahkan eritrositnya karena
komposisinya bervariasi cukup besar yang
kadar obat menjadi menurun yang disebabkan
dapat dilihat dari warna gelap urine malam
oleh beberapa faktor seperti metabolisme obat
dibandingkan dengan warna yang pucat dari
oleh eritrosit dan penyerapan obat ke dalam sel
urine yang dikumpulkan pada siang hari.
darah. Jadi makin lama obat bersentuhan
Komposisi urine keseluruhan tergantung pada
dengan sel menyebabkan makin besar
diet yang memang menyebabkan warna yang
penurunan kadar obat tersebut. Perlu
berbeda.
diperhatikan adsorpsi obat oleh dinding wadah
Keuntungannya adalah bahwa jenis senyawa karena kadar obat sangat kecil. Untuk
yang umum terdapat dalam urine adalah larut mengatasi hal ini biasanya ditambahkan amil-
air, sedangkan sebagian besar obat adalah alkohol. Setelah disentrifuga hati-hati dalam
larut lemak, hingga dapat diekstrasi dengan pemisahan, agar sel darah tidak terikut dipipet.
pelarut yang sesuai. Yang menjadi kesukaran
Wadah vial seharusnya inert, tertutup rapat dan
adalah bahwa adanya perbedaan yang besar
tahan terhadap kondisi penyimpanan. Pada
dari volumen urine yang dihasilkan pada satu
wadah ditandai dengan: tanda pengenal subjek,
tenggang waktu.
nama kajian, tenggang waktu perlakuaan
Urine dapat mempunyai rentang pH yang lebar, /pengobatan, macam contoh (serum, plasma,
terutama tergantung dari diet atau pengobatan. darah total), jam pengambilan sampel, tanggal,
Misalnya antasida, jika diabsorpsi akan nomer klas untuk setiap sampel, volume
menyebabkan urine basa. sampel.
Analisis toksikologi forensik biasanya Yang perlu diperhatikan dalam sampling urine
menerima sampel dari kedokteran patologi adalah: 1) selang waktu pengambilan akan
forensik yang dilengkapi dengan Berita Acara berpengahur terhadap volume yang ditampung,
Pengiriman Sampel. dihindari hilangnya urine (tumpah selama
pengambilan sampel); 2) untuk mencegah
a) Darah. tumbuhnya bakteri dalam sampel sebaiknya
Darah diambil dari pembuluh vena dengan didinginkan dalam lemari pendingin, dalam
menggunakan: jarum dan spuit; jarum dan beberapa hal biasanya ditambahkan pengawet
tabung pengambil darah hampa; kateter vena seperti: timol, toluen, formaldehid, borat, dan
yang dipasang tetap pada infus. Dalam kloroform. Penyawetan bertujuan untuk
pengambilan darah harus diperhatikan agar sel mencegah obat tidak terurai oleh bakteri.
darah merah tidak terhemolisis baik pada saat Sebelum analisa urine perlu dikocok agar
pengambilan dalam vena harus pelan-pelan. homogen, dan perlu pengukuran volum urine
Penambahan antikoagulan (heparin) tabung (volum urin total), analisis biasanya
Cairan Biologik 44
memerlukan 10 - 15 mL urine. Penandaan pada dari air. Jika ekstraksi dilakukan dalam tabung
wadah dilakukan seperti pada sampel darah sentrifuga terlebih-lebih jika sejumlah banyak
tetapi perlu dicatat volume urine total. sampel yang harus dianalisis, maka sebaiknya
pelarut pengekstraksi lebih ringan dari air.
5.3. Faktor-Faktor yang harus diperhatikan Pemilihan ini tentunya disesuaikan dengan
dalam Analisis obat dalam cairan biologi. apakah fase air atau fase organiknya yang
A. Penyimpanan Sampel hendak digunakan selanjutnya.
Dalam penyimpanan ini yang harus Selain pada densitas, pemilihan pelarut ini juga
diperhatikan adalah adanya enzim esterase dapat didasarkan pada kemudahan
serum. Oleh karena itu sebagai anti koagulan menguapnya. Untuk ini paling banyak
digunakan natrium forida dengan kadar 5 digunakan adalah eter walaupun akan
mg/ml karena dapat menginhibisi kerja enzim. memberikan masalah pada waktu sentrifugasi.
Cara yang paling banyak digunakan untuk Sifat kimia pelarut pengekstraksi juga dapat
penyimpanan adalah pendinginan di dalam menimbulkan efek yang tidak dikehendaki.
freezer. Kerugian dari cara ini adalah terjadi Misalnya amin primer seperti etilamin akan
efek apple jack yaitu obat akan terkonsentrasi bereaksi dengan keton dan aldehida
dalam tetes pertama yang membeku hingga membentuk basa Schiff. Sebaliknya metil butil
akan tinggal dipermukaan dan akan lebih keton sebagai pelarut dapat bereaksi dengan
mudah teroksidasi. Setelah beku obat belum amin primer. Dalam beberapa hal reaksi dapat
tentu tetap stabil seperti misalnya apomorfin, terjadi tanpa diketahui dan obat dapat
sebagian besar senyawa katekol ternyata tetap ditentukan tanpa kesalahan besar. Etil asetat
akan teroksidasi menjadi senyawa koinon akan terurai pada pH lebih dari 9,0 membentuk
walaupun disimpan pada suhu -15 °C, etanol dan asetat. Kloroform dan diklormetan
terkecuali jika ditambahkan vitamin C sehagai jika terkena udara akan terbentuk fosgen yang
anti oksidan. Indometasin juga tidak stabil jika sangat rekatif. Oleh karena kloroform /
dibekukan. Selain itu bekuan cairan/materi diklormetan mengandung pengawet /
biologi dapat mengakibatkan protein yang ada antioksidan seperti etanol yang dapat
rusak yang natinya dapat menggangu analisis mengakibatkan adanya / terjadinya
obatnya. etilkloformat yang selanjutnya merupakan alat
Karena pada waktu pencairan sampel sebelum pada perubahan norkodein menjadi norkodein
dianalisis dapat terjadi efek konsentrasi karbonat. Terjadinya turunan karbonat ini juga
terlokalisasi, sampel dikocok homogen ditunjukkan jika antidepresan trisiklik
sebelum dilakukan analisis. Sampel yang diekstraksi dengan kloroform yang tidak
sudah mencair harus segera dianalisis untuk mengandung etanol sebagai pengawet. Fosgen
menghambat kerja enzim. Pencairan sebaiknya dapat dihilangkan dari kloroform dengan
jangan dilakukan dengan pemanasan yang mencuci dengan air, dan etanol dengan
tinggi karena mungkin dapat menguraikan kromatografi kolom alumina.
obatnya. Untuk memperbesar partisi senyawa ionik ke
B. Ekstraksi dalam fase organik, fase air dapat dijenuhkan
dengan garam seperti ammonium sulfat yang
Cara yang paling umum yang sering digunakan dapat juga memperkecil kecendrungan
untuk pemurnian parsial obat adalah metode terbentuknya emulsi, untuk memisahkan dua
ekstraksi dengan pelarut organik. Agar obat lapisan cairan yang bercampur atau untuk
dapat terekstraksi dalam pelarut organik, harus merubah fase organik yang lebih berat dari air
dalam bentuk tidak terionisasi. Oleh karena itu menjadi lebih ringan seperti halnya campuran
pH fase air harus dioptimasi untuk masing- eter-kloroform.
masing obat agar diperoleh bentuk tak
terionisasi dengan sempurna. C. Pemisahan Fase/Lapisan.
Pada tahap ekstraksi, densitas pelarut Untuk pemisahan obat dalam cairan biologik
pengekstraksi juga harus diperhitungkan. Jika secara ekstraksi cair-cair jarang digunakan
hendak mengunakan corong pisah maka corong pisah, karena volume sampel umumnya
pelarut pengekstraksi sebaiknya lebih berat
Cairan Biologik 45
kecil. Biasanya pemisahan dilakukan dengan dibandingkan menggunakan natirium sulfat
tabung sentrifus. anhidrat.
Kerusakan yang paling umum adalah yang E. Penguapan Sampai Kerring
disebabkan oleh pembentukan emulsi yang
Pada tahap penguapan sampai kering ini sering
bertahan akibat pengocokan kuat. Pada
kehilangan akan obat, akibat terutama oleh
pengocokan kuat akan terjadi gelembung
bumping (muncrat), adsorpsi oleh wadah gelas
gelembung kecil dari satu fase masuk ke
dan menguapnya obat, seperti yang dialami
campuran dua fase, dan jika tegangan
oleh anti depresan trisiklik. Jika hal ini terjadi
permukaannya rendah, maka gelembung ini
dapat diatasi dengan mengselanisasi alat gelas
akan bertahan. Emulsi yang bertahan ini akan
yang digunakan, pelarut diuapkan pada 40 °C
terbentuk jika dilakukan pengocokan kuat
memindahkan residu obat segera dan
dengan adanya protein, sabun atau detergen.
menggunakan standard internal. Penguapan
Untuk memecahkan emulsi ini dapat dengan
sampai kering dapat dilakukan dengan
sentrifugasi, pembekuan kemudian diikuti
evaporator.
pencairan, filtrasi, diaduk dengan batang
pengaduk gelas, penjenuhan fase air dengan F. Sumber Pencemaran
garam atau penambahan sejumlah sedikit Cemaran adalah senyawa yang tidak
alkohol. Penambahan alkohol sebaiknya tidak dikehendaki yang masuk ke dalam sampel
dilakukan jika dikehendaki reprodusibilitas selama proses pembuatan (cemaran endogen)
ekstraksi yang baik. yang sebenarnya merupakan sebagian masalah
D. Pengeringan Fase Organik analisis. Adanya cemaran yang sebenarnya
berasal dari proses analisis. Yang juga harus
Setelah dipisahkan dari fase air, fase organik
diketahui adalah bahwa cemaran suatu
harus betul-betul bebas air, karena jika fase
prosedur tertentu belum tentu merupakan
organik hendak diuapkan sampai kering, maka
cemaran pada prosedur yang lain. Jadi pelarut
tetes terakhir air dapat menyebabkan
yang diperuntukkan untuk spektroskopi
diperlukannya kondisi yang labih kuat
misalnya dapar saja mengandung senyawa
dibandingkan dengan kondisi yang dibutuhkan
yang tidak mengabsorpsi yang memungkinkan
pelarut sendiri, yang mungkin justru dapat
mempengaruhi sifat kromatografi.
menguraikan obatnya. Untuk mempercepat
penguapan dapat ditambahkan beberapa tetes Masuknya cemaran dapat terjadi dari mulai
etanol, walaupun hal ini dapat menimbulkan tabung pengumpul spesimen, senyawa kimia
terjadinya esterifikasi asam organik yang tidak yang, sengaja ditambahkan ke dalam sampel
dikehendaki atau pembentukan ketal dengan misalnya antikoagulan pada sampel darah
gugus okso. Residu penguapan dapat dapat merupakan cemaran pada analisa
mengandung asam atau basa mineral. Adanya menggunakan HPLC.
air dalam fase organik dapat merubah Staf laboratorium dapat juga merupakan
komposisi fase gerak pada HPLC. Pada GC sumber cemaran. Cemaran lain dapat berupa
penyuntikan garam atau protein yang larut air serat dan tisu atau jas Lab. Cemaran juga dapat
yang dikandung fase organik dapat berasal dari alat lab yang tidak bersih.
menyebabkan terbentuknya tumpukan zat
padat pada awal kolom atau airnya sendiri KEPUSTAKAAN
dapat menarik fase diam kolom.
1. Chamberliain, J.. (1985), Analysis of Drugs
Sesepora air dapat dihilangkan dari fase in Biological Fluids, CRC Press, Inc., Boca
organik dengan penambahan sedikit natrium Raton.
sulfat anhidrat, larutan yang sudah bebas air
dituangkan dengan meninggalkan garam yang 2. Moffat, C.A., et al., (1986), Clarke's Isolation
terhidrasi sebagai bongkahan kecil di dalam and Identification of Drugs, 2nd ed. The
tabung. Jika jumlah airnya hanya sesepora Pharmaceutical Press, London.
untuk menghilangkan air ini cukup dengan 3. Sriewoelan, S. (1988), .Analisis Obat Dalam
menyaring melalui kertas saring kering dengan Cairan Biologi, Jakarta
kehilangan akan obat yang lebih kecil
Cairan Biologik 46
BAB VI
REAKSI WARNA
Reaksi warna adalah prosedur kimia dalam yang sama. Warna yang dihasilkan harus
pengujian senyawa dengan menggunakan dicatat apakah dihasilkan oleh bentuk asam
pereaksi dengan mengamati warna yang atau bentuk basanya, sebab dalam hal tertentu
terbentuk atau perubahan warna yang terjadi. bentuk asam dan basanya memberikan warna
Banyak senyawa kimia dapat memberikan yang berbeda pada pH yang berbeda. Seperti
warna tertentu jika berkontak dengan pereaksi contoh senyawa obat dalam bentuk garam
tertentu. Warna yang dihasilkan oleh pereaksi hidroklorida biasanya memberi warna merah
tersebut mungkin spesifik untuk senyawa dengan uji Mendelin's dan memberi warna biru
tersebut, atau juga tidak. Reaksi warna tidak oleh reagen Koppayi-Zwikker (sebelum
dapat dijadikan dasar untuk mengidentifikasi ditambahkan pirolidin). Fenomena ini jika
satu senyawa obat, tetapi warna yang terbentuk diterapkan pada materi biologi tidak
mungkin positif terhadap sekelompok senyawa menimbulkan masalah, tetapi akan muncul
atau positif terhadap gugus fungsi tertentu, masalah jika diterapkan pada sediaan
sehingga reaksi warna berhubungan dengan farmaseutika.
aspek gugus fungsi dari struktur senyawa obat
tersebut. 6.2. Faktor Teknis
Yang paling penting dari reaksi warna adalah Pemilihan pereksi warna yang tepat untuk
skrining cepat dari sampel urine senyawa obat yang diduga terdapat dalam
memungkinkan analisa tanpa ekstraksi lebih sampel didasarkan atas rumus bangun dari
dahulu. Toksikolog harus memperhatikan senyawa obat tersebut. Jika dikenal
keterbatasan reaksi warna dan sumber-sumber strukturnya maka dapat diketahui gugus fungsi
yang memungkinkan reaksi positif palsu. (golongan) yang terdapat didalamnya, sehingga
pemilihan pereaksi dapat berdasarkan reaksi
6.1. Interpretasi reaksi warna. positif terhadap gugus fungsi tersebut.
Ataupun pemilihan pereaksi warna dapat
Rentang warna yang dihasilkan oleh rekasi
didasarkan pada pereksi yang memang spesifik
warna tidak mungkin mengatakan dalam
untuk senyawa bersangkutan.
derajat, karena sangat terbuka untuk
memberikan deskripsi yang subjektif. Lebih Rekasi warna dapat diterapkan langung pada
jauh rentang warna tersebut mungkin sangat sampel baik berupa sediaan atau dari spesimen
luas atau sempit, rentang warna tersebut cairan biologi. Reaksi warna juga digunakan
sangat tergantung pada kondisi percobaan, sebagai penampak noda pada plat KLT atau
jumlah analit yang terdapat dalam sampel, dan sebagai uji skrining maupun konfirmasi
terdapatnya senyawa lain dalam sampel yang menggunakan KLT.
mungkin menimbulkan reaksi positif atau
negatif palsu. 6.3. Beberapa Reaksi Warna
Warna yang ditunjukan dibagi menjadi warna 6.3.1. Reaksi golongan
dasar seperti: merah, oranye, kuning, hijau, a. Sifat khas senyawa nitrogen
biru, ungu, dan ping, coklat, abu-abu, hitam.
Biru yang bervariasi mungkin dihasilkan dua Nitrogen dalam bentuk nitrat dan nitrit; sebagai
warna seperti merah - coklat, oleh karena itu senyawa nitro dalam ikatan dengan senyawa
perlu dijelaskan perubahan warna yang karbon; sebagai amin primer, sekunder, atau
terbentuk selama melakukan uji, atau dicatat tersier yang bersifat basa; sebagai amonium
warna yang dominan muncul merah - coklat kuarterner; golongan amin aromatik; asam
atau terjadi perubahan warna merah → coklat. amida netral; garam ion zwitter seperti asam
amino: dan dalam bentuk lain.
Kesimpulan akhir dari reaksi warna harus
disertai reaksi pembandingan, dengan Pemeriksaan nitrat
mereaksikan baku pembanding pada kondisi
Reaksi Warna 47
Semua nitrat larut dalam air. Dengan Pemeriksaan amin sekunder
menambahkan FeSO4 dan H2SO4 pekat Zat dilarutkan dalam 2 ml 3N HCl, didinginkan
terbentuk cincin berwarna coklat. pada 5°C, kemudian dengan 2 ml larutan NaNO2
1%. Lima menit kemudian larutan diencerkan
Pemeriksaan senyawa nitro aromatik
dengan 5 ml air dan dikocok dua kali, setiap
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 3 ml
kali dengan 5 ml eter. Larutan eter dicuci, dan
etanol. Sesudah pemberian 3 ml HCl encer, 4
akhirnya diuapkan sampai kering. Kepada sisa
ml air, dan 200 mg Zn, campuran dipanaskan di
penguapan ditambahkan 50 mg fenol,
penangas air selama 10 menit. Lalu 2 ml
dipanaskan sebentar, didinginkan, direaksikan
filtratnya direaksikan dengan 2 tetes pereaksi
dengan 1 ml H2SO4 : terbentuk warna biru-hijau
Diazo I. Selanjutnya larutan dituangkan ke
pekat yang bila hasil rekasi dituangkan ke
dalam 2 ml pereaksi Diazo II; terbentuk warna
dalam air berubah menjadi merah. Jika
jingga atau endapan, misalnya pada nitrazepam
dibasakan warna hijau-biru semula timbul
dan klorazepam.
kembali (percobaan nitrosamin dan
Pereaksi Diazo I: 10 g NaN02 dalam 100 ml
Liebermann)
aquades
Pereaksi Diazo II : 0,25; g 2-naftol dalam 100 ml Pemeriksaan amin alifatik primer dan amin
3N NaOH. aromatik ( rekasi Isonitril)
Sedikit zat dilarutkan dalam etanol, direkasikan
Pemeriksaan senyawa basa amin
dengan beberapa tetes kloroform dan basa
Dengan pereaksi Mayer senyawa basa amin
alkali dalam etanol, kemudian dipanaskan
membentuk endapan kekuning-kuningan.
dengan api kecil. Tercium bau khas isonitril
Caranya: ke dalam larutan zat yang jernih, yang
bersifat asam lemah akibat penambahan asam
Pemeriksaan asam amino ( rekasi Ninhidrin)
sulfat, ditambahkan beberapa tetes pereaksi.
Kedalam 1 ml larutan zat yang netral
Reaksi tidak sama untuk semua senyawa basa
ditambahkan 2 tetes larutan ninhidrin 1 %
amin. Morfin dan efedrin hanya memberikan
dalam air, kemudian dipanaskan, sampai
sedikit endapan atau sama sekali tidak.
mendidih. Terbentuk warna kemerah-merahan,
Pereaksi Mayer: 1,35 g HgCl2 dalam 100 ml
ungu, atau biru. Rekasi positif antara lain untuk
larutan KI 5%
: efedrin (merah), tolbutamid (ungu), asam
Pemeriksaan amin alifatik primer ( reaksi askorbat (merah tua).
Senfol)
Pemeriksaan golongan guanidin (reaksi
Larutan amin dalam etanol dituangi
Sakaguchi)
karbondisulfida sama banyak, dipanaskan
Ke dalam larutan 1 mg zat dalam 5 ml air
sampai karbondisulfida yang berlebih
ditambahkan 1 ml larutan NaOH 10 % dan 1 ml
menguap. Pada sisa larutan ditambahkan
larutan 1-naftol 0,05 % dalam etanol. Campuran
beberapa tetes larutan raksa (II) klorida 5 %;
didinginkan pada ± 15 °C lalu ditambahkan 3
tercium bau khas `mustard' jika ada amin
tetes larutan natrium hipobromit ( 2 g NaOH
alifatik primer.
dalam 7,5 ml air + 0,5 ml Brom, ditambahkan air
Pemeriksaan amin aromatik primer ( reaksi sampai 10 ml). Terbentuk warna merah-ungu
Diazo) (streptomisin).
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 1 ml 3N
Pemeriksaan turunan piridin
HCl. Larutan direaksikan dengan 2 tetes
i. Pada pemanasan 100 mg zat dengan 100
pereaksi Diazo I, dan kemudian dituangkan ke
mg natrium karbonat kering bau piridin
dalam 2 ml perekasi Diazo II; terbentuk warna
tercium. Hal itu terjadi pada sebagian besar
merah jingga atau endapan. Reaksi positif
turunan piridin.
untuk benzokain, etrakridin, PAS, prokain, dan
ii. Sejumlah 5 mg zat dicampur atau digerus
sulfonamida. Etakridin sudah berwarna merah
dengan 10 mg 1-klor-2,4dinitrobenzol, lalu
ketika ditambahkan Diazo I, sedangkan
dilumerkan sebentar. Lumeran yang sudah
imipramin berwarna biru. Rekasi dapat juga
dingin dilarutkan dalam 2 ml 0,5N KOH-
positif jika zat dipasakan dulu dengan 3N HCl
etanol. Terbentuk warna merah tua
selama 3-15 menit dan kemudian didinginkan,
(nikotinamida)
misalnya untuk klordiazepoksida, furosemida,
oksazepam, fenasetin.
Reaksi Warna 48
b. Pemeriksaan senyawa pereduksi Metode : Larutkan sampel ke dalam sesedikit
air, dengan tambahan etanol bila perlu,
Reaksi Fehling
tambahkan pereaksi sejumlah volum yang
Ke dalam 1 ml campuran pereaksi Fehling I
sama, catat warna yang terjadi, kemudian
dan II sama banyak ditambahkan 20 mg
panaskan di dalam tangas air pada 100°C
zat, lalu dipanaskan di penangas air. Bila
selama 30 detik.
ada reduksi terbentuk endapan tembaga (I)
oksida berwarna merah-biru bata. Indikasi : Merah, kuning, coklat, atau hitam
Positif pada suhu kamar : asam askorbat. (pada suhu kamar) menunjukkan adanya
Positif pada pemanasan : isoniasida, gula senyawa pereduksi. Ini terjadi jika atom karbon
pereduksi, hidrokortison, sorbitol yang pada cincin terikat gugus hidroksil, gugus
sebelumnya dioksidasi dengan KMnO4, hidroksil pada posisi meta tidak memberi
sukrosa setelah dihidrolisis dengan asam. respon, sedangkan pada posisi para
Perekasi Fehling I: larutan CuS04.5H20 7 %. menunjukkan respon. Beberapa pereduksi juga
Pereaksi Fehling II: 35 g KNa-tartrat + 10 g positif adalah ikatan etinil, tetapi bukan ikatan
NaOH + air sampai 100 ml. etilenik.
Rekasi adisi dengan brom c. Antimoni Pentaklorida
Sejumlah 50 mg zat dilarutkan dalam 2 ml
Pereaksi: Keringkan sejumlah antimoni
asam asetat, lalu ditambahkan tetes demi
triklorida pada fosfor penta oksida, lelehkan
tetes air brom (1,0 g Br2 atau 0,3 ml Br2 /
bahan yang telah dikeringkan ( titik leleh 73°C),
100 ml asam asetat). Apabila ada ikatan tak
dan lewatkan gas klorin kering ke dalam
jenuh warna brom akan hilang.
lelehan sampai terbentuk cairan berwarna
c. Pemeriksaan aldehid kuning. Tambahkan kloroform 10 kali volum
cairan kuning, saring larutan ke dalam botol
Zat dilarutkan atau disupensikan dalam air,
berwarna gelap dan simpan di dalam desikator.
diasamkan dengan 3 N HCl sampai pH
mencapai kurang dari 3, lalu ditambahkan Metode : Tempatkan satu tetes larutan etanol
perekasi Schif yang tak berwarna dengan dari sampel pada kertas saring, tambahkan
volum sama banyak. Setelah beberapa waktu pereaksi, dan segera keringkan di atas uap air.
terbentuk warna, merah sampai ungu. Rekasi
Indikasi : Berbagai variasi warna terbentuk oleh
blanko terhadap perekasi perlu dilakukan.
glikosida jantung dan warna tertentu oleh
estrogen dan kortikosteroid.
6.3.2. Reaksi khusus Test asam amalic
d. Aromatik
a. Tets asam amalic
Metode 1: Tempatkan sejumlah sampel masing-
Metode : Tambahakan ke dalam sampel
masing ke dalam dua tabung reaksi, salah satu
beberapa tetes 10 M HLCl, diikuti beberapa
tabung tambahkan NaOH padat. Panaskan
kristal KCl, kemudian uapkan sampai kering.
tabung dengan hati-hati hingga semua uap
Amati warna yang terbentuk pada residu,
keluar, tambahkan pereaksi Marquis dan amati
tambahkan 2-3 tetes 2 M NH4OH, amati kembali
warna yang terjadi.
rawna yang terbentuk
Indikasi :Warna merah dan orange
Indikasi :Residu berwarna merah, ping, orange,
mengindikasikan bahwa sampel mengandung
atau kuning berubah menjadi ping, merah atau
aromatik alam. Warna mungkin diberikan oleh
violet setelah ditambahkam
sesepora hidrokarbon aromatik. Jika warna
amoniumhidroksida. Mengindikasikan
diberikan setelah pemanasan dengan NaOH
terdapatnya senyawa berinti xantin.
menunjukan adanya asam aromatik, tetapi jika
b. Perak Ammoniumnitrat tanpa NaOH menunjukkan adanya fenol, asam
Pereaksi: Ke dalam 20 ml peraknitrat 0,1 M fenolat, mengandung aldehid dengan gugus
ditambahkan larutan ammonium pekat hidroksil lebih dari satu. Reaksi negatif tidak
secukupnya untuk melarutkan peraknitrat yang berarti sampel bukan non-aromatik.
tidak melarut. Metode 2: Tambahkan 2- 3 tetes asam nitrat ke
dalam sampel panaskan pada tangas air 100°C
Reaksi Warna 49
selama 1 menit, dinginkan tambahkan air 2-3 menjadi ungu jika diencerkan, beberapa fenol
kali volum, buat larutan menjadi basa dengan juga memberikan warna seperti
menambahkan NaOH 40%.
kanabinoid.
Indikasi : Perubahan warna dari tidak berwarna
Pereaksi : Larutkan 0.5 g p-
atau warna kekuningan dalam larutan asam
dimetilaminobenzaldehid dalam 50 ml
menjadi warna gelap; seperti contoh orange
campuran larutan (60 volume etanol dan 40
atau orange-merah setelah penambahan NaOH
volume asam sulfat). Peraksi harus dibuat
menunjukkan terdapat cincin benzen di dalam
segar.
molekul, mungkin dihasilkkan oleh nitrofenol
atau senyawa nitro lainnya. Seyawa tertentu h. Pereaksi Dragendruff
(contoh : diazepam, metaqualon) memberi hasil Larutkan sampel ke dalam 3 tetes 2M HCl,
yang negatif. Warna orange dapat diberikan tambahkan 2-3 ml perekasi, encerkan dengan 2
oleh senyawa kortikosteroid non-aromatik ml air, amati warna yang terjadi; warna orange,
tertentu ( Kortison). merah-orange, coklat-orange diberikan oleh
e. Reaksi Mureksid alkaloid. Amin primer, skunder, tersier, dan
kuartener juga memberi reaksi positif.
Sejumlah 10 mg zat ditambahkan 1,5 ml
hidrogen pereksida dan 5 tetes asam sulfat Pereaksi: Larutkan 1 g bismut subnitrat dalam
pekat, kemudian dipanaskan di penangas air 3 ml 10 M HCl untuk tujuan pemanasan.
samapi kering. Sisa diberikan beberapa tetes Encerkan dengan 20 ml air, larutkan 1 g KI ke
6N NH3. Bila ada senyawa purin ( teofilin, dalam campuran tersebut. Jika Bismut hitam
kofein, teobromin) terbentuk warna merah dengan tri-iodida terpisah tambahkan asam HCl
ungu. Sewaktu menguap, warna sudah 2M dan sedikit KI.
terbentuk, yang kemudian diperkuat oleh i. Pereksi Duquinois
oksidasi.
Sejumlah sampel atau ekstrak eter simplisia, di
f. Reaksi Zwikker dalam tabung reaksi, uapkan ekstrak
Ke pada 10 mg zat dipelat tetes ditambahkan 10 tambahkan 0,5 ml pereaksi dan sejumlah
tetes pereksi Zwikker I. Penambahan 2 tetes volume yang sama 10 M HCl, panaskan
pereaksi Zwikker II menimbulkan warna ungu perlahan-lahan amati warna yang terjadi,
jika reaksi positif. Isoniasida dan beberapa zat tambahkan klorform kemudian dikocok, amati
lain menggangu rekasi hingga lebih baik jika wama yang terekstraksi. Perubahan warna dari
zat dipisahkan dulu dengan ekstraksi. Reaksi abu-abu - hijau- biru- violet- biru diduga
Zwikker positif untuk barbiturat, glutetimida, diberikan oleh kanabis, tetapi perlu dilakukan
hidantoin, beberapa sulfonamida, dan purin. pembandingan dengan kopi yang disangrai,
Basa hidroksida atau basa fosfat membentuk dan minyak patcholi yang juga memberi rekasi
warna biru-hijau yang setelah ditambahkan positif. Hanya kanabis memberikan warna ungu
pereaksi Zwikker II berubah menjadi biru tua yang terekstraksi ke dalam kloroform.
atau ungu. Reaksi ini terutama positif untuk Perekasi :Larutkan 2 g vanilin dan 0,3 ml
furosemida (biru kuat), mefrosida (biru-kelabu), asetaldehid dalam 100 ml etanol. Peraksi harus
nipagin M, hidroklortiazida, dan sakarin Na disimpan dalam lempat yang gelap.
(berwarna biru hanya dengan perekasi Zwikker
I). j. Formaldehid - asam sulfat
Pereksi Zwikker I: kobal (II) nitrat dalam Campurkan sampel dengan pereaksi panaskan
metanol Peraksi Zwikher II : piridin 10 % dalam pada 100 oC selama satu menit. Senyawa
metanol.p-Dimetilaminobenzaldehid benzodiazepin umumnya memberikan warna
orange kecuali bromazepam dan klozapin
Tambahkan ke dalam sampel di dalam tabung (kuning), dan lurazepam (pink). Senyawa lain
reaksi, bila perlu dipanaskan, amati warna yang juga berreaksi, positif adalah fenotiasin,
terbentuk, kemudian tambahkan air dengan tioxanten, tryplamin tertrasiklin, dan zomepirak.
hati-hati. Warna ungu diberikan oleh alkaloid
ergot, kanabinoid dan beberapa cincin indol Pereaksi ke dalam 4 volume H2S04 tambahkan 6
memberikan warna merah yang berubah volume larutan formaldehid, aduk
Reaksi Warna 50
manggunakan pipet, larutan akan panas lebih Pereaksi : 2 ml Natriumplatina 5% dan 5 g KI
dari 1 jam, apabila memberikan warna buram ditambahkan air 98 ml kocok hingga larut.
panaskan dalam, penangas air 100 °C selama 1
menit. Catatan pereaksi ini tidak sama dengan
pereaksi Marquis. Kepustakaan.
k. Pereaksi lodoplatinat 1. Kovar. A, 1987, Identifikasi Obat,Penerbit
ITB, Bandung.
Larutkan sampel dalam 2 tetes 2 M HCl,
tambahkan 2-3 ml pereaksi, encerkan dengan 2. Stevens, HM., 1986, Color Test, Moffat, C.A.
10 ml air. Reaksi positif diberikan oleh alkaloid et.al., Clarke `s Isolation and Identification
base membentuk warna ungu, biru-ungu, of Drugs, 2 nd ed., 128 - 176 The
coklat-ungu, abu-abu-ungu. Pharmaceutical Press, London.
Reaksi Warna 51
BAB VII
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Kromatograti lapis tipis (KLT) adalah suatu salah satu komponen dari campuran
metode pemisahan campuran analit dengan diadsorpsi lebih kuat dari komponen yang
mengelusinya melalui fase diam yang datar lainnya. Karena adsorpsi merupakan
pada plat penyangga. KLT termasuk fenomena permukaan, maka derajat
kromatografi adsorpsi, walaupun sebenarnya pemisahan dipengaruhi oleh luas permukaan
mekanisme yang terjadi adalah kombinasi yang ada atau secara tidak langsung
adsorpsi dan partisi. Dalam kromatografi dipengaruhi oleh ukuran partikel fase diam
adsorpsi fase diam berupa padatan seperti (adsorpben). Walaupun begitu yang
silika gel atau alumina sedangkan fase gerak merupakan faktor kunci setiap bentuk
berupa cairan atau gas. Dalam KLT fase gerak kromatografi adalah koefisien distribusi/partisi
ini berupa cairan. Pemisahan akan terjadi jika senyawa antara ke dua fase dalam sistem.
Jumlah senyawa per satuan fase diam
Koefisien distribusi" partisi" (K) = (7.1)
Jumlah senyawa per satuan fase gerak
Dalam kromatografi adsorpsi harga “K” ini untuk bermigrasi dari konsentrasi tinggi di
dipengaruhi oleh suhu dan konsentrasi tengah-tengah noda pada KLT menuju zone
senyawa. Pada suatu suhu tertentu hubungan konsentrasi yang lebih rendah di pinggiran
antara jumlah senyawa pada fase diam dan noda. Hal ini akan menimbulkan pelebaran
jumlah senyawa yang ada pada fase gerak noda yang akan membuat pemisahan tidak
dapat dinyatakan secara grafik sebagai efisien.
isoterem distribusi. Kelandaian isoterm linier
KLT dengan fase diam yang berukuran sangat
berbanding langsung dengan koefisien
kecil (3 - 5 µm) dikenal dengan KLT kinerja
distribusi/partisi, hingga kondisi untuk
tinggi (HPTLC = High Performance Thin-Layer
mendapatkan pemisahan yang optimum
Chromatography). HPTLC memerlukan waktu
adalah kondisi pada mana harga koefisien
elusi yang singkat, jarak elusi yang lebih
distribusi ini adalah sama dengan satu.
pendek dan jumlah elusi analit yang lebih
Efisiensi pemisahan pada kromatografi dapat sedikit dibandingkan dengan KLT.
dinyatakan sebagai jumlah plat teoritis.
Parameter migrasi analitik pada KLT dinyatakan
Jumlah plat teoritis (N) berhubungan dengan
dengan Rf.
panjang plat KLT (L) atau panjang kolom pada
kromatografi kolom dan H adalah tinggi plat Rf = D A (7.4)
teoritis (Height equivalent a theoretical plat) DM
N=L (7.2) dimana DA jarak titik awal ke pusat zone A
H setelah elusi dan DM adalah jarak dari titik awal ke
Untuk menghitung kinerja KLT perlu tepi muka pelarut. Faktor kapasitas relatif dari
mengidentifikasi parameter yang mungkin dua komponen merupakan ukuran kemampuan
menurunkan harga H. Empat parameter yang kolom/plat untuk memisahkan keduanya. Hal ini
terpenting pada KLT adalah viskositas, dinyatakan sehagai:
K ' = (1 − Rf )
temperatur, laju linier dari fase gerak dan
ukuran dari fase diam. Efisensi dari (7.5)
Rf
kromatografi cair dapat digambarkan seperti
pada persarnaan Van Deemter Kemampuan sistem KLT untuk memisahkan dua
komponen A dan B dapat dinyatakan sebagai
H=B
µ + Cs µ + Cm µ (7.3) resolusi (Rs):
(
Rs = 2 D A − D B
) (7.6)
Dimana µ = laju linier fase gerak, Cs dan Cm (W A + WB )
adalah konsentrasi analit pada fase diam dan
fase gerak. Proses difusi longitudinal dimana DA dan DB adalah jarak yang ditempuh
dinyatakan sebagai B dan berhubungan noda A dan B, sedangkan WA dan WB adalah
dengan kecenderungan dari molekul analit lebar noda/bercak A dan B. Jika Rs ≥ 1 pemisahan
Kromatografi Lapis Tipis 52
yang terjadi adalah sempurna. Faktor selektivitas k ' B D A (DM − D B )
(S) juga diukur sebagai daya resolusi S= = (7.7)
K ' A D B (DM − D D )
Batas Pengembangan
WA
WB
DM
DA
DB
Awal Penotolan
Eluent
Interaksi antara solute dengan gugus siloksil Detektor yang sering digunakan untuk analisis
bebas dari silika dan isoterm adsorpsi nonlinier obat adalah UV detektor. Detektor ini
adalah alasan utama yang menyebabkan noda dikelompokkan menjadi tiga kelompok:
berekor pada kromatografi fase normal. detektor panjang gelombang tatap, detektor
Masalah ini dapat diatasi jika molekul solut panjang gelombang variabel atau panjang
dapat berinteraksi dengan pelarut lebih polar. gelombang tersebar, detektor diode-array.
Dengan secara konstan merubah komposisi Detektor panjang gelombang tetap
fase gerak pada periode analisis, sehingga menggunakan panjang gelombang tertentu
daya elusi dapat ditingkatkan. Dengan metode pada satu panjang gelombang, biasanya
elusi gradien dimulai dengan pelarut non-polar dihasilkkan oleh lampu merkuri (254 nm),
hingga pelarut polar. Laju pencampuran pelarut kadang-kadang juga oleh Iampu cadmium
dapat secara linier atau eksponensial. Pada (225nm) dan zink (212 nm). Panjang gelombang
HPLC sudah dilengkapi radar (device) untuk yang diemisikan oleh lampu ini tidaklah
mengatur pencampuran pelarut ini. Metode monokromatis tetapi intensitas radiasi panjang
elusi gradien ini tidak hanya dapat mengatasi gelombang yang lainnya sangat rendah. Untuk
puncak berekor tetapi juga akan memberikan menghilangkan radiasi ini ditambahkan filter
resolusi yang lebih baik. Yang lebih penting antara sumber radiasi dan sel detektor.
dapat menurunkan waktu analisis campuran
komplek, yang memiliki harga k' berbeda. Tidak semua obat mempunyai panjang
Sistem ini memberikan analisis yang sangat gelombang maksimum pada 254 nm, sebagai
selektif karena memberikan puncak yang lebih konsekuensinya tidak semua senyawa obat
tajam. HPLC modern menyediakan radas elusi dapat dideteksi menggunakan detektor ini.
gradien sampai menggunakan empat campuran Masalahnya yang timbul juga tidak semua obat
pelarut yang berbeda. dapat dideteksi pada serapan maksimumnya.
refraksi pada 25 oC; c Titik didih dalam oC; d Viskositas pada 25 oC, e Parameter polaritas
pelarut; g konstanta dielektri pada 20oC; h kelompok selektivitas pelarut.
susunan diode, masing celah diode merekam
Untuk memecahkan masalah ini digunakan
satu panjang gelombang. Sehingga masing-
detektor panjang gelombang variabel atau
masing celah tersebut dapat digunakan untuk
diode array detektor. Sumber radiasi detektor
mengukur serapan pada λmak analit yang
panjang gelombang variabel menggunakan
melewati sel detektor, atau semua diode
lampu deuterium dan yang memberikan radiasi
merekam radian power (intensitas) yang
pada daerah UV. Antara sumber radiasi dan sel
dielusi. Detektor ini dapat juga digunakan
detektor ditempatkan monokromator, radiasi
untuk menentukan kemurnian analit yang
monokromatis yang melewati sel detektor akan
dipisahkan dengan cara mengukur sepektrum
ditangkap oleh photocell. Oleh photo sel
dari waktu ke waktu selama puncak tersebut
intensitas radiasi dirubah menjadi sinyal listrik
dielusi. Apabila spektra puncak tersebut
kemudian dimanipulasi sehingga dapat terbaca
berubah selama pengukuran tersebut
sebagai data adsorban atau transmitan.
menunjukan puncak terelusi adalah tidak
Untuk HPLC yang menggunakan penghenti tunggal. Kebanyakan diode array detektor
aliran, serapan spektra senyawa yang dideteksi dilengkapi dengan pengukuran rasio absorban
dapat diukur. Berbeda dengan diode array pada dua panjang gelombang yang berbeda,
detektor tidak melewatkan radiasi seperti yang digunakan untuk penetapan
monokrimatis ke dalam sel detektor. Radiasi barbiturat.
polikromatis yang dilewatkan ke sel detektor
Detektor fluoresensi. Walaupun sangat sedikit
dilewatkan menuju monokromatis halokisi yang
digunakan untuk analisis obat detektor
mendispersikan radiasi polikromatis menuju
fluoresensi memiliki keuntungan dalam
Penggunaan HPLC Dalam Analisis Toksikologi 63
sensitivitas dibandingkan dengan detektor UV. data analisis, sehingga data yang berhubungan
kususnya dalam batas deteksinya. Tidak semua dengan sampel obat harus dicatat. khususnya
obat berfluoresensi, tetapi banyak dapat dibuat penampilan mikroskopi maupun
manjadi turunan berfluoresensi dengan makroskopiknya seperti, pembungkus sampel,
pereaksi fluoresen yang sesuai, seperti asam dan penandaaan yang terdapat pada
amino dapat dibuat menjadi turunan sampel/pembungkus. Semua historis data ini
berfluoresensi dengan menggunakan reagent sebagai bukti di pengadilan.
o-ftalaldehid atau fluorescamin. Morfin dapat
Penggunaan HPLC didalhului oleh uji skrining,
dibuat berfluoresensi dengan pereaksi
menggunakan reaksi warna atau reaksi
ferisianida membentuk apomorfin dengan
skrining lainnya. Analisis obat menggunakan
intensitas fluoresensi yang kuat.
HPLC biasanya didahului oleh praperlakuan,
Detektor elektrokimia adalah representatif seperti ekstraksi analit dari sampel. Metode
untuk monitoring penyalahgunaan obat. ekstraksi tergantung pada jenis sampel dan
Detektor ini sangat sensitive dan menunjukan sifat fisikokimia dari analit. Setelah sampel
selektivitas yang tinggi. Hanya saja detektor ini diekstraksi dapat langsung diinjeksikan ke
hanya dapat digunakan untuk menetukan obat dalam kolom melalui mikrofilter (biasanya
yang dapat dioksidasi atau direduksi. Respon berdiameter 2µm) atau sebelum diinjeksikan
dari detektor ini muncul dari aliran elekro yang ekstrak kering kemudian dilarutkan ke dalam
dihasilkan oleh reaksi redok pada permukaan fase gerak. Perlu diperhatikan sifat mikrofilter
elektroda. yang kadang terlarut dengang pelarut organilk
tertentu.
Detektor indek refraksi, detektor ini mengukur
perubahan indeks refraksi eluen yang
disebabkan oleh adanya senyawa yang pada
K e p u st a k a a n .
waktu keluar dari kolom. Detektor ini tidak
dapat digunakan secara sefektif dengan elusi 1 . Caddy, B., 1991, The use of high
gradien karena adanya perubahan pada performance liquid chromatography for
baseline (perubahan indeks refraksi pelarut jika the detection and quanitation of abussed
gradien berubah) atau jika pelarut mempunyai drugs, Goglt, T., A., The Analysis of Drugs of
indek refraksi mendekati indeks refraksi zat Abuse, John Wiley & Sons, Chichester, 1 2 1
terlarut. Selain itu detektor ini sensitif terhadap - 174.
perubahan suhu. 2. Sriewoelan, S. 1988, Analisis Obat Dalam
Cairan Biologik, ITB, Bandung.
Dengan diketemukan Fourier transform infrared
(FTIR) spektrofotometer dimungkinkan 3. Moffat, A.C., et.all., (Ed), 1986,Clark's
digunakan sebagai detektor pada HPLC Isolation and Identification of Drugs in
detektor ini akan sangat berguna untuk Pharmaceuticals, Body Fluids, and Post-
memonitoring penyalahgunaan obat-obatan Mortenz Material, Second ed., The
karena dapat melakukan identifikasi absolut Pharmaceutical Press,London.
dari obat yang dianalisa. Spcetrum IR yang 4. Johnsan, E.L., Stevenson,R., 1991, Dasar
direkam digunakan sebagai dasar untuk uji Kromatografr Cair, Penerbit ITB, Bandung.
konfirmasi. 5. Skoog, D.A., Leary, J.J., 1992, Principles of
Instrumental Analysis, 4"' Ed., Harcourt
9.2. Analisis Obat Brace Publisher, New York.
Tidak semua analisis obat dapat dilakukan 6. Willard, H.H., et all.. 1989, Instrumental
dengan menggunakan HPLC, peryataan ini Methods of Analysis, Wadsbuorth
dikemukan oleh Gough dan Beker(2.3) yang Publising Company, California.
melaporkan penggunaan kromatografi untuk 7. Chamberlain, J., 1985, Analysis ofDrugs in
mendeteksi penyalahgunaan obat-obatan Biological Fluid, CRC Press Inc, Boca
sampai tahun 1983. Raton.
Analisis obat-obatan pada penyalahgunaan 8. United Nations, (1995) Recommended
obat harus mengikuti prototkol yang baku, dari methods for the detection and assay of
penyumpulan sampel sampai pada penanganan heroin, cannabinoids, cocaine,
Spektroskopi Massa 67
pengalaman yang panjang dalam pekerjaan (‘drugs”/obat ilegal) baik dalam bentuk sediaan
mencocokkan spektra. atau bahan baku maupun yang terdapat dalam
cairan biologi berada dalam konsentrasi yang
Untuk menghindari penyimpangan atau
sangat kecil dan dalam matriks yang sangat
kesalahan pembandingan spektrum yang tidak
kompleks. Oleh karena itu perlu prosedur “clean-
diketahui hasil dari pencarian data pustaka
up” atau pemurnian sebelum analisis MS.
biasanya ditunjukkan beberapa spektrum yang
Pemurnian dapat menggunakan teknik
hampir mendekati. Faktor ketepatan biasanya
kromatografi atau membuat derivatnya sebelum
dengan skala 0-1000 adalah menampilkan
dikromatografi untuk meningkatkan kinerja
spektrum yang tepat/cocok dan mengukur
kromatografi. Seperti contoh asam dapat dirubah
kedekatan antara spektrum senyawa yang tidak
menjadi bentuk metil esternya dan barbiturat
diketahui dengan spektrum data pustaka.
dalam bentuk metil-barbiturat.
Penghitungan didasarkan atas perbedaan
intensitas antara ion-ion yang tepat/cocok dalam Untuk analisis kuantitatif sebaiknya digunakan
spektra yang sesuai. Beberapa sistem ini juga internal standard yang sesuai, seharusnya
menampilkan faktor kemurnian. Faktor ini mempunyai sifat kimia yang sama dengan analit
dihitung dari puncak spektrum senyawa yang hal ini sangat penting jika dilakukan derivatisasi.
tidak diketahui, tidak terdapat dalam spektrum Internal standard yang ideal adalah isotop
pembanding dan dapat menunjukkan adanya berlabel yang analog dengan analit,
pengotor atau pengganggu. Pada kasus ini faktor bagaimanapun juga sebelum pemilihan isotop
ketepatan yang bagus dengan faktor kemurnian analog yang spesifik beberapa faktor harus
rendah menunjukkan ketidak tepatan atau ketidak dipertimbangkan seperti: massanya berbeda,
benaran. kemurnian isotop, dan karakteristik fragmentasi
spektrum massanya.
10.5. Analisis Beberapa Kelompok Obat
Pada sub bab ini dikhususkan pada pembahasan
analisis obat-obat yang sering disalahgunakan
Tabel 10. 1. Spektrum massa kanabis yang karakteristik
Senyawa Model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z)
CBN EI 310, 295, 238
CBD EI 314, 299, 258, 246, 231
∆9-THC EI 314, 299, 258, 246, 231, 193
Kanabinoid (umum) EI 314, 299, 271, 258, 246, 243, 231
THC-COOH, metilasi EI 372, 357, 313
THC-COOH, metilasi, deuterasi, IS EI 375, 316
THC-COOH trimetilsilil EI 488, 473, 371
THC-COOH trimetilsilil, deuterasi, IS EI 491, 374
THC-trifluoroasetil CI negatif (hidrogen/metana) 410
THC-trifluoroasetil, deuterasi, IS CI negatif (hidrogen/metana) 413
THC-COOH trifluoroasetil CI negatif (hidrogen/metana) 454
THC-COOH trifluoroasetil, deuterasi, IS CI negatif (hidrogen/metana) 457
THC-OH, trifluoroasetil, IS CI negatif hidrogen metana) 409
THC-OH, trifluoroasetil, deuterasi, IS CI negatif (hidrogen/metana) 412
THC EI 314,2
THC, deuterasi, IS EI 317,2
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991)
A. Kanabis scaning berulang. Dengan cara ini semua
komponen dari kanabis dapat diamati dalam tabel
Pada analisis kanabis dari produk ilegal dalam
10.1. Analisis statistikal dapat dilakukan dengan
bentuk simplisia, hasis, dll, dapat dilakukan
mengadakan intensitas ion-ion terpilih. Apabila
secara langsung. Beberapa mg produk langsung
ingin mendeteksi adanya campuran kanabinoid
dimasukkan ke dalam inlet probe kemudian
dapat dilakukan dengan membandingkan
diperoleh spektrum total. Ion-ion yang
spektrum sampel dengan spektrum kontrol
karakteristik dapat diperoleh dengan melakukan
kanabinoid. Cara ini digunakan atau konfirmasi
Spektroskopi Massa 68
adanya daun, resin atau cairan dari kanabis dan terkonyugasi dengan asam glukoronat. Analisis
pembandingan sampel berlainan didasarkan atas THC-COOH sebagai metabolit primer dari
perbedaan konsentrasi. kanabinoid menggunakan MS diperlukan
pemurnian sebelum dianalisa. Berbagai metode
Untuk memperoleh data spektrum dari masing-
ekstraksi dapat diterapkan seperti ekstraksi
masing kanabinoid sebelum injek ke inlet MS
menggunakan pelarut organik karena
sebaiknya dilakukan proses pemurnian baik
dikeringkan, atau menggunakan ekstraksi fase
menggunakan GC atau HPLC. Pada analisis
padat. Sebelum dimasukkan ke inlet MS
menggunakan GC kanabinoid terlebih dahulu
metabolit tersebut dipisahkan dengan
dibuat sebagai turunannya dengan sililasi.
kromatografi (GC/HPLC). Analisis
Beberapa kanabinoid sangat tidak stabil pada
menggunakan GC-MS, THC-COOH dibuat dalam
GC sehingga harus segera dianalisis GC
berbagai derivatnya seperti derivat metil ester
setelah sililasi dan memerlukan penanganan
menggunakan iodometan dan tetrametil
khusus. Pemurnian menggunakan HPLC
hidroksida; derivat trimetilsilil menggunakan
seperti mengatasi masalah termolabil dari
N,O, bis-(trimetilsilil) trifluoroasetat (BSTFA)
kanabinod sehingga dapat langsung
ditambah 1% trimetilklorosilan (TMCS).
menganalisis kanabinoid.
Analisis kuantitatif internal standard seperti
Kanabis pada rokok dapat langsung dianalisis
oksigen butana, isotop deuterium dari THC-
dari kondensat asapnya menggunkan GC-MS.
COOH. Pada analisis GC-MS dengan
Kanabinoid (CBD), ∆9 THC dan CBN dapat
menganalisa THC-COOH sebagai derivat metil
dideteksi langsung sebagai turunan trimetilsilil.
ester dengan metan-kimia ionisasi,
Penetapan kanabinoid dalam cairan biologi
menunjukkan spektrum MS prominan ion
ditentukan sebagai metabolit kanabinoid. Di
molekuler terprotonisasi pada m/z 378. Sebagai
dalam urine ditentukan sebagai metabolit
derivat trimetilsilil menggunakan BSTFA
utama dari THC yaitu asam 11-nor-∆9-THC-9
diperoleh ion metastabil m/z 371 sesuai dengan
karboksilat (THC-COOH). Metabolit ini
M+ Æ (MCH3)+ dalam spektrum derivat THC.
diekskresi sebagai bentuk bebasnya atau
B. Opiat
Analisis opiat menggunakan MS senyawanya seperti dilihat pada tabel 10.2.
Tabel 10. 2. Spektrum massa opiat yang karakteristik
Senyawa model ionisasi ion-ion yang diamati (m/z)
Diamorfin EI 369 (M+), 327. 310, 268
Diamorfin CI (Isobutana) 370 (MH+), 310, 268
Asetilkodein CI (Isobutana) 342, 282
kofein CI (Isobutana) 195
Diamorfin CI (Nitrogen/10% oksida nitrat) 370 (MH+), 327, 310, 268,
6-asetilmorfin, pentafluoropropionil EI 473
6-asetilmorfin, propionil EI 384, 383, 324
6-asetilmorfin, propionil, deuterasi, IS EI 389, 333
Asetilkodein EI 341, 282
Morfin, trifluoroasetil CI (Asetonitril) 478, 364
6-asetilmorfin, trifluoroasetil CI (Asetonitril) 424, 364
Kodein, pentafluoropropionil EI 445, 282
Nalorfin, penta-fluoropropionil, IS EI 603, 440
Morfin, trifluorosetil EI 477, 364
Kodein, trifluorosetil EI 395, 282
Nalorfin, trifluoroasetil, IS EI 503, 390
Morfin, pentafluoropropionil EI 577,414, 361
6-asetilmorfin, pentafluoropropionil EI 473, 414
Morfin EI 268, 256, 242, 228, 215
EI =“elektron impact”(tumbukan elektron), CI=“Chemical ionization” (ionisasi kimia), IS=“internal standard
“(baku dalam) Dikutif dari: Huizer, H., (1991).
Presentasion:
1. Die Entwicklung der Drogenproblematik in Indonesien und Deutschland am Beispiel
der BTM-Befunde der forensischen Institute in Denpasar und Göttingen.
“Möglichkeiten und Grenzen der Befundinterpretation“, Poster presentation 80th
International Conference of German Legal Medicine Society in Interlaken,
Switzerland, 2001
2. Möglichkeiten und Grenzen der rechnerischen Simulation der Pharmakokinetik des
Heroins im menschlichen Körper“, Oral Presentation in 81th International Conference
of German Legal Medicine Society in Rostock, Germany, 2002
3. “Rechnerische Simulation der Pharmakokinetik der Opiate im menschlichen Körper zur
Unterscheidung einer Codeinaufnahme von einem Straßenheroinkonsum” Oral
Presentation in 82th International Conference of German Legal Medicine Society in
Münster, Germany, 2003
4.