F -X C h a n ge F -X C h a n ge

PD PD

LABORATORIUM
!

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
MIKROBIOLOGI
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

Diani Sri Hidayati, S.Si., M.Si

Sabariah, S.Pd., M.Biomed

FAKULTAS
KEDOKTERAN
UNIZAR
LABORATORIUM TERPADU 1
Gd. LABORATORIUM TERPADU 1 lt. 1
Jl. Unizar No.20 Turida, Cakranegara
Mataram
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

KULTUR BAKTERI
DASAR TEORI

Berbagai jenis media pertumbuhan bakteri lazim digunakan untuk tujuan isolasi, transportasi,
persemaian dan diferensiasi. Untuk menunjang pertumbuha n yang optimal, bakteri membutuhkan nutrisi
yang amat beragam. Sebagian bakteri dapat tumbuh dalam medium yang hanya mengandung zat anorganik,
sedangkan bakteri tertentu memerlukan tambahan asam amino, vitamin dan zat organik lain untuk
pertumbuhannya. Media pembiakan bakteri umumnya terdiri dari ekstrak daging, ekstrak ragi, pepton dan
agar.

Berdasarkan konsistensinya, media pembiakan bakteri dapat dibagi menjadi media cair, media padat
dan semi solid. Kaldu nutrisi (pepton dan ekstrak daging) dan agar nutrisi (pepton, ekstrak daging dan
agar)merupakan contoh medium cair dan padat yang sering digunakan. Berbagai komponen dapat
ditambahkan ke dalam medium untuk menghasilkan medium dengan sifat tertentu. Sebagai contoh,
penambahan zat warna dapat digunakan untuk indikator aktivitas metabolisme bakteri.

Untuk menumbuhkan bakteri yang membutuhkan nutrisi tinggi (fastidious microorganisme), medium
dapat diperkaya dengan menambahkan darah, serum, vitamin dan komponen-komponen lain. Medium
tersebut termasuk dalam medium di perkaya, contoh medium tersebut adalah agar darah. Isolasi bakteri
menggunakan medium selektif yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri secara selektif. Medium yang
termasuk dalam medium selektif adalah agar Salmonella Shigella (SS).

Meddium lain yang menggunakan untuk membedakan beberapa jenis bakteri disebut medium
diferensial, medium yang banyak dikembangkan pada anak saat ini memiliki sifat selektif dan diferensial.
Contoh medium tersebut adalah agar Eosin Methylene Blue (EBM). Bila pengambilan spesimen di luar
laboratorium, maka untuk mencegah kematian bakteri, spesimen dapat ditanam pada medium transpor
sebelum dipindahkan pada media pertumbuhan yang diperlukan. Contoh medium transpor yang sering
digunakan di laboratorium antara lain Carry-Blair, Amies dan Stuart.

Tabel 1. Kegunaan berbagai medium untuk pembiakan bakteri dan jamur

Media Agar Padat (1,5 – 2% Agar)

No Media Kegunaan
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

1 Agar Nutrien Mnegasingkan/mempelajari koloni bakteri

Membiakkan bakteri yang memerlukan nutrisi tinggi dan melihat

2 Agar Darah
adanya reaksi hemolysis

Agar Coklat
3 Medium selektif untuk membiakkan Neisseria sp
Thayer Martin

Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan bakteri

4 Agar Endo
enteric

Agar Eosin
Medium selektif dan deferiansal untuk membiakkan bakteri
5 Methylene Blu
enteric
(EBM)

Agar Salmonella Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan Salmonella

6
Shigella dan Shigella

Agar Thiosulphate
Medium selektif dan diferensial untuk membiakkan Vibrio
7 Citrate Bile
cholerae dan Vibro sp. Lainnya
Sucrose (TCBS)

8 Serum Loeffler Membiakkan Corynebacterium diphteriae

9 Agar Darah Telurit Medium selektif untuk membiakkan Corynebacterium sp

Triple Sugar Iron Melihat kemampuan bakteri dalam meragi gula-gula dan
10
Agar membentuk H S

Lowenstein
11 Mebiakkan Mycobacterium sp
Jensein

12 Agar Sabouraud Membiakkan koloni jamur

Media Cair
No Media Kegunaan

1 Kaldu Membiakkan bakteri atau membuat suspensi bakteri

2 Kaldu Darah Membiakkan bakteri dan melihat hemolysis bakteri

3 Air Pepton Membiakkan bakteri dan membuat suspensi bakteri

 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

Perbenihan
4 Membiakkan bakteri anaeerob
Tarozzi
Perbenihan Perbenihan transpor dan permsemaian untuk bakteri aerob dan
5
Thioglikolat anaerob

Perbenihan
6 Membiakkan bakteri enteric terutama untuk Salmonella sp
Empedu
7 Gula Air Pepton Mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi gula.
Gula yang digunakan :
a. Glukosa (tutup tabung berupa kapas berwarna kuning)
b. Laktosa (tutup tabung berupa kapas berwarna ungu)
c. Manitol (tutup tabung berupa kapas berwarna hijau)
d. Maltosa (tutup tabung berupa kapas berwarna merah)
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

TUJUAN

- Untuk mendeteksi bakteri pada dahak

ALAT DAN BAHAN

Bunsen

Korek api

Cotton swab

Media agar

Inkubator
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

LANGKAH KERJA

• Nyalakan Bunsen

• Ambil specimen dahak dengan cottob swab

• Oleskan cotton swab tsb pada permukaan media agar.

• Inkubasi selama 24 jam pada suhu 37’C

Hasil

Amati minimal 24 jam setelah inkubasi untuk melihat ada tidaknya pertumbuhan koloni bakteri. Jika ada
gambar dan foto.

Contoh pertumbuhan koloni bakteri pada berbagai media:

 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

Gambar pertumbuhan berbagai spesies bakteri pada media agar darah (Blood Agar Plate/BAP)

Gambar pertumbuhan koloni pada media NA Gambar pertumbuhan koloni M. Tuberculosis pada media LJ
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

UJI SENSITIVITAS/RESISTENSI
ANTIBIOTIK
DASAR TEORI

Uji kepekaannya bakteri terhadap antibiotik dilakukan pada isolat yang mungkin merupakan penyebab
infeksi. Bila suatu isolat telah diketahui sifat kepekaannya terhadap antibiotik tertentu, maka uji kepekaan
tidak perlu dilakukan. Sebagai contoh uji kepekaan Streptococcus beta-hemolitikus terhadap penisilin tidak
perlu dilakukan secara rutin karena sampai saat ini penisilin masih merupakan obat pilihan untuk isolate
tersebut. Beberapa tahun yang lalu, oxasilin merupakan obat pilihan untuk Staphylococcus aureus, tetapi
pada saat ini harus dilakukan uji kepekaan karena telah ditemukan isolate yang resisten terhadap bakteri
tersebut.
Metode uji kepekaan antibotik dan pemilihan jenis antibiotik yang diuji maupun cara interpretasinya
diatur dalam standar yang disusun oleh berbagai Negara. Pada umumnya leboratorium mikrobiologi di
Indonesia menggunakan standar CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) yang disusun di
Amerika Serikat dan selalu direvisi setiap tahunnya.
Uji dapat dilakukan dengan metode difusi cakram atau dilusi tabung. Metode dilusi dapat memberikan
hasil Konsentrasi Hambat Minimal (KHM=Minimum Inhibitory Concentration/MIC), sedangkan metode
difusi cakram akan memberikan hasil sensitif, intermediate atau resisten berdasarkan diameter zona hambat.
Metode difusi cakram lebih banyak digunakan secara rutin karena biaya operasional yang jauh lebih murah.
Hasil dari kedua metode tesebut dapat membantu klinisi untuk menentukan pengobatan.
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi hasil uji kepekaan, antara lain ketebalan media, kekeruhan
suspensi bakteri yang digunakan, konsentrasi antibiotic yang digunakan, suhu dan lama inkubasi. Hasil
dibaca dengan mengukur diameter zona inhibisi yang terjadi setelah masa inkubasi (dalam mm). Hasil
pengukuran dicocokan dengan tabael CLSI untuk menentukan isolat sensitive, intermediate atau resisten
terhadap antibiotic yang diujikan.

1. Metode Difusi Cakram (Disk Diffusion Method/ Kirby Bauer Method)

Prinsip pemeriksaan
Menggunakan cakram kertas saring yang telah mengandung antibiotik dengan kadar tertentu dan
diletakkan diatas lempeng agar Muller-Hinton yang telah dinokulasi bakteri. Diameter zona hambat
pertumbuhan bakteri yang tampak menunjukkan adanya kepekaan bakteri tersebut terhadap antibiotik
bersangkutan. Penilaian terhadap zona hambat dilakukan dengan membandingkan besarnya diameter zona
hambat (dalam mm) dengan tabel standar interpretasi diameter zona hambat dan MIC (CLSI terbaru). Hasil
penilaiannya berupa sensitive, resisten dan intermediate.

Sensitif : apabila diameter zona hambat diameter zona hambat standar.

Intermediate : Apabila diameter zona hambat diantara resisten dan sensitif
Resisten : Apabila diameter zona hambat diameter zona hambat standar
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

Tabel kriteria zone hambatan obat (CLSI)

NO NAMA ANTIBIOTIK Potensi Disc R I S
1. Ciproploxacin 5 ug 15 16 - 20 21
2. Ampicillin 20/10 ug 19 - 20
Trimethoprim-
3. 23,75 ug 10 11-15 16
Sulfamethoxazole
4. Cefaadroxil 30 ug 14 15 -18 19
5. Mecillinam 25 ug 8 8 -15 16
6. Bactrim 25 ug 10 11-15 16
7. Negram 30 ug 13 14 -18 19
8. Gentamycin 10 ug 12 13 -14 15
9. Amoxil 25 ug 18 - 18
10. Augmentin 20/10 ug 19 - 20

2.Metode Dilusi Tabung (Tube Dilution Method)

Prinsip pemeriksaan
Pada metode ini dilakukan pengenceran antibiotik dalam tabung-tabung reaksi untuk menentukan
konsentrasi antibiotik terendah yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri atau yang disebut bagai
Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) atau MIC (Minimal Inhibitory Concentration). Tabung dengan
pertumbuhan bakteri akan terlihat keruh; bila terjadi hambatan, medium di dalam tabung akan terlihat jernih
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

TUJUAN

1. Memahami berbagai metode untuk uji kepekaan bakteri terhadap antibiotik.

2. Melakukan interprestasi hasil uji kepekaan bakteri terhadap antibiotik

ALAT DAN BAHAN

1. Pinset kecil/disc dispenser

2. Cotton swab
3. Kaldu BHI
4. Biakan bakteri
5. Lempeng agar Mueller Hinton (MH) berdiameter 10 cm
6. Cakram antibiotik
7. Kapiler/penggaris dengan skala ukuran mm
8. Tabel standar interpretasi diameter zona hambat

LANGKAH KERJA

1.Buat suspensi bakteri dalam kaldu BHI. Suspensi disesuaikan kekeruhannya dengan standar
kekeruhan Mac Farlan 0,5
2. Pada lempeng agar MH usapkan suspensi kuman tadi dengan swab kapas steril
secara merata.
3. Dengan pinset yang telah disterilkan diatas api, ambil cakram antibiotika yang
tersedia dan letakkan diatas lempeng agar yang telah ditanami kuman.
4. Inkubasi lempeng agar tersebut dalam inkubator selama 18-24 jam.
5. Setelah 24 jam, ukur zona hambat yang terbentuk (dalam mm)
HASIL

Interpretasi hasil
a. Diameter zona hambat diukur dengan menggunakan caliper atau penggaris pada zona yang jernih.
b. Pembacaan dan interpretasi kepekaan mengikuti petunjuk tabel yang dibuat oleh CLSI

Jenis Antibiotik Lebar Zona Hambat/ Interpretasi hasil berdasarkan

Berdasarkan Tabel CLSI
 F -X C h a n ge F -X C h a n ge
PD PD

!
W

W
O

O
N

N
y

y
bu

bu
to

to
k

k
lic

lic
C

C
w

w
m

m
w w
w

w
o

o
.d o .c .d o .c
c u -tr a c k c u -tr a c k

A ……… mm
(S / I / R*)
B ……… mm
(S / I / R*)
C ……… mm
(S / I / R*)

D ……… mm
(S / I / R*)

DAFTAR PUSTAKA

Jawetz, Melnick, Adelberg’s. 2013. Medical microbiology. 25th ed. Appleton and Lange. California.

Mohon CR, Manuselis G. 1995. Diagnostic microbiology. WB Saunders Comp. LondoN.

Staf pengajar Departemen Mikrobiologi FKUI. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kedokteran, PT
Medical Multimedia Indonesia. Jakarta.

CLSI M100-S21. 2011. Performance standard for antimicrobial susceptibility testing: Twenty-first
information supplement. USA.
Hindler JF. Munro S. 2004. Antimicrobial susceptibility testing. Dalam: Isenberg HD. Clinical
microbiology procedure handbook. Edisi ke-2. ASM Press. Washington DC.
Discipline of Microbiology and Immunology. 2010. Laboratory Manual: Antimicrobial Agent. Discipline
of Microbiology and Immunology University of Western Australia, Perth.

O'Connor, L. 2010. Introduction to bacterial pathogens. Discipline of Microbiology and Immunology

University of Western Australia, Perth