Edisi online semester108/2018

Metodologi

Lokasi Praktikum
Lab. Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA UNIMA

Waktu Pelaksanaan
Tgl 5 - 26 November 2021

Alat dan Bahan

Prosedur Kerja

1. Selesai praktikumalat-alat(cawanpetri, tabungreaksi, erlenmeyer) harus dicuci bersihdan

dikeringkan untuk disterilisasikan kembali padsakhirminggu
(atausebelumpraktikumberikutnyadilaksanakan).
Setelahsterilperalatandisimpanpadstempatnya.
2. Alat-alat pipet, corong, gelas pengadung, dll, yang sudah dibersihkan dan masih
diperlukanlagi(lebihdarisatukali),jangandiletakkandiatasmeja,letakkandiataspenyangga /baki.
3. Bilaadakerusakanalatatauhilangnyaalat-alatakibatkesalahanpraktikan,makapraktikan
(kelompok praktikum) diwajibkan menggantinya berupa alat / uang dalam waktusatu
bulansesudahnya.
4. Padaalat-alatgeglassetiappercobaan, harusdituliskan tanggalpraktikum,dannamaanggota
kelompokpraktikumdanangkatanmahasiswa.

i
 Edisi online semester108/2018

1. STERILISASIDANTEHNIKASEPTIS

Sterilisasiadalahsuatuusahaatautindakanuntukmembebaskanalatataumediadarimikrob
a.Halinidiperlukan agar mikrobayangingindiamatiterbebasdarimikrobalain.
Sterilisasiterdiridaribeberapacara.Pemilihancarasterilisasiditentukanberdasarkansifatalatataubahan
yang akan disterilisasi dan tujuan sterilisasi. Secara umum sterilisasi dapat dilakukan dengancara:
1. Mekanik:denganfiltrasiataupenyaringan
2. Fisika :denganpemanasandanpemberiantekanan
3. Kimia :denganpemberiandesinfektan
1. SterilisasiSecaraMekanik
Sterilisasi ini dilakukan terhadap bahan-bahan cair yang sangat peka terhadap
pemanasan.Dilakukan dengan menggunakan filter (penyaring) bakteri. Terdapat beberapa jenis
filterantaralain :
a. Berkefeldfilter
ElemenpenyaringanyangterbuatdaritanahdiatomaedenganporositasV(viel=kasar),N(normal)
dan W (wenig = halus). Untuk tujuan sterilisasi ini pada umumnya
digunakanporositasNdanW.
b. Chamberlandfilter
Elemen penyaring berupa porselin tanpa email. Porositas filter L 1,L2, L3. Porositas
yangdigunakanuntukmenyaringbakteriadalahL3yangsetaradengantipeNpadaBakerfeldfilter.
c. Seitz filter
Alatpenyaringdaristainlesssteeldenganfilterasbes-selulosa.

Gambar1
Gambar1.Prosedursterilisasijarumose
2. SterilisasiSecaraFisika
Cara ini digunakanuntuk mensterilkan alat/bahan yang tahan panas, tekanan atau
radiasi.Sterilisasiinidapatdilakukan dengancara :
a. Pemanasankering
Sterilisasi menggunakan lampu spiritus atau bunsen, untuk alat alat seperti pinset jarum
ose,ujung pipet, bibir tabung reaksi/erlenmeyer/cawan petri. Cara lain menggunakan oven
suhu175oCselama1,5-2jamuntukalat-alatseperticawanpetri,botolataubahansepertitepung,talk
dansebagainya.
b. Pemanasanbasah
Carainidapat dilakukandenganperebusan,penggunaanuapairpanas,penggunaan uap

1
 panasbertekanan(menggunakanautoclave)ataupasteurisasi.
c. Radiasi
Menggunakansinar UV,sinar dan sebagainya untuk sterilisasi ruangan
laboratorium,entkasataualat-alatgelas.
d. Senyawakimia
Senyawa kimia yang dapat digunakan untuk sterilisasi antara lain alkohol 70%,
fenol,formalin 4%, deterjenmaupun karbol.

Gambar2.Prosedurpemindahanisolatbakteri
Bekerja dengan mikroorganisme membutuhkan tehnik aseptis untuk mencegah
ataupunmengurangi kontaminasi yang tidak diinginkan. Karena setiap benda yang digunakan maupun
pekerjadi laboratorium dapat menjadi sumber kontaminasi.Prosedur umum dalam tehnik aseptis
meliputiantaralain:
a. Disinfeksi area kerja.Meja yang akan digunakanterlebih dahulu diberi disinfektan
untukmembunuh mikroorganisme yangada.
b. Jarum ose (loop). Pemindahan mikroorganisme dari kultur cair maupun padat ke medium
lainmembutuhkanjarumose(loop).Sterilisasidapatdilakukandenganmembakarjarumtersebut
pada api bunsen sehingga berwarna merah. Sterilisasi ini dilakukan sebelum maupunsetelah
jarumdigunakan.
c. Mulut tabung.Sterilisasi mulut tabung reaksi atau erlenmeyer dapat dilakukan
denganmembakarmuluttabungstelahtutupkapasdibukadansesaatsebelummenutupnyakembali.
d. Cawan petri. Sebelum cawan petri dibuka untuk melakukan inokulasi maupun setelah
ditutup,tepi cawan petri dilalukan di api bunsen. Selama inokulasi,bagian cawan petri yang
terbuka,didekatkan keapibunsenuntuk mencegah kontaminasikarenaudara.

Tujuan:Mengetahuiberbagaicarasterilisasialatmaupunmedia
LATIHAN1. MENYIAPKAN,MEMBERSIHKANDANMENSTERILKANALAT

Tujuan: Untukmengenalalat-
alatyangdipergunakanpadapraktikummikrobiologi,alatsterilisasidancara
penggunaannya.

PeralatanUmum
 Refrigerator(lemades)untukpenyimpananbahankimiadanmedianutrien.
 Ent-Kast
 Otoklafataupressurecooker.
 KomporGasdanLampuSpiritus.
 Timbanganbiasadenganakurasi0,01gr.Mikros
kop.
 Raktabungreaksi.
 Spatula untuk pengaduk dan penimbangan
bahan.Jaruminokulasiyangruncingdanbolong.Vor
tex.
 Penghitungkolonibakteri.
 Tempatpenyimpananuntukalat-alatgelasyangtelahdisterilkandanmedianutrien.
 Kapas,aluminiumfoil,plasticwrap,kertasisap.
 Baki,plastik,spidol,kertaslabel,kainlap/serbet.

Alat-alat Gelas
 Cawanpetri
 Tabungreaksi.
 Gelas/labuerlenmeyer.
 Gelasukur.
 Coronggelas.
 Pipetukurdanpipetplastik.
 Kacabendsdankacapenutup.

Bahan-bahan
 Alkohol70%dan90%,spiritus.
 Aquadessteril.
 Desinfektan(karbol,lisol,spiritus,formalin,betadine,d1l)
 Bermacam-macamzatwarnsuntukpewarnaan.-
Bahan-bahanmediapertumbuhanmikroba(agar).

CaraKerja
1. Siapkancawanpetri,tabungreaksi,gelaskimia,erlenmeyer,gelaspengaduk.
2. Bersihkanalat-alatgelastersebutdengansabun/detergen,kemudiankeringkan.
3. Bungkuslahdengankertaskoran,laludiikatdenganbenang kasur.
4. Sterilisasikanalat-alattersebutsesuaidenganjenisnyayangtelahdijelaskandiatasdalamoven
suhu160–180OCselama 1-2 jam.
2. PEMBUATANMEDIA

Setiapmikrobamelakukanmetabolismeuntuktumbuhdanberkembangbiak.Halinimenyangkutpen
gambilannutrisiyangberasaldarilingkungandanprosesmetabolismenutrisitersebutsesuaidengankebutuha
nnya.
Kebutuhan nutrisi mikroba sangat beraneka ragam, namun pada umumnya media
untukmenumbuhkanmikrobaharusmenyediakanair,senyawasebagaisumberenergidankondisilingkungan
yang sesuai (pH, suhu, tekanan osmose dan sebagainya). Oleh karena itu, untuk tujuanisolasi ,
identifikasi dan pembiakan mikroba di laboratorium, maka media yang digunakan
harusmemenuhipersyaratandalamhalkomposisinutrisi,tidakmengandungsenyawaantimikroba,memilikip
H,kadar air,dan tekanan osmoseyang sesuai, selainitu mediajugaharussteril.

KlasifikasiMedia
1. Berdasarkankonsistensinya
- Mediacair:digunakanuntukmembiakkanmikrobadalamjumlahbesar,
keperluanfermentasidanberbagaiuji.Misalnyakaldunutrien,kalduglukosa dsb.
- Media padat:dibuat dengan menambahkan agar pada media cair (12-15
g/l),digunakan untuk membuat biakan murni, mengamati morfologi koloni,
danmenghitungjumlahkoloni.Misalnya,agarnutrien,agarkentangdekstrosadsb.
- Mediasetengah padat (semi solid) : dibuat dengan menambahkan agar
padamedia cair dalam jumlah lebih sedikit dibandingkan dengan agar untuk
mediapadat(3-8g/l).Umumnyadigunakan untuk mengujimobilitassel.

2. Berdasarkankomposisibahanmedia
- Mediasintetik:Komposisikimiamediadiketahuidenganpastidanadadalamtingkatkemurnian
yangtinggi.Misalnya :mediaCzapek’s DoxAgar
- Mediasemi-
sintetik;Mediaterbuatdaribahankimiayangdicampurdenganbahanalami,misalnyamedia
agarkentangdekstrosa.
- Medianonsintetik:mediaterbuatdaribahanalamidantidakdiketahuidenganpastikomposisikimiany
a.Misalnya :tanah, nasi, daun-daunan.

3. BerdasarkanFungsi
- Media umum : media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba secara umum,
misalnyamediaagar nutrien untukbakteridan mediaagar kentangdekstrosauntuk jamur.
- Mediaselektif,mediayangmengandungsenyawatertentudanbersifatselektifuntukmencegahpertu
mbuhanmikrobayangtidakdikehendaki.MisalnyaagarEndountuk Escherichiacoli.
- Media diferensial , media mengandung senyawa tertentu sehingga mikroba yang
diharapkandapat tumbuh dengan menunjukkan perubahan pada media secara spesifik,
berbeda denganmikrobalain.Misalnyaagarpati,agarEosinBiru Metilen.
- Media pengaya atau penyubur : media digunakan untuk menumbuhkan mikroba
denganmaksudmenyuburkanmikroba tersebut.Hal ini umumnya
dilakukansebelumdigunakanuntuk ujifisiologisatauuntuk starterfermentasi.

Tujuan:Mengetahuijenis-jenismediadancarapembuatannya

Jenis-jenis media

1. MediaDagingSegarCair(NutrientBroth/NB)

Bahan:
Dagingsapitanpalemak 500
gPepton 10g
 NaCl 5g
Akuades 1000ml
Carakerja:
Daging sapi dicuci bersih dan dipotong kecil-kecil (digiling). Kemudian tambahkan akuades
dansimpandalamlemariesselamalebihkurangsatumalam.Selanjutnyadipanaskanhinggamendidih dan
biarkan selama 20 menit.Kaldu yang diperoleh di disaring dengan kapas atau kainkasa beberapa
kali hingga jernih. Tambahkan akuades hingga volumenya menjadi 1000 mL.Masukkan pepton dan
NaCl kedalam air kaldu dan panaskan kembali hingga larut. Media yangtelah siap dimasukkan
kedalam tabung reaksi atau erlenmeyer sesuai penggunaan. Tutuplahtabung dan erlenmeyer
tersebut dengan kapas. Kemudian bungkus dengan kertas dan diikat.Sterilkan denganautoklaf
pada suhu 121oCselama15-20 menit.
Untuk pembuatan medium agar, dilakukan prosedur yang sama, hanya larutan kaldu
ditambahagar 15 – 20 g/l kemudian dimasak hingga medidih dan agar larut (media tampak
jernih).Selanjutnyadisterilkandenganautoklafpadasuhu
121oCselama15-20menit.

2. MediaAgarNutrien(NutrientAgar/NASintetis)

Bahan:
NutrientAgar 15–20g
Akuades

1000mlCarakerja:
Timbang nutrient Agar sebanyak 15 – 20 g untuk setiap liter larutan (atau sesuai pentunjuk
dalamkemasan).Larutkan agar dalam akuades, kemudian didihkan sambildiaduk sampaiagar
larut.Ukur pH agar tetap netral (6 -7). Sesuaikan dengan menambahkan HCl 0.1 N atau NaOH 0,1
N.Tempatkan dalam tabung reaksi atau erlenmeyer sesuai penggunaan, kemudian tutup
dengankapas.
Sterilkandenganautoklafpadasuhu121oCselama15-20menit.

MediaAgar KentangDekstrosa(PotatoDextroseAgar /PDA)

Bahan:
1. Kentang 500g
2. Dekstrosa/Sukrosa 20 g
3. Agar 15-20g
4. Akuades 1000
mlCarakerja:
Kentang dikupas, dicuci bersih dan dipotong kecil-kecil lalu direbus dengan
akuades,volumedijagaagartetapkonstandenganpenambahanakuades.Ekstrakselanjutnyadisaringbe
berapakali dengan kapas hingga jernih. Filtratyang dihasilkandicampur dengan agar dan
dekstrosa,dipanaskan hingga mendidih dan semua agar larut. Ukur pH skitar 6 -7. Masukkan
dalam tabungreaksiatau erlenmeyersesuaipenggunaan, kemudiantutupdengankapas.
Sterilkandenganautoklafpadasuhu121oCselama15-20menit.
3. ISOLASIMIKROBADARILINGKUNGAN

Mikroorganisme berada diberbagai lingkungan di sekitar kita (tanah, air, makanan,

tubuhorganisme lain dsb.). Salah satu cara untuk mendapatkan mikroba yang berasal dari
lingkunganadalah dengan mengkontaminasi medium steril dengan hembusan nafas, jari tangan, air,
maupunudara lingkungan. Mikroba yang melekat pada medium selanjutnya akan tumbuh dan
berkembangbiak dandapatdiamatidalambentukkoloni.
Mikroorganisme jarang terdapat dalam keadaan murni. Kebanyakan merupakan
campuranberbagai spesies. Untuk mempelajari morfologi dan fisiologi spesies, maka perlu dilakukan
isolasi
danpembuatankulturmurnidilaboratorium.Isolasimikroorganismeadalahprosesmemisahkanmikroorgani
sme dari lingkungannya di alamdan menumbuhkannya sebagai biakanmurni.
Padaumumnyaterdapatduametodeyangdigunakanuntukmengisolasimikroorganismekhususnyabakteri:

1. StreakPlateMethod(MetodeCawanGores)
Cara ini pada dasarrnya dilakukan dengan menggoreskan suspensi bahan yang
mengandungbakteri pada permukaan medium yang sesuai dalam cawan Petri. Setelah proses
inkubasi, maka akantumbuh koloni yang terpisahpada bekas goresan. Koloni terpisah ini mungkin
berasal dari satu selsehinggadapatdimurnikanlebihlanjut.

2. PourPlateMethod(MetodeCawanTuang).
Metode ini dilakukan dengan menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada
suhulebih kurang 50oC dengan suspensi bahan yang mengandung mikroorganisme dan
menuangkannyake dalam cawan petri steril. Setelah inkubasi akan terlihat koloni yang tersebar di
permukaan agaryangmungkinberasaldarisatu selbakteri,sehinggadapatdiisolasilebih lanjut.

LATIHAN1.PENGAMATANMIKROORGANISMELINGKUNGAN

Tujuan:Mengetahuiadanya mikroorganismeyangadadilingkungansekitar

Bahan :
1. MediumNutrientAgarsterildalamcawanpetri(medialempeng)
2. Lidikapas(cottonbuds)steril

Cara kerja:
1. Bukalah salah satu tutup cawan petri yang berisi medium, hembuskan nafas ke
permukaanmedium.Tutupkembalicawanpetri.
2. Ambilcawanpetrikedua,bukatutupnyadanletakkanjaritanganperlahan-lahandipermukaan
media. Jangan ditekan, karena akan membuat media rusak. Angkat jari tangandan
tutupkembalicawanpetri.
3. Ambil cawan petri ke tiga, buka tutup cawan petri, letakkan di tempat ramai beberapa
saatdalam keadaanterbuka.Tutupkembalicawan petri.
4. Untuk cawan ke empat, ambillah lidi kapas steril, goreskan sejenak pada lingkungan
yanganda inginkan (mis : kulit, rambut, meja dll). Buka tutupcawan petri, goreskan lidi
kapasyangtelahterkontaminasipadapermukaanmediasecaraaseptis.Tutupkembalicawanpetri.
5. Inkubasikan seluruh cawan petri yang telah diberi perlakuan tadi selama 24 jam pada
suhuruang.
6. Amati koloni yang tumbuh : jumlah, bentuk, diameter (pergunakan penggaris dan
nyatakanukuran tersebut dalam mm), warna, tepian, elevasi. Gunakan literatur tentang
pengamatankolonibakteri.
7. Gambardanbuathasilpengamatanandadalamtabelpengamatan.
8. Tabelpengamatan
Jumlahkolonidari...(sebutkansumbernya)=....................koloni
Cirikolonimikroorganismedarilingkungan(sebutkansumbernya)
Cirikoloni Koloni
(1) (2) (3)

LATIHAN2.ISOLASIBAKTERIDENGANMETODECAWANGORES

Bahandanalat :
- Suspensi(bahan)yang mengandungbakteri
- MediumNutrientAgar
- Jarum inokulasi, lampu spiritus, kertas pembungkus,
labelCarakerja:
1. Sterilisasikanmejakerjadenganalkohol70%.
2. Buat medium lempeng agar dengan menuangkan media agar yang tengah mencair
padacawan petristeril.Biarkan hinggadingindanmemadat.
3. Sterilkan jarum inokulasi pada lampu spiritus sampai pijar, kemudian dinginkan dalam
alkoholatau sentuhkanpadapermukaanagar.
4. Ambilsuspensibakteridenganjarumsteriltersebutsecaraaseptis,goreskanpadapermukaan agar
lempeng kemudian tutuplah kembali cawan petri tersebut. Beri label danbungkus kembali
cawan petri tersebut (pada posisi terbalik). Inkubasikan selama 24 – 48 jampadasuhuruang.
5. Amatikoloniyangtumbuhdancatatdalamtabelpengamatan.

LATIHAN3.ISOLASIBAKTERIDENGANMETODECAWAN TUANG

Bahandanalat :
- Suspensibahanyangmengandungbakterimis,eskelapa,susu,dll.
- NutrientAgar
- Cawanpetri,pipet,lampuspiritus,alkoholdalambotolsemprot
Carakerja:
1. Siapkansuspensibahanyangmengandungbakteri
2. Cairkannutrientagardenganmendidihkannyadalam penangasairdanbiarkan
hinggasuhunyasekitar50oC
3. Masukkan1-2osesuspensibakterisecaraaseptiskedalamcawanpetristeril.
4. Tuangkanmediumnutrientagarcair(40–
50oC)kedalamcawanpetriyangtelahberisisuspensibakteri.
5. Tutupkembalicawanpetridanratakandenganmenggesernyadiatasmejasearahangkadelapan.
6. Biarkanhinggaagarmemadat.Bungkuscawanpetridalamkeadaanterbalik.
7. Inkubasikanpadasuhuruangselama24–48jam.
 .
Gambar. Teknik cawan tuang dan cawan gores
 Gambar4.Metodegoresanuntukmendapatkankoloniterpisah

CARAMEMBUATGORESANDANMEMINDAHKANBIAKAN

Untukmemindahkanbiakandilakukanlangkah-langkahsebagaiberikut:
1. BersihkanEnt-Kastdenganalkohol70%,ataudapatjugadenganmenggunakandesinfektan.
2. Lingkungan kerja harus tenang dan bebas angin. Nafas sedapat
mungkindihembuskanmenjauhitabungbiakanyang akandipindahkan.
3. Periksakembaliapakahsegalasesuatunyasudahdisiapkan.

Gambar2.Caramembukatutupcawanpetriselamapenggoresan.Bukalahsedikittutupcawanpetri,
namun tutup cawan tersebut harus tetap terletak di atas cawan. Dengan
demikianmediumsterildalamcawanterlindungdaribakteriyangberasaldariudara.
Gambar6.Caramemindahkanbakteridarimediumlempengagar

1.Caramemegangtabung
Peganglahtabungyangberisibiakanmikro-
organisme(a)dantabungmediumbaru(b)ditangankiri.P
eganglahjaruminokulasidengantangankanan.

2.Membukakapas
Bukakeduatabungbiakandenganmelepas
sumbatkapas,denganmenggunakantangankanan.Pan
askanmuluttabungdengancarsmelewatkandiatasnyal
aapisebanyak2X.Hendaknyamuluttabungyangberisim
edi-umbaru dipegang dengan posisi agak
condongt erhad apmejakerja,untukmengurang
ikontaminasiterhadapudara.

3.Meman as kan JarumInku lasi

P anaskanjaruminoku lasi sampai p i
jar.Dinginkandenganmenyentuhkannyapadapermuk
aannya

4.Mengambilbiakan
Pindahkanbiakandenganmengambilsedi-
kitbakteridaripermukaanmediumtabung(a),danlangs
ungsentuhkankepermukaanmediumtabung(b).Ja
nganmenekanterlalukeras,karenaberat
jaruminokulasisudahcukup untuk

5. Memanaskan
Panaskanmulut tabung seperti pada waktu
membukanya.Tutupkembalidengansum-
batkapas.Bakarjaruminokulasisampaipijardanletakka
ndi tempatnya.
4. TEKNIKPEWARNAANBAKTERI

Bakterimerupakanmikrobauniseluler,yangmempunyai3bentukdasaryaitu,bulatsepertibola (coc
cus),batang(bacillus),silindrisdanlengkung(spiral).
Untukmelihatstrukturselbakteri denganseksama,diperlukansuatupewarnaan.Biasanya
pewarna yang digunakan disebut pewarna bakteri. Fungsi pewarnaan bakteri terutamamemberi
warnapadasel ataubagian-bagiannya,sehinggamenambahkontras dantampaklebihjelas. Sel-sel bakteri
yang tidak diwarnai pada umumnya sukar diamati dengan mikroskop
cahayabiasa,karenasitoplasmaselmempunyaiindeksbiasyanghampirsamadenganindeksbiaslingkungann
yayangbersifat cair(Hadioetomo, 1990).
Pewarna bakteri adalah senyawa organik yang terdiri dari gugusan kromofor dan
gugusanauksokrom yang terikat dalam suatu cincin benzena. Gugusan kromofor yang memberikan
warnapadamolekulpewarna,dangugusanauksokromyangmemberikandisosiasielektrolitmolekulpewarna
sehinggalebihmullah bereaksi. Adaduamacampewarna
berdasarkanmuatanlistrikpewarna:PewarnaBasadanPewarnaAsam.Pewarnabasamengandung
kromoforberupakation (muatan positif), seperti biru metilen dan safranin. Pewarna asam
mengandung kromoforberupaanion (muatan negatif), sepertieosin,fukhsin,dan merah kongo.
Mekanisme pewarnaan bakteri terdiri daripengikatan
kimiadanpengikatanfisika.Mekanisme pengikatankimia berdasarkan reaksi gugusan asam pewarna
dengan gugusan
basakomponensel,atausebaliknya.Pengikatanfisikaberdasarkanprosesabsorbsipewarnapadakomponen
sel(Jutono etal.1976).

Pewarnaanbakteridiperlukanbeberapafaktor,yaitu
1. Fiksasi.
Sebelumbakteri diwarnaharesdilakukanf iksasi lebih dahulu. Yaitu dengancara
fisik (pemanasan atau freeze drying), atau dapat juga dilakukan fiksasi dengan
menggunakanagensiakimia.
Fungsifiksasi ialah:(1)Mencegahmengkerutnya globula-globula protein sel;
(2)Mempertinggisifatreaktifgugusan-gugusankarboksilat,aminoprimer,sulfihidril;(3)Meru-bahafinitas
pewarna bakteri; (4) Mencegah terjadinya otolisis sel; (5) Dapat membunuh bakteri secaracepat
dengan tidak menyebabkan perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya; (6)
Melekatkanbakteridiatasgelas benda;(7) Membuat sel-sellebih kuat(keras).
Carafiksasiyangpalingbanyakdigunakandalampewarnaanbakteriialahdenganmembuat lapisan
suspensi bakteri di atas gelas benda, kemudian dikering-anginkan dan dilakukanbeberapakalidiatas
apilampuSpiritus.
Pada pewarnaan biologi lainnya dapat digunakan agensia -agensia fiksasi
kimia(campuran asam cuka dengan asampikrat,alkoholdengan aseton, d1l).

2. Substrat.
Tiappewarnabakteribasaataupewarnabakteriasamdapatbereaksidengankonstituen-
konstituentertentu.Olehsebabitusubstratorganik(lipids-lipids,protein-protein,asam-asamnukleat dan
karbohidrat) juga akan mempengaruhi pewarnaan biologi. Sehingga dapat dibedakan sel-sel yang: (1)
basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat- pewarna bakteri basa; (2) asidofil atauoksifil,yaitusel-
selyangdapatmengikatpewarnabakteriasam;(3)sudanolfil,yaitusel-
selyangdapatmengikatpewarnabakteri-pewarnabakteriyangdapatlarutdalam minyak.

3. IntensifikasiPewarnaan.
Dapatdilakukan beberapacara,antara lain dengan mempertinggikadar pewarna bakteriatau
menambahsuatumordan.

4. Pelunturanpewarnabakteri(Decolorizer).
Decolorizerdigunakanterutamauntukmendapatkankontrasyangbalkpadabayanganmikroskop.
Pada umumnyasel-sel yangsukar untuk dipewarna bakteri akan lebih sukar untukdidekolorisa-si
(misalnya pada pewamaan acid fast pada Mycobacterium). Sebaliknya sel-sel yangmudah
diwarnaakanlebihmudahpula didekolorisasi.
Jenis-jenispeluntur pewarnabakteriantaralain:
(1) Pelunturpewarnabakteriyanglemah(alkohol,air,minyakcengkeh,asetondangliserin).
(2) Pelunturpewarnabakteriasam(HCI,H2SO4,HNO3dancampuranasam-asamtersebutdengan alkohol)
(3) Pelunturpewarnabakteribasis(KOH,NaOH, sabundangaram-garambass).
(4) Garam-garamlogamberat(AgNO3,CUSO4,d1l).
(5) Garam-garamlogamringan(Na2SO4,MgSO4,d1l).

Beberapacarapewarnaan.
Beberapacarapewarnaanbakteriyangpentingialahpewarnaannegatif,pewarnaansederhana,pew
arnaangram,pewarnaanacid fast (pewarnaanZiehlNeelsen),dan pewarnaanbagian-bagian selbakteri.
Latihan4.1PewarnaanNegatif.
Pewarnaannegatifmerupakancarapewarnaantidaklangsung,karenayangdiwarnabakteriadalahla
tarbelakangnya,sedangkanbakterinyasendiritidakmengalamipewamaan.Pewarnabakteriyangbanyakdig
unakandalampewarnaannegatifialahnigrosindantintscina.

Tujuan: Untukmempelajaricaramembuatpreparatbakteridenganlatarbelakanggelap,dan
mengamatibentuksertabesarselbakterisesungguhnya.

AlatdanBahan
 Biakanmumi
 Larutanpewarnabakteri
 Alkohol70%.
 Objectglassdancoverglass.
 Jarumose,batanggelas,pipetdanlampuspiritus.

Carakerja :
1. Bersihkanobjectglassdenganalkoholhinggabebaslemak,kemudianpanaskansekilasdiatasnyala
apispiritus, dinginkan.
2. Ambillahsuspensibiakanmurnidenganosesecaraaseptisdanletakkandiatasobjectglass.
3. Ambit larutan tints cina dengan batang gelas atau pipet, dan campurkan dengan
suspensibakteriyangadspadapermukaanobjectglasshinggameratadanmerupakanlapisanyangtipis
sekali, kemudiankering-anginkan.
4. Amati preparat dengan mikroskap dengan perbesaran kuat dengan minyak imersi. Sel-
selbakteriakan tampak transparandengan latar belakanghitam (gelap).
5. Gambarpreparatbakteridenganlatarbelakangdiarsir.

LATIHAN4.MEMPELAJARIBERBAGAITEKNIKPEWARNAANBAKTERI

Latihan4.2PewarnaanSederhana
Merupakancarapewarnaandenganmenggunakansatumacampewarnabakterisaja.Sebelumdiwa
rnasuspensidifiksasidahulu.Pewarnaaninidipakaiuntukmelihatbentuk-bentuk bakteri. Pewarna
bakteri yang digunakan ialah methylen blue, gentians violet, basicfuchsinatausafranin.

Tujuan: Untukmempelajaricarapewarnaanbateddengansatupewarnabakteriwarns
(methylenblue),danmengamatisifatsetyangkontrasdengansekelilingnya.

AlatdanBahan
 Biakanmurni.
 Larutanpewarnabakterimethylenbluedanalkohol70%.
 Objectglassdanpenutupnya.
 Jarumosedan lampuspiritus.
 Mikroskop.
 
CaraKerja:
Menyiapkanpewarnabakteri.
LarutanpewarnabakteriLoffermethylenblue
LarutanA methylenblue 0,3gr
Alkohol95% 30ml
LarutanB KOH0,01% 100 MI
campurkanlarutanAdanBhinggahomogen.
Pewarnaan.
1. Bersihkanobjekglassdenganalkoholhinggabebaslemak,panaskansekilasdiatasnyalalampu spiritus.
2. Ambilsecaraaseptis1osesuspensibakteri,danratakandiatasobjectglassseluas1cm2,kemudian kering-
anginkanpreparatapusantersebut.
3. Setelahkeringpreparatlaludifiksasidengancaramemanaskansekilasdiatasnyalaapispiritus6-7
kalidandinginkan.
4. Teteskanpadaapusanlarutanpewamabakteri,diamkan1-2menit,kemudiancucidenganairmengalir
sampaisisa-sisapewama bakteritercuciselUruhnya.
5. Selanjutnyapreparatdikering-anginkan.
6. Amatidibawahmikroskopdenganpembesarankuat.Sel-selbakteriakantampakberwarnabiru
denganlatarbelakangterang.
7. Gambarbentuk-bentukbakteri.

Latihan4.3.PewarnaanGram.
Pewarnaaninimula-
muladikembangkanolehahlihistologiCHRISTIANGRAM(1884),yangkemudiandikembangkanolehahlilain
.
Pewarnaangrammeliputi4tingkatan,yaitu:
1. Pemberianpewarnabakteriutama(larutan crystalviolet,yangberwarnaungu).
2. Pengintensifanpewarnabakteriutamadenganmenambahkanlarutanmordan.
3. Pencucian(dekolorisasi)denganlarutanalkohol.
4. Pemberianpewarnabakteripenutup(pewarnabakterilawan),denganlarutan safraninyangberwarname
rah.

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan differensial, karena dapat membedakan bakteri

yangbersifat grampositifdangram negatif.
a. Bakterigrampositif,ialahbakteriyangmengikatpewarnabakteriutamadengankuat,sehinggatidakdap
atdilunturkandantidakdapat diwarnailagiolehpewarnabakterilawan.
b. Bakteri gram negatif,ialahbateri yang kemampuanmengikat pewarna bakteri
utamatidakkuat,sehinggadapatdilunturkanolehpeluntur,dandapatdiwarnaiolehpewarnabakterilawa
n. Selain itu ada pula bakteri yang bersifatgram variabel. Bakteri-bakteri ini
mempunyaisifatintermedierantaragrampositifdannegatif.Sehinggakadang-
kadangbersifatgrampositif,kadang-kadangbersifatnegatif.

Perbedaansifatbateritidakmutlaktegas
danspesifik,tetapimasihtergantungbeberapafaktoryangmenyebabkanvariasidalam
pewarnaangram,yaitu:
1. Perubahankeasaman,apabilapHturunkemungkinanbakterigrampositifdapatberubahmenjadigramn
egatif, demikian pula sebaliknya.
2. Penyimpangan cars pewarnaan, misalnya pencucian yang terlalu lama, dapat
menyebabkanbakteri-bakterigrampositif memberikanhasilgramnegatif.
3. Faktor medium jugamempengaruhi. Bakteri grampositif lemah apabila terlalu
lamaditumbuhkandalammediumyangmengandungbahanyangmudahdifermentasi,dapatberubah
menjadigramnegatif.
4. Umur bakteri, bakteri-bakteri gram positif yang terlalu tu gakan kehilangan nutrisi,
sehinggadapatberubahmenjadigramnegatif.
5. Perlakuankhusus,bakteri grampositifyangbagian-bagian selnya(jenis-
jenislemak,karbohidrat,protein)dihilangkandenganmelarutkandalamairpan
g
s,eterataularutanribonuklease,dapatberubahmenjadi
gramnegatif.BakterigramnegatifapabiladitambahdenganlarutanpekatDNAdapatberubahmenjadigra
mpositif,misalnya Escherichiacoll.
Tujuan:

Untukmempelajaricarapewarnaangramdanmengamatisifatdanbentukbakteriterhadap
pewarnaangram.

AlatdanBahan :
 BiakanMurni.
 LarutanpewarnabakteriGram.
1. GramA:LarutanpewarnabakteriHucker'sCrystalViolet
2. GramB:LarutanMordanLugol'sIodine.
3. GramCLarutanpeluntur(Aceton-Alkohoo.
4. GramDLarutanpewarnabakterisafranin.
 Alkohol70%.
 Objectglass,lampuspiritusdanjarumose.
 Mikroskop.

CaraKerja:
Menyiapkanpewarnabakteri.
Gram A:LarutanHucker'scrystalviolet.
LarutanA :CrystalViolet 2gram
Alkohol95%20ml.
LarutanB :AmoniumOksalat 0,8gram.
Aquadest 80
ml.CampurkanlarutanA danBtersebut.
Gram B:LarutanMordanLugol's Iodine.
Iodine 1gram.
KaliumIodine(KJ) 2gram.
Aquadest 300mi.
CampurkanIodinedanKJdalammortardanhaluskan.Tambahkanaquadestsedikitdemisedikitsa
mpaihabis (300 mi).
Gram C:LarutanPencuci.
Alkohol-Aceton:Alkohol95% 70ml.
Aceton 30ml.
GramD:Larutanpewarnabakterisafranin.
Safranin 0,5ml.
Alkohol95% 100ml.
Aquadest 100MI.
Larutkansafranindalamalkohol,tambahaquadestsampaimencapai100ml.

Pewarnaan.
1. Bersihkanobjectglasdenganalkohol70%,ambitdenganjarumosesuspensibakterikemudian
ratakan.
2. TeteskanlarutanGramAsebanyak2-3tetespadaapusanbakteri,kamudianbiarkanselama1
menit.
3. Cucidenganairyangmengalir,kemudiankering-anginkanhinggakering,ataukeringkan
dengankertasisapsecara hati-hati.
4. TeteskandengangramB,biarkanselama1menit,cucidenganairmengalir,angin-anginkan
hingga kering.
5. CucidenganGramC(larutanpeluntur)selama30detik,cucidenganairmengalir,angin-anginkan
hingga kering.
6. TeteskanlarutangramD(larutanpewarnabakteripenutup),biarkanselama2menit,kemudian
cucidenganair mengalirdankeringkan.
7. Amatidibawahmikroskopdenganperbesarankuat.
5. DETERMINASIBAKTERI

Untukidentifikasidandeterminasisuatubiakanmurnidarihasilisolasi,perludiamatimorfologikoloni,s
ertamorfologiindividual,sifat-sifatpewarnaan,sifatfisiologis(biokimia),partenogenesitas dan serologinya.
Untuk bakteri-bakteri tertentu kadang-kadang ticlak dipedukanpengujian selengkapdiatas.
Pertumbuhanbakteridipengaruhijugsolehfaktorluar,antaralain:media,pHdantemperatur. Oleh
karena itu bakteri yang memiliki morfologi yang sama, kemungkinan memilikikebutuhan
nutrisidanekologiyangberbeda.

LATIHAN 5.MORFOLOGIKOLONIBAKTERI

Tujuan:Mengenal bentuk-bentukkoloni bakteri dalamberbagai medium(mediumnutrien-agar

tegak, mediun nutrien-agar miring, mediun nutrien-cair dan medium nutrien-agar
lempeng).

Alat dan Bahan :

-Biakanmurniagar miring umur 24jam.
- Mediumnutrien-agartegak.
- Mediumnutrien-agarmiring.
- Mediumnutrien-cair.
- Petridishsteril.

CaraKerja:
1. Inokulasisecaraaseptisbiakanbakteridengancaratusukansampaikedalamtabung,dengan
jaruminokulasipadamediumnutrien-agartegak.
2. Inokulasisecaraaseptisbiakanbakteridengancaragoresanlurus,denganjaruminokulasipadamediumn
utrien-agarmiring.
3. Mediumnutrien-cairdiinokulasisecaraaseptisdenganbiakanbakterimemakaiose.
4. Buatlahbiakanbakteripadamediumnutrien-agarsecarataburan(lihattehnikisolasipadapraktikum
terdahulu).
5. Inkubasiselaam48jam,ataulebihpadasuhukamar,amatidangambar.
6. Carapengamatan:

a. Mediumnutrien-
agartegak.Gambardanberiketerangantentang
Pertumbuhan :Merataatauticlak;pertumbuhannyabalkpadabagianpermukaan,ataubagian
dasar.
Bentukpermukaanpadabekastusukan.
:Filiform,echinulate,bead,villous,rhizoid,arborescent

b. Mediumnutrien-agarmiring.
Gambar dan beri keterangan
tentangPertumbuhan : Tipis, sedang, lebat,
tidak ada.Bentukpermukaan
padabekasgoresan.
:Filiform,echinulate,beaded,spreading,arborescent,rhizoid,plumose.
Elevasi :Flat,effuse,raised,convex.
Kilat(luster) :Mengkilat,tidakmengkilat,cretaceous.
Topograft :Licin,tidakteratur,permukaannyabergelombang,contoured,wrinkled,verr
ucose.
Warna(chromogenesis):
Merah,kuning,hijau,coklat,flurerescent.
Ciri-cirioptik :Opaque,translucent,opalescent,iridescent.
Bau :Tidakberbau,berbauseperti
Konsistensi :slimy,butyrous,viscid,membranous,britle.
 Warnamedium:Menjadiabu-abu,coklat,merah,biru,hijau,tidaktarjadiperubahanwarna.

c. Mediumnutrien-cair.
Gambar dan beri keterangan-
keteranganPertumbuhandanpermukaan:
Ring,pellicle,flocullent,membranous,tidakmembentukselaput.
Kekeruhan :Sedikit,sedang,lebat.
Bau :Tidakberbau,berbauseperti
Endapan :Kompak,bentukdanukurantidaktertentu,granuler(butir-butir),
flaky(berlapis-lapis),kental;banyaksekali,sedikit,tidakadaendapan.

d. Mediumnutrien-agarsecarataburan.
Gambardanberiketerangantentang:
Pertumbuhan :Pertumbuhankolonidipermukaanataudibawahpermukaanmedium
Benyukkoloni:Punctiform,circular,filamentous,irregular,curled,amoeboid,myceloid,rhyzoid.
Permukaannya :Licin, kasar, membentuk lingkaran-lingkaran yang konsentris, Radiate
(sepertisisir yangradien).
Elevasi :Flat,effuse,raised,convex,umbonate.
Bentuktepi :Entired,undulate,lobate,erose,filamentous,curlet.
Bentukstrukturdalam:
Amorf,butir-butirhalusataukasar,sepertifilamen, curled,konsentris.

HasilPengamatan:
a.Mediumnutrien-agartegak.
Pertumbuhan:……………….…………………. ……..
Bentukpermukaanpadabekastusukan:………………

b.Mediumnutrien-agarmiring.
Pertumbuhan:...............................…………………..
Bentukpermukaanpadabekasgoresan:………………
Elevasi:…………………….....................................
Kilat(luster):…………………………………………..
Topografi:………………………………………………
Warna(chromogenesis):……………………………..
Ciri-cirioptic:………………………………………….
Bau:…………………………………………………….
Konsistensi:…………………………………………….
Warnsmedium:………………………………………..

c. Mediumnutrien-cair.
Pertumbuhandanpermukaan
Kekeruhan:……………………………………………
Bau:…………………………………………………..
Endapan:……………………………………………..

d.Mediumnutrien agarberlempeng
Pertumbuhan:………………………………………..
Benyukkoloni:………………………………………
Permukaannya: ……………………………………
Elevasi:………………………………………………
Bentuktepi:………………………………………….
Bentukstrukturdalam:……………………………..
ARTIISTILAH-ISTILAH

Amoeboid sepertiamoeba.
Arborescent menyerupaipohonyangbercabang-cabang.
Beaded sepertirantainmutiara(butir-butir)sepanjangbekasinokulasi.
Brittle pertumbuhanyangkeyingdanmudahpecah(getas,rapuh)jikadisentuhose.
Butyrous konsistensibakteriyangmenyerupaimentega. Chromogenesis
pembentukansenyawa-
senyawayangberwarnaolehmikrobia.Contoured
permukaanyangbergelombangsepertipetsrelief.
Convex cembung.
Crateriform pencairanmediumgelatinberbentukmenyerupaipiring.
Cuneate sepertibaji.
Curled keriting, berkerut,sepertirantai sejajaryang bergelombang. Echinulate
pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi bergerigi atau berbintik-
bintik.Effuse pertumbuhantipis, biasanyamerata.
Entire rata.
Erose sepertipotongan-potonganyangtidakteratur.
Filamentous bentukmenyerupaibenang-benang.
Filiform pertumbuhansepanjangbekasinokulasimerata.
Flat rata,datar.
Flaky endapanyangterdiddarilapisan-lapisan.
Flocculent bahan-bahanyang terapungdenganberbagaiukurandanbentuk.
Fluorescent berwarna jika kena sinar atau pantulan
sinar.infundibuliform

bentukmenyerupaicerobongataukerucutterbalik. Lobate
 terdapatbentuk-bentuk sepertitelinga.
Membranous pertumbuhantipismenyerupaimembran.
Myceloid sepertipertumbuhanjamurdenganbenang-benangradier.
Napiform bentuk seperti bush lobak
(wortel).Opalescent putih seperti susu, menyerupai
bate opal.Opaque tidak dapatditembuscahaya.
Papillate bentuk cembung dengan tonjolan (bintil)
tumpul.Pellicle

pertumbuhanpadapermukaanmediumcair(selaput). Plumose
pertumbuhan menyerupaibulu.
Pulvinate sepertibantal.
Punctiform kecilsekali(sepertititik)tetapimasihdapatdilihatdenganmatsbiasa,diameter
kurangdari1 mm.
Raised pertumbuhantebaldengantepiyangkasar.
Rhizoid pertumbuhan dengan cabang-cabang tidak teratur atau sepedi susunan
akar.Ring pertumbuhan pada tepi permukaan medium-cair melekat pada gelas (spt
cincin).Rugose berkerut,bedipat.
Sacpewamabakterie :pencairanpadamediumgelatindenganbentuksepertikantongpanjang,tabung
atausilinder.
Slimy seperblendir.
Spreading pertumbuhan merata beberapa mm disekitar garis (bekas)
inokulasi.Stratiform

pencairanpadamediumgelatin,secarahorizontaldimulaidarialasdenganBindingterns ke bawah.
Toruloid bentuksepertiTorula(Torulaadalahjeniskhamiryangtidakmembentukspora)
Translucent meneruskansinarmeskipunbendsdibawahnyatidaksemuaterlihatjelas.
Trunpewama bakterie: dengan bentuk ujung
persegi.Umbonate pertum.uhan tebal dengan tonjolan
tumpul.Undulate bergelombang.
Verrucose permukaantertutupbintik-bintik(kutil-kutil).
Villous bentukpendek,tebaldanpermukaansepertirambut.
Viscid suatupedumbuhanyang jikadisentuhoseakanmenunjukkangejalaspt benang.

Gambar7.Bentukbentukkoloni.

1.Circulair. 2.Irregulair 3.Amoebid 4.Rhizoid

5.Filamentous 6.Curled 7.Myceloid 8.Toruloid
 Gambar8.Bentukelevasi,tepidanstrukturdalamkolonibakteri
A.Elevasi B.Tepi C.StrukturdalamT
1. Effuse 1. Entire ransparentTra
2. Lowconvex 2. Erase nslucentOpaq
3. Raised 3. Crenate ueSmooth
4. Convex 4. Undulate Finely
5. Convexpapillate 5. Lobate granularCoarsely
6. Convexrugose 6. Ciliate granular
7. Raisedwithconcave 7. Fimbriate Want' enterlaced
8. Umbonate 8. Lacerate bevelededge
9. Pulvinate 9. Ramose Filamentous
Arborescent

1 2 3 4

Gambar9.Bentukkolonimediumnutrien-agartegak
1. Filiform 2.Echinulate 3.Beaded
4.Villous 5.Rhizoid 6.Arborescent

Gambar10.Bentukkolonimediumnutrien-agarmiring.
1.Filiform 2.Echinulate 3.Effuse 4.Beaded
5.Spreading 6.Plumose 7.Rhizoid 8.Arborescent
6. PENGARUH FAKTOR
LINGKUNGANTERHADAPPERTUMBU
HANBAKTERI

Aktivitassuatumikrobadipengaruhiolehfaktor-faktorlingkunganatauunsur-unsurekologi.
Perubahan yang terjadi pada faktor-faktor tersebut dapat mengakibatkan perubahan
sifatmorfologidanfisiologimikroba.Beberapajenismikrobadapatmenyesuaikandiridenganlingkunganbaru,
sehinggamikrobayangdemikianmempunyaisifatsangatresistersterhadaplingkungan baru.

Faktor–faktorlingkunganmeliputifaktorabiotikdanfaktorbiotik
Faktor abioti'-, ialah faktor yang dapat mempengaruhi kehidupan yang bersifat fisika
dankimia. Diantara faktor-faktor tersebut ialah temperatur, pH, tekanan osmotik, pengeringan,
sinargelombang pendek, tegangan muka dan oligodinamika. Faktor biotik ialah faktor
yangdisebabkanadanyaasosiasiataukehidupanbersamamikroba,dapatdalambentuksimbiosis,sinergisme
, antibiosis dan sintropisme. Namun dalam praktikum di sini hanya dilakukan mengenaipengaruh sinar
gelombangpendek.

LATIHAN 6.EFEKSINARULTRAVIOLETTERHADAPPERTUMBUHANBAKTERI
Tujuan:Untukmengetahuipengaruhsinarultravioletterhadappenghambatanpertumbuhanbakteri.

Alatdanbahan :
Biakanmurnidalammediumnutrien-cairumur24jam.Medium
nutrien-agartegak.
Petridishsteril.
Kertastimah.

CaraKerja:
1. Panaskanmediumnutrienagartegak,inokulasikandengan1jarumosebiakanmurni,atau1osebahan
minumanyangtelahterkontaminasimikroba, kemudian gojog.
2. Selanjutnyatuangkankedalamcawanpetri -stedl,biarkanmembeku(metodecawantuang)
3. Letakkanpotongankertastimahdiatasmediumbiakantersebut.
4. Sinaribiakantersebutdengansinarultravioletselama3jamdalamkeadaanpetddishterbuka,didalamEnt
-Kast.
5. Ambitpotongankertastimahsecaraaseptic,kemudiantutupkembalipetridishtersebut.
6. Inkubasipadatemperatur370Cselama24jam.
7. Gambardanamatipertumbuhanbakteri.
7. DESINFEKSIDANDESINFEKTAN

Desinfeksiialahusahamemusnahkanmikrobadenganmenggunakanzat-zatkimiatertentu.
Istilahdesinfeksi dahuludipakai untukmenyatakan usahamemusnahkan
kuman(mikroba)patogensaja(Jutono, et.al.1973).
Zatkimiayangdipakaiuntukmendesinfeksidisebutdesinfektan.Usahadesinfeksidapat bersifat
sterilisasi sempurna, atau menghambat mikroba, hal tersebut tergantung pada
jenisdesinfektan,kadardesinfektan,lamanyakontakdesinfektandenganmikrobayangdiuji,danbahan
yangakandidesinfeksi.
Carapengujiankekuatan(days)desinfektanadabermacam-macam,tergantungpadasifat
daridesinfektan.

LATIHAN7.PENGARUHDESINFEKTANTERHADAPPERTUMBUHANBAKTERI
Tujuan :Untukmengetahuipengaruhzatkimia(desinfektan)terhadappertumbuhanbakteri,
dengan menggunakanpaperdisk.

Alatdan Bahan :
 Biakanbakteridalamnutrien-cairumur24jam.
 4tabungmediumnutrien-agartegak10cc.
 Larutanalkohol60%.
 LarutanHgC120,1%.
 Larutanmerkurokhrom3%.
 LarutanIodine(yodium)10%.
 Ekstraktanaman(daunbluntas,lengkuas,kunyit,teh,dII)
 Cawanpetri,dankertasfilter(kertassaring)yangberbentukbulat(pepperdisk)sterildengandiameter
0,5inci(1,25 mm).

CaraKerja:
1. Inokulasi1 ose biakanbakteri ke dalamtabungreaksi berisi mediumyangtelahdic
airkan,gojog,kemudiantuangkanke dalamcawan petristeril.
2. Setelahpadatdandinginletakkansecaraaseptis4kertasfilteryangmasing -masingtelahdicelupkan
dalamlarutam alkohol60%, HgC120,1%, merkurokhrom 3% dan yodium10%,larutan daun teh
30% di atas medium agar (jarak kertas filter paling sedikit 10 mm dari tepipetridish).
3. Inkubasipadatemperatur370Cselama24-48jam.
4. Amatidangambarhasilnya,ukurzonapenghambatan(zonajemih)padamasing -masingbiakan
bakteridanbandingkan pengaruhmasing-masingdesinfektan.
8. MORFOLOGIKAPANGDANKHAMIR

Kapang merupakan organisme eukariot yang memiliki dinding sel terbuat dari
kitin.Sifatnyakuat,fleksibel,danmengandungpolisakarida.Perbedaanfungidengantumbuhanadalahfungi
tidakmemiliki klorofildan tidak berfotosintesisHabitat kapangadalah tempat yang memiliki kadar
airtinggi dan lembab.Hal tersebut sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan generatif
fungi.Badanvegetatif fungi disebut talus. Kapang merupakan cendawan yang memiliki banyak sel
(multiseluler)yang membentuk benang-benang yang disebut hifa. Kumpulan hifa disebut
miseliumMorfologi tiaptalus berbeda-beda sesuai dengan jenis fungi.Khamir memiliki susunan talus
yang kecil, globular,dan terdiri atas satu sel.Kapang memilki talus yang panjang, besar, dan
bercabang disebut jugahifa.Hifa terbagi menjadi dua, yaitu septat dan aseptat (Bauman 2004: 356--
357).Sedangkankhamir adalah cendawan yang bersel tunggal (uniseluler). Morfologi khamir lebih
sederhanadibandingkan kapang dan ukurannya lebih besar dari sel bakteri. Pengamatan morfologi
kapang dankhamir secara mikroskopik diperlukan jika kita ingin mengidentifikasi mikroba
tersebut.Identifikasidilakukandengan antaralain dengan caramengamatihifadanorganreproduktifnya.
Tujuan:Mengamatimorfologikapang dankhamir

MorfologiKapang
Bahandanalat :
BiakanmurniAspergillusspdanRhizopussp.

Larutan Lactophenol Cotton

BlueJarum inokulasi

Alkohol70%

Carakerja:
1. Gelasobyekdibersihkandengan alkohol70%hinggabebaslemak.
2. TeteskansedikitlarutanLactophenolCottonBluediataspermukaangelasobyek.
3. Ambilsedikitkolonidaribiakantersebutdenganjaruminokulasi.
4. Letakkan dalam tetesan lactophenol cotton bluedan uraikan dengan jarum preparat secara hati-
hati.
5. Usahakanseluruhmiselliumbasahterkenalactophenol.
6. Tutupdengankacapenutup,usahakantidakadagelembung udaradalampreparat.
7. Bersihkankelebihanlactophenoldengankertashisap.
8. Amatidenganmikroskop,denganperbesaran10x,kemudian40x.
9. Gambarmorfologikapangtersebut.

MorfologiKhamir.
Bahandanalat :
BiakanmurnikhamirSaccharomycescerevisiae
Larutanmethylenblue
Gelasobyekdankacapenutup
Jarumose,alkohol70%danpembakarspiritus.

Carakerja:
1. Bersihkankacaobyekdankacapenutupdenganalkoholhinggabebaslemak.
2. Teteskansedikitlarutanmethylenbluepadagelasobyek.
3. Ambilsedikitbiakanmurnikhamirdenganjarumose.
4. Letakkandalamtetesanmethylenbluedanditutupdengankacapenutup.
5. Amatidenganmikroskopdenganperbesaran10xkemudian40x
6. Gambarmorfologikhamirtersebut.
PENGAMATANMORFOLOGIKAPANGSECARA HENRICPSSLIDECULTURE

Tujuan:Untukmengamatimorfologikapangsecaramikroskopismelaluiteknik Henrici'sSlideCulture.

Bahan :
 Biakankapangdalammediumtauge-agar,sabourodsagar,atauYMAumur3-4hari.
 Mediumtaugeagar,sabourodsagar,atauYMA.
 Lilin(ataudapat menggunakan2buahbatangkorekapi),danvaselin
 Cawanpetristeril
 Kacaobjekdan kacapenutup
 Pipetkapilersteril

CaraKerja:
1.Bersihkankacapenutupdenganalkohol,kemudianpanggangdiatasnyalalampuspiritus.Pada
waktumasihpanaskedua tepi yangberlawanan diulas dengan denganlilinselebar2mm dan tebalnya
kuranglebih 1 mm. (Jika tidak ada lilin dapat menggunakan 2 buah batangkorek api).
3. Bersihkan kaca objek dengan alkohol, kemudian dipanggang agak lama diatas nyala
lampuspiritus.
4. Kacaobjek tersebut dibiarkan sampai agakdingin (tetapi masihcukup panas
untukmenyalakan lilin), kemudian kaca penutup yang telah mengandung lilin diletakkan di atas
kacaobjek, dengan bagian yangmengandunglilin diataskacaobjek (Gambar 11).
5. Cairkanmediumagardandinginkansampaitemperatur40 0–450C,kemudianinokulasimedium
agardengan spora-porakapangyangakan diamati.
6. Kemudian ambilah medium tersebut (pada point 5) secara aseptis dengan pipet kapiler
steril,selanjutnya teteskan pada tepi kaca penutup sampai medium mengisi setengah bagian
gelaspenutup(Gambar11).
7. Untukmencegahpenguapanmedium,bagiankacapenutupyangterbukadapatdiolesivaselin, atau
dapat pula dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah diberi kapas yang telahdibasahiaquades
steril.
8. Inkubasipadatemperaturkamar 36—48jam.
9. Amatidibawahmikroskopkapangpadakacaobjektersebutdenganperbesaranlemahkemudian
denganperbesarankuat.
10. Gambardanberiketeranganyanglengkap.

Catatan:
Jikamenggunakanbatangkorekapi,buangbagianatas(kepala)darikorekapi.Kemudianletakkan2
bushbatangkorekapi tersebut padakacaobjek,kemudianletakkankaca penutuptepat diataskeduabatang
korekapitadi.Selanjutnyapengerjaansamasepertipoint 5s/d10.

Gambar11.Henrici'sSlideCulture
PENGAMATANMAKROSKOPIKKAPANGDANKHAMIR
Tabel1.Hasilpengamatanmakroskopikkapang.
Karakteristik Rhizopusoryzae Aspergillusoryzae Penicilliumc
hrysogenum
Warna
Teksturkoloni
Zonasi
Radialfurrow
Exudatedrop
Reversecolony
Growingzone

Umurbiakan
Tabel2.Hasilpengamatanmakroskopikkhamir
Karakteristik Saccharomycescerevisiae
Warna
Tekstur
Permukaankoloni

Profil

Tepikoloni

Umurbiakan

B.PENGAMATANMIKROSKOPIKKAPANGDANKHAMIR

1. Pengamatanmikroskopikkapang
a.Namabiakan :..............................
Umurbiakan.....................................hari
Pewarnaan :
LaktofenolPerbesaran :
10x100
Keterangan : 1.
2.
3.
4.
5.
6.
b.Namabiakan :..............................
Umurbiakan.....................................hari
Pewarnaan :
LaktofenolPerbesaran :
10x100
Keterangan : 1.
2.
3.
4.
5.
c.Namabiakan:.....................................
Umurbiakan...........................................hari
Pewarnaan :
LaktofenolPerbesaran :10
x40
Keterangan : 1.
2.
3.
4.
5.
6.
2. Pengamatanmikroskopikkhamir
Namabiakan :.......................................
Umurbiakan.........................................hari
Pewarnaan : Metilen
bluePerbesaran :10x100
Keterangan : 1.
2.
3.
9. PENGHITUNGANJUMLAHMIKROBA

Jumlah mikroba yang ada di dalam suatu bahan sangat bervariasi tergantung komposisi
bahandan faktor lingkungan yang mempengaruhi. Penghitungan jumlah mikroba yang terdapat dalam
suatubahan dapatdilakukandenganbeberapacarayaitu;
1. HitunganLangsung
Penghitungan sel mikroba secara langsung dapat dilakukan dengan menggunakanruang hitung
atauHaemocytometer.Metode ini cepat pada proses pengerjaannya dan tidak memerlukan banyak
alat,tetapi memiliki kekurangan tidak dapat membedakan antara sel hidup dan sel mati, serta sulit
untukmenghitung sel yang berukuran sangat kecil. Jumlah sel yang terhitung dalam
haemacytometeradalah total sel yang ada dalam populasi. Ruang hitung tersebut terbagi dalam 25
kotak yang luasmaupun volumenya telah diketahui. Dengan menghitung jumlah sel mikroba yang
terdapat dalamkotak-kotaktersebutdanmengalikannya denganvolumenya, maka jumlahmikroba per
mililitercontoh dapatdiketahui.
2. HitunganTidakLangsung
Metode ini dapat digunakan untuk menghitung total sel baik yang hidup maupun yang mati,
atauhanyamenghitungselyanghidupsaja,tergantungmetodeyangdigunakan.
a. MenghitungKekeruhanSel
Perhitungan sel mikroba dilakukan dengan melihat kekeruhan (turbiditas) sel dengan
mengukurpersentasecahayayangmelewatilarutanyangdiperiksa.Alatyangdigunakanadalahspektrof
otometer.Persentasecahayayanglewatmerupakanperbandinganlangsungdarikonsentrasiselyangdi
nyatakandengan OD(OpticalDensity).
b. MenghitungBeratKeringSel
Suspensi sel yang akan diukurdisentrifuspada kecepatan tertentu. Endapan yang
diperolehselanjutnyadikeringkandanditimbang.
c. DenganHitunganCawan
Contoh yang akan diperiksa diencerkan sampai konsentrasi tertentu, kemudian diambil
sejumlahvolumetertentudaripengenceraninidanditanampadamediayangsesuai.Setelahdiinkubasika
n,dihitungkoloniyangtumbuhpadacawanpetriyangmemilikijumlahkoloni30-
300. Jumlah mikroba per mililiter sampel dapat diperoleh dengan mengalikan jumlah
kolonidengan jumlahcontohdan faktorpengenceranyangdigunakan.

Gambar12.Prosedurpembuatanseripengenceran
Gambar13.Ilustrasikerapatanpertumbuhanmikrobahasilpengenceran
10.UJIKUALITASAIRSECARAMIKROBIOLOGIS

METODEMOST PROBABLENUMBER(MPN)

Metode MPN digunakan sebagai uji kualitas air berdasarkan keberadaan dan jumlah
ambangmikroorganismepathogenyangterdapatdidalamnya.Metodeiniterdiriatasbeberapatahap,yaitu:

a. UjiPenduga(PresumtiveTest)
Alatdan bahan :
- Tigatabung reaksiberisitabung durhamdanmediumLactosaBrothganda10ml
- Enamtabungreaksiberisitabung durhamdanmediumLactosaBrothtunggal10ml
- Pipet ukur 10mldan 1mlsteril
- BunsenBurner
- Inkubator
- BotolsampelsterilC
araKerja:
1) Ambilsampelairdenganbotolsampelsterilsecaraaseptissebanyakkuranglebih500ml
2) Inokulasikan10mlsampelairmasing-masingkedalam3tabungmediumLactosaBrothganda10ml(seriI)
3) Inokulasikansatumililitersampelairmasing-masingkedalam3tabungmediumLactosaBrothTunggal5
ml(seriII)
4) Inokulasikan0,1 mlsampelairmasing-
masingkedalam3tabungmediumLactosaBrothTunggal5ml(seriIII)
5) Inkubasisemuamediumyang sudahdiinokulasisampelairpadasuhu35-37 0Cselama24jam
6) Catattabung-tabungpadasetiapseriyangmenunjukkanterbentuknyaasamdangas(reaksipositif)
7) Tabung-
tabungbiakanairsampelyangmenunjukkanreaksinegatif(belumterbentukgas)diinkubasilagipada
350Cselama 24jam.
8) Bilatabung-
tabungbiakanno(7)tetapnegatif,makahasilnyadianggapnegatif,tetapibilahasilnyapositifdilanjutkan
ke ujipenguat(confirmedtest)

b. UjiPenguat(ConfirmedTest)
Alat dan Bahan:
- Semuatabungreaksidariujipendugayanghasilnyapositif
- TabungreaksiberisitabungdurhamdanmediumBGLB10ml
- Inkubator
- Pipet ukur1mlsteril
- SejumlahcawanpetriberisimediumEndoAgar

CaraKerja:
1) Inokulasikan 0,1 ml biakan dari setiap tabung uji penduga yang positif masing-masing ke dalam
2medium BGLB
2) Inkubasikan satu seri BGLB yang telah diinokulasi pada suhu 35 0C dan satu seri yang lain
padasuhu 44,50Cselama 24-48 jam
3) Ambil satu ose biakan dari tabung BGLB yang menunjukkan reaksi positif, goreskan (streak)
padapermukaan media endo agar dalam cawan petri, inkubasikan pada suhu 35 0C-370C selama
24-48jam
4) Amati terbentuknya asam dan gas dalam media BGLB, dan catat tabung-tabung pada setiap
seriyangmenunjukkanhasilpositif
5) Amatiadanyakolonibakteriyangberwarnahijaumetalik(menunjukkankolonikoliform)

c. UjiPelengkap(CompletedTest)
Alat dan Bahan:
- MediumEndoAgaryangmenunjukkanadanyakoloniberwarnahijaumetalik(ujipositif)
- SejumlahtabungberisitabungdurhamdanmediumLactoseBrothtunggal
- Sejumlahtabungberisimediumnutrienagarmiring
- Gelasobyekdanjarumose
 - Cat
gramCaraKerja:
1) SetiapkoloniyangberwarnahijaumetalikpadasetiapseridiinokulasikandalammediumLactoseBroth
danNutrienAgarmiring
2) Inkubasikanbiakandalamsuhu35-370Cselama24jam
3) Amatiadanyaasamdan gas dalam mediumLactoseBroth,dan
catatsetiapkelompok/seritabungreaksiyangmenunjukkanujipositif
4) Lakukanpengecekangramdanpengecekanendosporadaribiakandalamtabungnutrienendoagar.
5) Amatibentukselsecaramikroskopis,bakterikoliformberbentukbatang,gramnegatifdantidakmembentu
k endospora(E.coli).
6) Cocokkanjumlahtabungyang positifdengandaftarindeksMPN.
 SampelAir

10ml 0,1ml

SERIII SERIIII
SERII LB5ml LB 5ml
LB 10ml
UjiPe
nduga

Inkubasi35-370C,24 jam

Dihasilkangasdanasam(UjiPe
ndugapositif)

BGLB
Endoagar

Inkubasi35-370C Inkubasi
44,50C, UjiPe
nguat
Selama24jam Adagas
danasam
(positif)
Kolonibagiantengah/sentralgelapd
anhijaumetalik(ujipositif)
 UjiPel
LB Nutrien Agar engkap
inkubasi370C,24jam Inkubasi370C,24jam

Ada gasdanasam adaE.coli

KonfirmasijumlahdengandaftarindeksMPN totalMPN