4.1.

Sperma Opossum yang berpasangan dapat terpisah selama kapasitasi

 Sperma yang berpasangan tersebut dapat terpisah akibat Motilitas hiperaktif yang terjadi
dalam kondisi kapasitasi. (dimana motilitas yang hiperaktif ini sebagai akibat dari
aktivasi CatSper oleh ion Ca2+)
 Hiperaktivasi meningkatkan gerakan flagella menjadi lebih kuat sehingga memfasilitasi
disosiasi.
 (Hal ini menunjukkan bahwa) motilitas hiperaktif memisahkan sperma secara mekanis.
 Terpisahnya sperma yang berpasangan juga dipengaruhi oleh kurangnya ion Ca2+.
(ikatan antara dua sperma menjadi lemah)

4.2. Peristiwa pensinyalan kapasitasi pada Opossum berbeda dengan mamalia eutherian.

pTyr (Protein Tyrosine Fosfatase)  mengatur stabilitas enzim dan protein dan sinyal
untuk proses kapasitasi.

 (Induksi kapasitasi mampu meningkatkan pTyr dalam sel sperma pada spesies eutherian
maupun Opossum.)
 Pada sperma eutherian (missal tikus), hilangnya Ca2+ dan meningkatnya Mg2+ secara
genetic dan farmakologis dapat meningkatkan perkembangan pTyr. Dengan kata lain, ion
Mg2+ disini memiliki peran yang mirip dengan ion Ca2+.
 Sedangkan Pada sperma Opposum, ion Ca2+ yang proses masuknya terhambat akan
menekan perkembangan pTyr, sehingga kapasitasi juga terhambat. Yang artinya, pada
sperma Opossum ini hanya dapat bereaksi dengan ion Ca2+.

4.3. Regulasi dan fungsi hiperaktivasi sperma yang berevolusi secara khas pada garis
keturunan mamalia

 Dalam eutherian dan marsupial (Opossum), Ca2+ akan mengaktivasi CatSper sehingga
memicu motilitas yang hiperaktif selama kapasitasi. Hal ini menunjukkan bahwa Ca2+
yang dimediasi saluran CatSper merupakan mekanisme molekuler yang terjadi secara
evolusioner untuk memicu motilitas hiperaktif. Motilitas hiperaktif ini sebagai suatu
adaptasi yang diperlukan oleh sperma tikus, hamster, maupun sperma manusia untuk
dapat bergerak secara efisien di media yang kental.
 Dalam monotremata (Echidna), aktivasi CatSper tidak terjadi dalam fase kapasitasi
melainkan pada fase fertilisasi. Hiperaktivasi sperma echidna hanya terjadi ketika adanya
kontak antara sperma dengan oosit. Hal ini menunjukkan bahwa perubahan motilitas
yang signifikan dirancang khusus untuk penetrasi telur (bukan untuk migrasi sperma).
Mengapa demikian? Karena di sekitar zona pellucida oosit echidna terdapat lapisan
tambahan dan mucoid, sehingga oosit tampak lebih tebal. Oleh karena itu, diperlukan
hiperaktivasi agar sperma mampu menembus zona pellucida secara efisien.
 Pengaktivan saluran CatSper oleh Ca2+ sehingga menghasilkan hiperaktivasi pada
sperma bisa dikatakan telah mengalami evolusi. Evolusi ini sebagai bentuk penyesuaian
sperma pada beberapa jenis mamalia yang telah disebutkan tadi, dimana pada eutherian
dan marsupial aktivasi CatSper terjadi pada fase kapasitasi karena sperma perlu motilitas
yang signifikan untuk melewati media yang kental. Sedangkan pada Echidna, aktivasi
CatSper terjadi pada fase fertilisasi karena sperma membutuhkan tenaga dan motilitas
yang signifikan untuk menembus zona pellucida yang tebal.