Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC adalah fase

gerak air dialirkan dengan pompa
melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke
datigum aliran fase gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam
kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen cairan
karena perbedaan kekuatan
interaksi
antara salut-salut terhadap fase
diam akan keluar dari kolom lebih
dahulu dan sebaliknya. Setiap
komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram (Lestari,
2014).
Zona campuran kemudian
digerakan dengan larutan suatu
cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media
porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing
komponen dari campuran
tersebut
akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang
“diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda
(differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu
yang berlainan, dan dengan
demikian terjadilah pemisahan
diantara komponen-komponen yang
ada (Hendayana, 2006).
Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar HPLC adalah fase
gerak air dialirkan dengan pompa
melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke
datigum aliran fase gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam
kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen cairan
karena perbedaan kekuatan
interaksi
antara salut-salut terhadap fase
diam akan keluar dari kolom lebih
dahulu dan sebaliknya. Setiap
komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram (Lestari,
2014).
Zona campuran kemudian
digerakan dengan larutan suatu
cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media
porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing
komponen dari campuran
tersebut
akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang
“diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda
(differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu
yang berlainan, dan dengan
demikian terjadilah pemisahan
diantara komponen-komponen yang
ada (Hendayana, 2006).
Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar HPLC adalah fase
gerak air dialirkan dengan pompa
melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke
datigum aliran fase gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam
kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen cairan
karena perbedaan kekuatan
interaksi
antara salut-salut terhadap fase
diam akan keluar dari kolom lebih
dahulu dan sebaliknya. Setiap
komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram (Lestari,
2014).
Zona campuran kemudian
digerakan dengan larutan suatu
cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media
porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing
komponen dari campuran
tersebut
akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang
“diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda
(differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu
yang berlainan, dan dengan
demikian terjadilah pemisahan
diantara komponen-komponen yang
ada (Hendayana, 2006).
Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar HPLC adalah fase
gerak air dialirkan dengan pompa
melalui kolom ke
detektor. Cuplikan dimasukkanke
datigum aliran fase gerak dengan
cara penyuntikan. Didalam
kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen cairan
karena perbedaan kekuatan
interaksi
antara salut-salut terhadap fase
diam akan keluar dari kolom lebih
dahulu dan sebaliknya. Setiap
komponen campuran yang keluar
dari kolom dideteksi oleh detektor
kemudian direkam dalam
bentuk kromatogram (Lestari,
2014).
Zona campuran kemudian
digerakan dengan larutan suatu
cairan atau gas yang bergerak
sebagai pembawa, melaui media
porus tersebut, yang berupa
partikel-partikel yang ”diam“ (tidak
bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing
komponen dari campuran
tersebut
akan terbagi (terdistribusi) secara
tidak merata antara alas yang
“diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya,
masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda
(differential migration) dan dengan
demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu
yang berlainan, dan dengan
demikian terjadilah pemisahan
diantara komponen-komponen yang
ada (Hendayana, 2006).
Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu campuran zat menggunakan fase gerak dan fase
diam, dimana pemisahan terjadi akibat adanya perbedaan daya adsorpsi, kelarutan, partisi,
ukuran moleul, ukuran ion dan tekanan uap pada komponen yang dibawa oleh fase gerak melaui
fase diam (Dong, 2006 ; Lux, 2004). Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat
cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair.
Sedangkan High performance liquid chromatography (HPLC ) atau yang sering disebut
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) mulai dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal
 tahun 1970-an merupakan pengembangan terkini dari kromatografi cair kolom klasik, dimana
pada KCKT ini terdapat pengembangan teknologi pada kolom, detektor yang lebih sensitif dan
peka serta kemajuan teknologi pada pompa bertekanan tinggi yang menyebabkan KCKT menjadi
suatu metode dengan sistem pemisahan zat yang cepat dan efisien (Johnson, 1991).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan fisiksuatu campuran zatzat kimia
(analit) yang berdasarkan pada perbedaan distribusi masingmasing komponen campuran yang
terpisah pada fase diam dibawah pengaruh fase gerak. Fase gerak dapat berupa gas atau zat cair
dan fasediam dapat berupa zat cair atau zat padat. Keunggulan metode ini dibanding metode
pemisahan lainnya terletak pada ketepatan analisis dan kepekaan yang tinggi serta cocok untuk
memisahkan senyawa-senyawa yang tidak tahan pada pemanasan. (Susanti dan Dachriyanus,
2017).
Keunggulan metoda ini dibanding metoda pemisahan lainnya terletak pada ketepatan analisis dan
kepekaan yang tinggi serta cocok untuk memisahkan senyawa-senyawa nonvolatile yang tidak
tahan pada pemanasan. Peningkatan kecepatan dan efisiensi pemisahannya terkait dengan
peningkatan performa kolomnya yang menggunakan kolom dengan ukuran dimensi dan partikel
yang jauh lebih kecil dari kolom yang dipakai pada kromatografi kolom konvensional, sehingga
agar fase gerak dapat mengalir pada kolom, fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Di
samping itu, kinerja tingginya dalam analisis didukung dengan adanya berbagai sistem deteksi
dengan kepekaan tinggi yang dapat diintegrasikan dengan sistem kromatografinya.
Jenis Jenis HPLC
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan
kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal
dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90%
kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus
hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas
yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak
yang berekor.
2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase
terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon- hidrokarbon non-
polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer
digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase
terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan
bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena
kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi
lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies
yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
3. Kromatografi penukar ion
HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu
fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling
luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan
dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
Prinsip Kerja HPLC
Prinsip dasar HPLC adalah fase gerak air dialirkan dengan pompa melalui kolom ke detektor.
Cuplikan dimasukkanke datigum aliran fase gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom
terjadi pemisahan komponen-komponen cairan karena perbedaan kekuatan interaksi antara salut-
salut terhadap fase diam akan keluar dari kolom lebih dahulu dan sebaliknya. Setiap komponen
campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk
kromatogram (Lestari, 2014).
Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan atau gas yang bergerak sebagai
pembawa, melaui media porus tersebut, yang berupa partikel-partikel yang ”diam“ (tidak bergerak,
statisiones). Sehingga akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi
(terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang “diam” dan cairan atau gas yang
membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan bergerak (bermigrasi) pada
kecepatan yang berbeda (differential migration) dan dengan demikian, akan sampai pada ujung
lain dari alas tersebut pada waktu yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan
diantara komponen-komponen yang ada (Hendayana, 2006).
Terdapat Beberapa Komponen Utama dalam HPLC
a. Pompa (Pump)
Fase gerak dalam HPLC adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa
yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant
displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan
pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur
(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk,
menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran
yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
b. Injektor (injector)
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum
dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran
dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak
dipengaruhi
b. Septum : Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi
Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 - 70 atmosfir Tetapi septum ini tidak
tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair kecil dari septum yang terkoyak (akibat
jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10
μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang
lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada
kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
c. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada
pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari
senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh
Snyder. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
 c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak
atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error.
Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair
dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
f. Reservoir fase gerak dan system treatment pelarut
Peralatan KCKT modern dilengkapi dengan satu atau beberapa reservoir pelarut yang terbuat dari
kaca atau stainless steel yang mampu memuat 200 sampai 1000 mL pelarut. Reservoir dilengkapi
dengan suatu alat degasser yang dapat menghilangkan gas terlarut pada fase gerak (biasanya
oksigen dan nitrogen) yang mengganggu analisis karena dapat membentuk gelembung pada
kolom dan system detector. Degasser terdiri dari suatu pompa vakum, system destilasi, alat
pemanas dan suatu system pengaduk pelarut
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara
keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh
polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
KCKT fase normal (fase diam KCKT lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk KCKT fase terbalik (fase
diam kurang polar dibanding fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut. Pemilihan fase gerak didasarkan pada kriteria berikut :
1. Viskositas.
Pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan tekanan yang lebih rendah dibandingkan dengan
pelarut dengan viskositas tinggi pada suatu kecepatan alir tertentu.
2. Transparansi terhadap UV J
ika detector yang digunakan adalah detector UV, maka fase gerak harus transparan secara
sempurna pada panjang gelombang yang digunakan
3. Indeks bias
Jika detector yang digunakan adalah detector indek bias, maka perbedaan indeks bias antara
pelarut dengan sampel harus besar.
4. Titik didih
Titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika eluat akan dilakukan pemrosesan lebih lanjut
supaya memudahkan dalam penguapannya. Di satu sisi, pelarut-pelarut dengan tekanan uap
yang tinggi (yang berarti titik didihnya tinggi) pada suhu kamar cendrung menimbulkan
gelembunggelembung uap dalam detektor
5. Kemurnian Tidak adanya senyawa lain yang mengganggu analisis
6. Lembam (inert)
Fase gerak tidak boleh bereaksi dengan campuran analit. Jika sampel yang dianalisis sangat peka
terhadap oksidasi, maka fase gerak dapat ditambah senyawa-senyawa antioksidan seperti 2, 6-di-
ter-buti-p-kresol (BHT) dengan konsentrasi 0,05%. BHT dapat dihilangkan secara cepat dari eluen
dengan penguapan, akan tetapi BHT menyerap di daerah UV di bawah 285 nm
akan menghasilkan puncak yang tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom. 
Lempeng teoritis (N) Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi. Menyatakan
jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada setiap saat yang dibawa oleh fase gerak
selama elusi. Dimana semakin besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien. 
Crawford Scientific, The Theory of HPLC Chromatographic Parameters. chromacademy diakses
tanggal 27 Juni 2019..
Dong, M. 2006. Modern HPLC for Practicing Scientist. Canada: A John Wiley & Sons, Inc. Hal. 1-
13.
Hendayana, Sumar., 2006, KIMIA PEMISAHAN Metode Kromatografi dan Elektroforensis Modern,
PT. Remaja Rosdakarya, Bandung.
Johnson, .E. dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terjemahan dari Basic Liquid
Chromatography, oleh Padmawinata K. ITB: Bandung. Hal 3-9.
Lestari, Wahyuni Sri. 2014. Validasi Metode Penetapan Kadar Aliskiren dalam Plasma darah
secara In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). UIN Syarif Hidayatullah:
Jakarta
Lux, P. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. Tersedia di
library.usu.ac/download/fmi pa/farmasi-effendy2 diakses pada 26 Juni 2019.
Susanti , M. , & Dachriyanus. 2017. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Penerbit Andalas University
Pess: Padang